thúc đẩy sự phát triển quá trình sản xuất protease trong môi trường nuôi cấy liên tục đa giai đoạn

TÓM TẮT: Một trình lên men phát triển tối ưu hóa cho việc sản xuất Protease từ Bacillus licheniformis PWD-1 Các công thức môi trường xây dựng thông số môi trường quan trọng tối ưu hóa để tạo phát triển hình thành sản phẩm Quy trình động lực tiêu thụ chất, sinh khối, sản phẩm hình thành sản phẩm phụ xác định điều kiện kiểm soát nồi phản ứng sinh học (bioreactor) Sử dụng liệu động học từ thí nghiệm nuôi cấy theo mẻ (batch-Culture) nuôi cấy liên tục (continuous-culture), trình nuôi cấy theo mẻ có bổ sung dinh dưỡng (fed-batch-bổ sung chất nền) phát triển để sản xuất Proteolytic (Potease-enzym Proteolytic) có hoạt lực gấp 10 lần so với trình nuôi cấy gián đoạn bình thường.Trong giai đoạn nuôi cấy liên tục, hình thành Protease tách hoàn toàn Từ thí nghiệm nuôi cấy liên tục giai đoạn dẫn đến phát triển trình lên men nuôi cấy liên tục giai đoạn thùng khuấy cách sử dụng điều kiện tối ưu cho phát triển giai đoạn đầu hình thành Protease giai đoạn thứ hai Theo đó, sở sản xuất liên tục enzyme quy mô thí nghiệm hoàn thành GIỚI THIỆU Trong số enzyme công nghiệp, protease chiếm phần lớn doanh số bán hàng toàn giới, chiếm 1,3 tỷ US $ vào năm 1998 (Godfrey T 2001 ET Consulting, thay mặt cho Biocatalysts Ltd http://www.biocatalysts.com), với nhu cầu ngày tăng ứng dụng ngành da, mỹ phẩm, tẩy rửa, pha chế thực phẩm Chỉ có nhóm nhỏ enzyme proteolytic có khả thủy phân keratin-scleroprotein (Scleroproteins protein dạng sợi ) không hòa tan động vật có xương sống, tìm thấy lông vũ, tóc móng Vi khuẩn, actinomycetes (xạ khuẩn có khả tiết protease), nấm men có khả sản xuất enzyme proteolytic chuyên biệt có tên keratinase Keratinase sử dụng thành công để xử lý tinh chế sợi len (Cegarra cộng sự., 1992) để cải biến lông vật liệu khác nguồn thức ăn chăn nuôi (Onifade et al., 1998 ; Pal et al., 1996; Raju et al., 1996) thành phần hoạt chất loại kem (Greff D 1996 Các chế phẩm thẩm mỹ có chứa chất chống oxy hoá Ceramide protease Frande Demande FR 2729079 A1 trang 12) dầu gội đầu (Tanaka M, Tomizawa N 1986 Dầu gội đầu có chứa enzyme keratindrapering JP 62164611 A2 21 Jul 1987 Showa trang) Để đạt enzyme có giá trị với số lượng đủ cần phải vận hành hệ thống sản xuất với suất thể tích cao Để đạt nồng độ sản phẩm cao suất tốt môi trường nuôi cấy tối ưu Tuy nhiên, suất tổng thể trình giảm đáng kể thời gian bổ sung cần thiết để làm sạch, khử trùng, cuối đạt điều kiện tối ưu để hình thành sản phẩm Trongnuôi cấy theo mẻ có bổ sung chất này, thành phần môi trường tối ưu cho tăng trưởng hình thành sản phẩm bổ sung chế nhập liệu (fedding subtract) điều chỉnh thông số hoạt động theo giai đoạn trình lên men Theo cách tương tự, cần phải phân biệt giai đoạn tăng trưởng hình thành sản phẩm cách áp dụng hệ thống bể khuấy liên tục hai giai đoạn điều chỉnh thành phần điều kiện môi trường tối ưu giai đoạn tương ứng Trong nghiên cứu này, quy trình lên men liên tục phát triển tối ưu hóa để sản xuất keratinase cụ thể từ Bacillus licheniformis PWD-1 Loại enzyme sử dụng thành công biến đổi sinh học lông vũ gia cầm thành thức ăn giàu đạm (Shih