Môi trường nuôi cấy thực vật

Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật vật Tạ Ngọc Ly Tạ Ngọc Ly Các thành phần chính Các thành phần chính - Đường:sucrose và glucose, 2% - Các muối khoáng đa lượng - Các muối khoáng vi lượng - Các vitamin - Các chất sinh trưởng Chức năng của các khoáng chính Chức năng của các khoáng chính  Nitrogen Nitrogen – ảnh hưởng chỉ số phát triển của – ảnh hưởng chỉ số phát triển của cây, đặc biệt trong quá trình phát triển của cây, đặc biệt trong quá trình phát triển của nhân, protein, diệp lục, amino acid và các nhân, protein, diệp lục, amino acid và các hocmon hocmon . .  Phosphorus Phosphorus – có nhiều trong đỉnh sinh – có nhiều trong đỉnh sinh trưởng, các mô phát triển nhanh, quan trọng trưởng, các mô phát triển nhanh, quan trọng trong quá trình quang hợp, hô hấp. trong quá trình quang hợp, hô hấp.  Potassium Potassium – cần thiết cho phân chia tế bào, – cần thiết cho phân chia tế bào, mô phân sinh, tham gia chu trình C, Protein mô phân sinh, tham gia chu trình C, Protein và quang tổng hợp và quang tổng hợp . .  Calcium Calcium – – tham gia biệt hóa thành tế bào, phát triển lá tham gia biệt hóa thành tế bào, phát triển lá và rễ. Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids và rễ. Đặc biệt trong chuyển hóa đường, amino acids  Iron Iron – tham gia trong qt hô hấp, tổng hợp chlorophin và quang tự – tham gia trong qt hô hấp, tổng hợp chlorophin và quang tự dưỡng. Cây hấp thu tốt sắt ở dạng FeNaEDTA dưỡng. Cây hấp thu tốt sắt ở dạng FeNaEDTA . .  Magnesium – Magnesium – tham gia qt quang tự dưỡng và hệ thống tham gia qt quang tự dưỡng và hệ thống hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và hô hấp, hoạt hóa photphate và vận chuyển photphate và tinh bột. tinh bột.  Sulfur Sulfur – Tham gia trong chuyển hóa của ti thể và – Tham gia trong chuyển hóa của ti thể và hệ thống quang tông hợp, thành phần của hệ thống quang tông hợp, thành phần của aminoacids và enzimes aminoacids và enzimes . .  Manganese Manganese – tạo mối quan hệ giữa các enzymes – tạo mối quan hệ giữa các enzymes và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ quang tổng hợp và và hocmon tăng tưởng, hỗ trợ quang tổng hợp và hô hấp hô hấp . .  Molybdenum Molybdenum – tham gia trong enzime phân hủy nitrate và – tham gia trong enzime phân hủy nitrate và amonium. Trợ giúp trong qt chuyển hợp chất photphat vô amonium. Trợ giúp trong qt chuyển hợp chất photphat vô cơ sang phot phat hữu cơ. cơ sang phot phat hữu cơ.  Zinc – tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và Zinc – tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon . .  Boron Boron - - tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và tham gia qt hình thành hocmon tăng trưởng và lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon lục lạp. Hoạt hóa qt hô hấp và tổng hợp hydro cac bon  Copper – liên quan trong quang tổng hợp và hệ thống Copper – liên quan trong quang tổng hợp và hệ thống hô hấp. Hỗ trợ tổng hợp chlorophyll và sử dụng như 1 hô hấp. Hỗ trợ tổng hợp chlorophyll và sử dụng như 1 tác nhân phân giải tác nhân phân giải Nguồn nitrogen  Mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng nitrogen khoáng như ammonium và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như acid amin. Tỷ lệ nitrogen dạng ammonium và nitrat thích hợp tùy theo loài cây và trạng thái phát triển của mô.  Nitrat được cung cấp dưới dạng muối nitrat Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O, KNO 3 , NaNO 3 hoặc NH 4 NO 3 . Ammonium cung cấp dưới dạng muối (NH 4 ) 2 SO 4 hoặc NH 4 NO 3 .Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ của NO 3 - và NH 4 + trong môi trường thay đổi từ 3 đến 6 mM, thông thường khoảng 20 mM Nguồn phospho  Hai dạng muối phospho thường dùng nhất là NaH 3 PO 4 .7H 2 O và KH 2 PO 4 . Nồng độ phospho trong môi trường biến thiên từ 0,15 đến 4 mM, thường khoảng 1 mM Nguồn potasium  Người ta cung cấp kali cho mô nuôi cấy dưới dạng KNO 3 , KCl, KH 2 PO 4 . Nồng độ K + trong môi trường biến thiên từ 2÷25 mM, trung bình khoảng 10 mM.  Nguồn calcium Calci được cung cấp dươi dạng muối Ca(NO 3 ) 2 .4H 2 O, CaCl 2 . 6H 2 O hoặc CaCl 2 .2H 2 O. Nồng độ Ca 2+ trong môi trường nuôi cấy từ 1-3,5 mM, trung bình là 2mM.  Nguồn magnesium Magne được cung cấp dưới dạng MgSO 4 .7H 2 O, với nồng độ trong môi trường từ 0,5 đến 3 mM Nguồn ferric  Những môi trường cổ điển dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl 2 , FeCl 3 .6H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Fe 2 (SO 4 ) 3 , Fe(C 4 H 4 O 6 ). Hiện nay, hầu hết các phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na 2 -Ethylen diamin tetraacetat (Na 2 - EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật. [...]