JCH 1991) Phương pháp làm giảm việc sử dụng vi khuẩn có ích phân giải vật liệu keratinaceous trước Do đó, mục đích nghiên cứu cách thức để chứng minh chiến lược cho phát triển nhanh chóng tối ưu hóa trình lên men để cung cấp đầy đủ enzym tương tự VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chuẩn bị vi sinh vật môi trường nuôi cấy Bacillus licheniformis PWD-1 thu từ American Type Culture Collection (Bộ sưu tập chủng vi sinh vật chuẩn Mỹ-ATCC 53757)) Stock Culture (Môi trường gốc-Chỉ số môi trường vi sinh vật trì với điều kiện tối ưu) trì dạng spore suspensions (dạng bào tử tồn dạng huyền phù) 70 0C 15% Glyxerol Trước tiến hành thí nghiệm lên men môi trường agar chuẩn bị để cấy bào tử vi khuẩn đĩa thạch Luria Broth vô trùng để thu nhận khuẩn lạc sau 16 ủ 50 ° C( Mục đích nhân nhanh số lượng giống vi sinh vật) Các môi trường agar bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 40C sử dụng để cấy Preculture- giống vi sinh vật khiết ( môi trường có chưa vsv) Một môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu hóa sử dụng cho thí nghiệm lên men (nồng độ cuối g / L-1) (Raninger, 2001): Để tránh phản ứng Maillard (phản ứng đường aa hợp phần tham gia phản ứng P sản phẩm phân giải chúng với glucid), dd A chứa: 14.52 peptone từ casein (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), 2.41 (NH4 ) 2SO4, 3,49 KH2PO4, 3,25 Na2HPO4 × 2H20 phân vô trùng riêng khỏi dung dịch B: chứa 10 glucoza, 0,67 sắt citrat, 4,52 MgSO4 × 7H O, 0,11 MnSO x H2O 26,9 dung dịch nguyên tố vi lượng SL6 (DSMZ 2001 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen http: // www.dsmz.de/media/med027.htm) Cả hai dung dịch hấp chín 30 phút 121 ° C, làm nguội trộn lại bình lắc dòng chảy tầng Môi trường đưa vào buồng lên men sử dụng kỹ thuật kết nối vô trùng Đối với số môi trường nuôi cấy gián đoạn với chất glucose, peptone từ casein sunfat amoni áp dụng tỷ lệ nồng độ khác để xác định tác động lên hình thành protease Ngoài ra, môi trường cô đặc lên đến bốn lần để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chất lên hình thành protease Đối với thí nghiệm nuôi liên tục, môi trường pha loãng đầy đủ để tránh giới hạn oxy Đối với nuôi cấy fed-batch, dung dịch chiết suất glucose vô trùng (300 g / L-1) chuẩn bị nồi hấp thể tích l 121° C 60 phút Pre-culture: môi trường chuẩn bị trước vào nuôi cấy 150ml dung môi vô trùng đổ vào bình tam giác có nút đậy (1000mL) tiêm chủng với khuẩn riêng (muỗng vòng) Bacillus licheniformis PWD-1 từ đĩa thạch Luria Broth Các mẫu nuôi cấy ủ 6,5 50 ° C lắc quay 120 vòng / phút máy lắc quay vòng (GFL 3033, ném 2,7 cm) Các tế bào lắng cặn tốc độ 5000 vòng / phút 10 phút RT (Sorvall SS34 rotor) cho vào 30 mL dung dịch NaCl vô trùng (0.9%) Một thể tích phù hợp cho huyền phù tế bào sử dụng để cấy vào môi trường Nuôi cấy theo mẻ Các bình lắc (300 mL, chứa 50 mL môi trường) tiêm với tế bào tươi đem đo mật độ quang học OD đạt 0.1 (600 nm so với nước) ủ 50 ° C 20 máy lắc quay 120 vòng / phút (ném 2,7 cm) Đối với thí nghiệm lên men kiểm soát, trình nuôi cấy theo mẻ thực MBR-Mini Bioreactor (thể tích làm việc 1,8 lít), Giovanolla Bioreactors (thể tích làm việc 15 lít) Các môi trường trì pH 6,2 ± 0,1 cách thêm NaOH (15%) H3PO4 (15%) Nhiệt độ trì 50 ° C ± 0,2 tất trình lên men theo mẻ nngoại trừ thí nghiệm thay đổi nhiệt độ Sự thông khí đặt mức 0,5 vvm tốc độ khuấy điều chỉnh từ 400 đến 900 vòng / phút để trì nồng độ oxy không hạn chế môi trường (> 10% giá trị bão hòa) Oxy tinh khiết sử dụng cần thiết trình tăng trưởng pha log Để làm giảm bọt polypropylene glycol (PPG 2000) thêm vào pha log Các số pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy, nồng độ oxy kiểm soát ghi lại suốt trình lên men Fed-Batch Cultures –nuôi cấy theo mẻ có bổ sung chất Fed-Batch nuôi cấy Giovanolla Bioreactor (thể tích bắt đầu 15 L) Môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu áp dụng với nồng độ glucose bắt đầu 12,5 g / L-1.Nồi lên men tiêm đến mật độ quang phổ 0,1 Sự thông khí điều chỉnh đến 0,5 vvm tốc độ máy khuấy dao động từ 400 đến 1000 vòng / phút để giữ oxy mức hạn chế Nhiệt độ điều chỉnh đến 50 ° C ± 0,2 chuyển sang 40 ° C sau pha log nuôi cấy Độ pH trì mức 6,2 ± 0,1 NaOH 15% H3PO4 15% cho lần nhập liệu Sự tạo bọt kiểm soát cách bổ sung polypropylen glycol cần thiết Các mẫu để đo biến đổi trình có liên quan thực khoảng thời gian đặn theo quy trình động lực Continuous Cultures-Nuôi cấy liên tục Nuôi cấy liên tục tiến hành hệ thống với thể tích không đổi để đạt trạng thái ổn định Pha cân xác định biến đổi mẫu không thay đổi lần kiểm tra mẫu, cách vài Đối với tỷ lệ pha loãng 0,6 h-1, hình thành protease / sporulation tham số thay đổi chậm Trên giá trị tế bào phát triển không phát có hình thành protease Nồng độ chất chuyển hóa liên tục nồng độ sinh khối tăng liên tục sau dùng để xác định cân Các thí nghiệm thực Infors HT Labfors Fermentor System Thiết lập thử nghiệm cho thí nghiệm nuôi cấy liên tục hai giai đoạn thể Hình Tương tự, việc thiết lập môi trường nuôi cấy liên tục giai đoạn đạt Trong nuôi cấy liên tục giai đoạn thể tích làm việc không đổi 300 mL Tốc độ dòng chảy qua bể điều chỉnh để đạt tỷ lệ pha loãng yêu cầu PH điều chỉnh tới 6,2 ± 0,1 sử dụng NaOH 15% cho tỷ lệ pha loãng 0,7 h-1 Các môi trường nuôi cấy trì 50,0 ± 0,2 ° C, khuấy từ 600 đến 1000 vòng / phút đun khí nén 0,5 vvm để giữ nồng độ oxy mức không hạn chế Việc tạo bọt điều khiển việc bổ sung polypropylen glycol cần Trong suốt hai lần nuôi cấy, giai đoạn vận hành 300 mL với tốc độ pha loãng 0,7 h-1 Khối lượng làm việc bể giai đoạn điều chỉnh từ đến 6000 mL để có thời gian cư trú trung bình bắt buộc để tạo sản phẩm Hình Sơ đồ thiết lập thí nghiệm thí nghiệm nuôi cấy liên tục hai giai đoạn Các thùng chứa để bổ sung chất dinh dưỡng xả máy lên men giai đoạn đầu đặt cân Dữ liệu trọng lượng đưa vào hệ thống máy tính máy bơm định lượng điều chỉnh theo hệ thống máy tính Phương pháp phân tích Mật độ quang phổ môi trường lên men đo 600 nm (OD600) 25 ° C nước Quang phổ kế V tương quan với sinh khối tế bào khô Trong pha tăng trưởng log, đơn vị hấp thụ với khối lượng khô 0,48 g / l-1 tế bào Vào giai đoạn đầu tế bào tĩnh, tế bào trở nên ngắn nhỏ gọn đơn vị hấp thụ với khối lượng khô 0,72 g / L-1 tế bào Để xác định khối lượng tế bào khô, lượng mẫu lên men phù hợp lọc chân không qua màng lọc 0.22 m (Millipore) Bánh lọc rửa dung dịch NaCl 0,9% sấy khô độ cân sấy (Sartorius) với khối lượng không đổi Nồng độ bào tử xác định cách đo mật độ quang học đếm bào tử kính hiển vi buồng Thoma Để nhanh chóng ước lượng nồng độ glucose quy trình fed-batch, dải thử nghiệm (Diabur-Test 5000, BoehringerMannheim) sử dụng.Glucose hợp chất acid hữu môi trường lên men phân tích thông qua HPLC (hệ thống HPLC Merck-Hitachi LaChrom A Biorad Aminex HPX-87H Cột cột Biorad Cation K + sử dụng với dung dịch acid sulfuric 0.005 mol / L-1 tốc độ dòng chảy không đổi 0,6 ml / phút-1 nhiệt độ hoạt động 60 ° C với 20 L L Khối lượng mẫu Đối với việc xác định glucose sử dụng tín hiệu RI detector (máy dò VR-7490 RI), tín hiệu RI UV (máy dò UV L-7400 UV 210 nm) sử dụng để tính nồng độ axit hữu Hoạt tính proteolytic xác định cách sử dụng biến đổi kiểm tra mô tả Tomarelli (Tomarelli cộng sự, 1949) Phép thử dựa trình tiêu hoá proteolytic azo-casein màu azo-keratin Sự tương quan hoạt động proteolytic cách sử dụng azo-casein azo-keratin làm chất tuyến tính suốt trình lên men, cho thấy enzym tiết keratinase Su-pernatant (phần dịch lên men) môi trường lên men pha loãng với dung dịch phosphat (pH 7,5, 55 mM) Năm mươi microliters mẫu pha loãng trộn với dung dịch azocasein 100 o L (20g / L-1 dung dịch đệm phosphate pH 7.5,5 mM) Eppendorf ủ 60 ° C 15 phút bồn nước Các axit azopeptide xuất axit azoamino tách cách kết tủa chất chưa tiêu hóa với 400? L axit trichloroacetic (5%) Sau ly tâm phút tốc độ 13000 rpm, 200 L L bề mặt kết hợp với 200 ?L NaOH (1 M) cuvette nhựa nhỏ (đường cm) Giải pháp màu kết photometrically đọc 430 nm mẫu tham khảo chứa 10 LL chất ức chế protease serine cụ thể (giải pháp bão hòa PMSF phenylmetyl-sulfonyl "trong isopropanol nhiệt độ phòng) Theo cách này, "đơn vị tùy ý" (U *) hoạt động proteolytic xác định gia tăng đơn vị hấp thụ tốc độ 430 nm / phút, nhân với khối lượng cuvette microliters nhiệt độ 60 ° C pH 7,5 0.55 mol / l phosphate đệm, xem xét tất pha loãng KẾT QUẢ Batch Culture Bacillus licheniformis PWD-1 tăng trưởng theo cấp số nhân 2,5 nuôi cấy (Hình 2),không tìm thấy pha tiềm phát (pha lag) Sản lượng sinh khối phát triển glucose Yxgr, xác định 0,48 g / g-1 (tổng nồng độ sinh khối Xtot phân tách thành sinh khối phát triển Xgr sinh khối bào tử Xsp) Tốc độ tăng trưởng cụ thể tối đa xác định 1,47 h-1, tương ứng với thời gian phát điện 28 phút Acetate tiết song song với tiêu thụ glucose Sản lượng acetate tạo thành sinh khối phát triển xác định 0,29 g / g-1 Acetate sử dụng lại glucose sử dụng hết, đáng ngạc nhiên không thấy tiêu thụ acetat Ở giai đoạn này, sinh lý tế bào thay đổi từ que dài thành tế bào nhỏ mật độ dày Quá trình chuyển đổi quan sát mật độ quang giảm Mật độ quang học tăng trở lại, tế bào bắt đầu thụ tinh Sự hình thành protease bắt đầu song song với hình thành bào tử sau giờ, acetate ghi nhận lại tiếp tục tăng thêm Sự kích hoạt hóa học đạt đến tối đa 8000 U * / mL-1 11 sau tiêm sau giảm tế bào giữ bào tử Năng suất tối đa quy trình lô xác định 800 U * mL-1 h-1, không xem xét công việc chuẩn bị làm máy lên men Hình Trong trình lên men theo thời gian B licheniformis PWD-1 để tạo keratinase