... trùng và bổ sung vào môi trường sau khi hấp) Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25 oC Thời gian hấp tiệt trùng (ở 121oC) môi trường nuôi cấy mô thực vật Thể tích môi trường trong bình chứa (ml) Thời gian hấp tối thiểu (phút) Thể tích môi trường trong bình chứa (ml) Thời gian hấp tối thiểu (phút) 25 20 500 35 50 25 1.000 40 100 28 2.000 48 250 31 4.000 63 Chọn mô cấy Nguồn gốc mẫu cấy Kích thước mẫu... độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) Nồng độ dung dịch stock (x200) (mg/lít) FeSO4.7H2O 27,8 5560 Na2 EDTA 37,3 7460 Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500) Tên hoá chất Acid nicotinic Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) 0,5 Nồng độ dung dịch stock (x500) (mg/lít) 250 Thiamin HCl 0,1 50 Pyridoxin HCl 0,5 250 Myo-inositol 100 50.000 2 1.000 Glycine Pha môi trường làm việc (môi trường. .. extracts) Khoai tây (Potato agar) Than hoạt tính Sử dụng như tác nhân khử độc, khử nước độc từ mô nuôi cấy Nồng độ hay dùng là 0,3% hoặc thấp hơn Than sử dụng cho nuôi cấy mô – Khử sạch acid và phải trung tính – Không sử dụng lại Vấn đề lựa chọn môi trường Phương pháp pha chế môi trường Thành phần môi trường MS Muối khoáng Nồng độ Nồng độ Đa lượng (mg/l) Vi lượng (mg/l) Potasium nitrate (KNO3) 1,900... Sucrose 20 g/l Agar 10 g/l Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20) Tên hoá chất Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) - MgSO4.7H2O 370 7.400 - KH2PO4 170 3.400 - KNO3 1.900 38.000 - NH4NO3 1.650 33.000 440 8.800 - CaCl2.2H2O Nồng độ dung dịch stock (x20) (mg/lít) Pha stock khoáng vi lượng Tên hoá chất Nồng độ môi trường nuôi cấy (mg/lít) Nồng độ dung dịch stock (x100) (mg/lít)... vitamin x500 - Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy - Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ 1000 ml - Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8 - Bổ sung 6-8 g agar - Đun sôi cho tan agar, quấy đều Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi cấy, cần chia xong trước khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50oC Hấp khử trùng (đối với các thành... 0,5 mm Hạt phấn trong túi phấn Chồi bên có chứa một phần thân, lá và chồi nách Mẫu lá được cắt nhỏ, phân nửa được cấy chìm vào môi trường Phiến lá non được đặt trên môi trường, mặt dưới đặt trên mặt thạch Mẫu rễ được đặt trên mặt thạch Mẫu được đặt trên mặt hay được cấy chìm phân nửa vào môi trường ... (Vitamin B1) 10 ÷ 50 Panthothenate calci (Vitamin B3) 1÷5 Riboflavin (Vitamin B2) 1÷5 Biotin (Vitamin H hay B8) 0,1 ÷ 1 Acid folic (Vitamin Bc) 0,1 ÷ 1 Chất điều hòa sinh trưởng thường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Nhóm chất Tên hóa chất p-chlorophenoxyacetic acid Auxin 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Indole-3-acetic acid Indole-3-butyric acid 1-Naphthaleneacetic acid 2-Napthoxyacetic acid 6-Benzylaminopurine... 0,08 Coban (Co) CoCl2.6H2O 0,1 ÷ 0,4 Iode (I) KI 2,5 ÷ 20 Molypden (Mo) (NH4)6Mo7O24.4H2O NaMoO4.2H2O 0,007 – 1 Nguồn khoáng Vai trò trong thực vật Nitrogen Thành phần của protein, acid nucleic và một số coenzymes Là yếu tố khoáng được yêu cầu nhiều nhất cho thực vật Potassium Calcium Magnesium Phospho Sulphur Clo Sắt Mangan Coban Đồng Kẽm Molybden Điều hòa áp suất thẩm thấu, là cation vô cơ đặc trưng... trường nuôi cấy (mg/lít) 0,5 Nồng độ dung dịch stock (x500) (mg/lít) 250 Thiamin HCl 0,1 50 Pyridoxin HCl 0,5 250 Myo-inositol 100 50.000 2 1.000 Glycine Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy) Pha 1 lít môi trường MS cơ bản: - Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher - Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn - Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều - Bổ . acid 2, 4-D 22 1. 0 Indole-3-acetic acid IAA 17 5 .2 Indole-3-butyric acid IBA 20 3 .2 1- Naphthaleneacetic acid NAA 18 6 .2 2-Napthoxyacetic acid NOA 20 2 .2 Cytokinin 6-Benzylaminopurine BAP 22 5 .2 Tất. (mg/lít) Nồng độ dung d ch stock (x100) (mg/lít) Nồng độ dung d ch stock(x1000) (mg/lít) H 3 PO 3 6 ,2 620 0 MnSO 4 .4H 2 O 22 ,3 22 300 ZnSO 4 .4H 2 O 8,6 8600 Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0 ,25 25 0 KI 0,83 830. 4H 2 O) 22 .3 Amonium nitrate (NH 4 NO 3 ) 1, 650 Boric Acid (H 3 BO 3 ) 6 .2 Calcium chloride (CaCl 2 .H 2 O) 440 Colbalt chloride (CoCl 2 .6H 2 O) 0. 025 Magnesium sulfate (MgSO 4 .7H 2 O) 370