kiểm soát, thời gian chuyển đổi mật độ quang học (ODkhối bào tử ( ), Glucose ( ) Và hoạt động proteolytic (Prot Act ), sinh Điều kiện lò phản ứng sinh học MBR-Mini Tỷ lệ hình thành protease tối đa xảy song song với tốc độ bào tử bào tử tối đa (Hình 3) theo tỷ lệ hình thành sinh khối tối đa với độ lệch tm=3,75 (thời gian trưởng thành) Ngoài ra, hai tỷ lệ giảm tốc song song tỷ lệ hình thành sản phẩm trở nên âm tính Vào thời điểm này, hoạt tính proteolytic bắt đầu giảm tế bào tạo bào tử Tỷ lệ hình thành protease tăng tuyến tính với tốc độ bào tử miễn protease hình thành Hiệu suất giả thuyết hoạt động proteolytic từ sinh khối spore Yprot / xsp xác định đến 5050 U * / mg-1 Nhân giá trị với nồng độ sinh khối spore (Xsp) có hoạt động proteolytic tối đa (1.6g / L-1) cho phép hoạt động proteolytic tối đa thực tế khoảng 8000 U * / mL-1 Glucose tiêu thụ hiệu trình nuôi cấy gián đoạn với nồng độ bắt đầu khoảng 20g / L-1 Hệ số suất sinh khối tổng thể YX giảm mạnh nồng độ glucose 20g / L-1 áp dụng gia tăng acetate Tối đa trình nuôi cấy gián đoạn sử dụng nồng độ bắt đầu glucose lên đến 10g / L-1 giảm bắt đầu nồng độ glucose cao Việc lên men theo lô sử dụng nồng độ trung bình 35 g / L-1 glucose cho thấy giai đoạn trễ khác biệt trước tăng trưởng tế bào Nồng độ tối đa 3,2 g / L-1 acetate trình lên men, sản lượng sinh khối tổng thể glucose giảm 35% so với thí nghiệm sử dụng nồng độ bắt đầu glucose 10g / L-1 Hoạt tính proteolytic tối đa 46 U * / mL-1 thấp không phát bào tử trình lên men Hình Tiến trình thời gian tỷ lệ tổng lượng sinh khối hình thành (rXtot- ), bào tử tạo thành(rXsp- ), tạo thành protease (rprot ) Trong suốt trình lên men gián đoạn Bacillus licheniformis PWD-1 Lên men theo mẻ với nồng độ nitơ khác Áp dụng môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu môi trường bản, casein peptone nồng độ amoni sulfat thay đổi theo thiết kế thống kê tổng hợp trung tâm để xác định tác động lên hình thành protease Ammonium sulfate áp dụng nồng độ từ 0,5 đến 5,5 g / L-1 peptone casein từ đến 11 g / L-1 Hoạt tính proteolytic tối đa lần nuôi cấy khối lượng tế bào tương ứng xác định để tính toán hoạt tính proteolytic tối đa Hoạt động proteolytic đặc hiệu cao tìm thấy glucose, casein peptone, sunfat amoni áp dụng tỷ lệ 100: 85: 26 Nồng độ sinh khối tối đa môi trường đạt khoảng 70% thí nghiệm so sánh sử dụng môi trường tăng trưởng phức hợp tối ưu hóa, hàm lượng giảm casein peptone Hoạt động proteolytic tối đa cải thiện đến 185% Thí nghiệm chuyển nhiệt Nhiệt độ thay đổi từ 50 đến 46 ° C sau giai đoạn tăng trưởng theo mũ tăng lên trình lên men theo mẻ làm tăng hoạt tính proteolytic môi trường lên men lên gấp ba so với thí nghiệm đối chứng (Hình 4) Một thiết kế nhân tố thực để thống kê điều tra ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thay đổi nhiệt độ lên hình thành protease nuôi cấy theo đợt Nhiệt độ đặt từ 30 đến 54 ° C (sáu cấp) Sự thay đổi thực giai đoạn tăng trưởng (-1,5 giờ), chuyển từ giai đoạn di chuyển đến pha tĩnh (0 giờ) giai đoạn sau phát triển (1,5 giờ) Dữ liệu phân tích với Statgraphics? Sử dụng phương pháp phản ứng bề mặt (Hình 5) Mô hình toán học tương ứng dự đoán nhiệt độ thay đổi đến 40 ° C, 0,5 sau giai đoạn tăng trưởng cho hoạt động proteolytic tối đa Theo cách này, hoạt tính proteolyt cực đại nuôi cấy theo đợt cải thiện gấp lần so với không làm thay đổi nhiệt độ Hình Hình dạng mật độ quang học (ODAct- ) hoạt động proteolytic (Prot ) Trong trình lên men theo thời gian B.licheniformis PWD-1 áp dụng thay đổi nhiệt độ từ 50 đến 46 ° C sau pha tăng trưởng theo hàm mũ (Mũi tên) thí nghiệm kiểm soát tương ứng (các biểu tượng tối tương ứng) Fed-Batch Culture Sự lên men theo chu kỳ thức ăn sử dụng môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu nồng độ bắt đầu glucose 12,5 g / L-1 thể tích làm việc 15 L mô tả Hình Một thức ăn glucose (300 g / L-1) bắt đầu phát triển theo hàm mũ Sau 3,8 tốc độ cho ăn 0,36 L / h-1 Vào cuối tăng trưởng theo hàm mũ sau 4,5 giờ, tốc độ cho ăn hạ xuống 0,12 L / h-1 Ngoài ra, nhiệt độ chuyển từ 50 ° C đến 40 ° C sau giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân Từ thời điểm này, nồng độ glucose máy phản ứng sinh học thực tế không So với trình lên men theo lô sử dụng nồng độ bắt đầu glucose, nồng độ sinh khối tối đa cải thiện lên 40% Acetate hình thành trình tăng trưởng theo hàm mũ, sử dụng lại, trình trở thành giới hạn glucose Bảy sau bắt đầu thụ tinh, nồng độ glucose tăng chậm Do thức ăn bị ngưng lại Hoạt tính proteolytic tối đa 86.000 U * / mL-1 đạt sau 28 Hình 5: phản ứng bề mặt cho thấy ảnh hưởng việc chuyển nhiệt độ lên hoạt động proteolytic tối đa suốt trình lên men B licheniformis PWD-1 Hình Quá trình thời gian tổng lượng sinh khối (Xtot ), Tiêu thụ glucose ( ), Sự hình thành bào tử spore (Xsp ), Và hoạt động proteolytic (Prot Act ) Trong trình lên men fed-batch B licheniformis PWD- Các mũi tên hình làm bật hai maxima cục tốc độ hình thành protease Việc gia tăng hình thành protease đầu tiên, nhanh, sau trình lên men trở thành glucose-limiting Trong giai đoạn từ đến 11 giờ, 60% hoạt tính proteolytic cuối tạo Không giống nuôi cấy hàng loạt, hình thành protease hoàn toàn độc lập với hình thành bào tử Sản lượng hoạt tính proteolytic sinh khối phát triển (Yprot / Xgr) tính toán 5679 U * / mg-1 xem xét thời gian chín Từ 11 đến 15 giờ, hoạt tính proteolytic không thay đổi tế bào bắt đầu thụ tinh Từ điểm này, tỷ lệ hình thành protease tăng lên đến mức tối đa địa phương thứ hai, xảy song song với tốc độ hình thành bào tử tối đa Tương tự nuôi theo mùa, phần thứ hai hình thành protease cho thấy mối tương quan tốt với trình bào chế Tính toán hệ số suất tương ứng Yprot / Xsp 11565 U * / mg-1 Nhân hệ số suất với nồng độ sinh khối nồng độ spore tương ứng tạo hoạt tính proteolyt cực đại 85 kU * / mL-1, gần với giá trị thực tế 86 kU * / mL-1 Hình Tiến trình thời gian tỷ lệ hình thành sinh khối (rXtot thành bào tử (rXsp ), Tỷ lệ hình ), Và tốc độ hình thành protease (rprot ) Trong trình lên men lứa Bacillus licheniformis PWD-1 Các mũi tên mức tối đa tốc độ hình thành protease Mức tối đa sau xảy song song với tốc độ hình thành bào tử tối đa Môi trường nuôi cấy liên tục Tóm tắt trạng thái ổn định (Herbert cộng sự, 1956) biến tố lên men quan trọng đạt trình nuôi cấy B licheniformis PWD-1 (môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu nồng độ glucose 1,25 g) trình bày Hình Với Giảm tỷ lệ pha loãng (từ D 1,2 h-1 đến 0,7 h-1), mật độ quang học khối lượng tế bào khô tăng, tiết acetate giảm Dưới tỷ lệ pha loãng này, tiết acid acetate nồng độ sinh khối tổng thể không đổi giá trị cực đại 1.6g / L-1 Mật độ quang học tiếp tục tăng, tỷ lệ pha loãng hạ thấp tế bào trở nên ngắn dày Các hoạt động Proteolytic phát tỷ lệ pha loãng 0,6 h-1 Ở mức tỷ lệ pha loãng tế bào ngừng tiết axetat, cho thấy chất ngày trở nên hạn chế, không bị lãng phí đường không hiệu Các trạng thái ổn định tốc độ pha loãng từ 0,3 đến 0,6 h-1 cho thấy hoạt tính proteolytic bào tử có môi trường lên men Hoạt tính proteolytic tối đa 6400 U * / mL-1 thu tốc độ pha loãng 0,11 h-1 (thời gian cư trú trung bình giờ) Hình Các trạng thái ổn định nồng độ tổng số sinh khối (Xtot ), Nồng độ sinh khối bào tử (Xsp ), Nồng độ acetate (Ac ), Và hoạt tính proteolytic (Prot Act ) So với tỷ lệ pha loãng giai đoạn nuôi cấy Của B licheniformis PWD-1 Sản lượng tối đa hoạt động proteolytic (830 U * / mL-1 h-1) xác định tốc độ pha loãng 0,159 giờ-1 Tại thời điểm này, tỷ lệ bào tử bắt đầu Dưới tỷ lệ pha loãng này, tỷ lệ hình thành protease giảm, tỷ lệ bào tử tăng thêm Sản lượng tối đa sinh khối 1,04 g / L-1 h-1 quan sát trước tỷ lệ tạo axetat trở nên đáng ý với tốc độ pha loãng 0,7 h-1 Trên bề mặt tỷ lệ pha loãng ngày chuyển hóa thành axetat axit hữu khác làm giảm sản lượng sinh khối lần Với tốc độ pha loãng 1,2 h-1, mật độ quang học khối lượng tế bào khô tương ứng với giá trị quan sát thấy thí nghiệm lô, tế bào phát triển nhanh acetate tiết Để chuẩn bị cho nuôi cấy liên tục hai giai đoạn, nuôi cấy liên tục giai đoạn đầu tiến hành với tỷ lệ pha loãng 0,7 h-1 cho suất sinh khối tối đa mà không phát hoạt tính proteolytic Môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu sử dụng 1,25 g / L-1 glucose Sự thay đổi đến tỷ lệ pha loãng D= 0,075 h-1 mô tế bào vào từ điều kiện phát triển thành điều kiện sản xuất proteolytic tàu thứ hai Ba sau hình thành protease thay đổi bắt đầu hoạt tính proteolytic tăng đến tối đa 2700 U * / mL-1 10 sau chuyển Kết tương tự nhìn thấy trình hai giai đoạn liên tục nuôi cấy bể Một hệ thống bể xi măng liên tục hai giai đoạn vận hành điều kiện tối ưu tương ứng cho giai đoạn Môi trường tăng trưởng phức tạp tối ưu sử dụng nồng độ glucose 1,25 g / L-1 Tàu chạy tốc độ pha loãng 0,7 giờ-1 50 ° C cho sản lượng sinh khối tối đa Giai đoạn thứ hai chạy 40 ° C thời điểm cư trú trung bình khác cách thay đổi khối lượng phản ứng tàu thứ hai Các hoạt động proteolytic đo lần trạng thái ổn định mong muốn mạch thứ hai đạt Không có hoạt động proteolytic phát giai đoạn thứ hai thời gian cư trú trung bình Với thời gian cư trú trung bình ngày tăng, hoạt tính proteolytic tăng lên mạnh mẽ đạt đến mức tối đa 1180 U * / mL-1 thời gian cư trú trung bình 10 Thời gian cư trú trung bình cao làm cho hoạt động proteolytic giảm trở lại THẢO LUẬN Batch Cultures Người ta biết glucose ngăn chặn sản sinh protease trình sinh bào tử (Priest, 1977) Trong hoạt tính protein, hoạt tính proteolytic phát glucose, giai đoạn sau sinh, tế bào tạo bào tử Tỷ lệ hình thành protease nuôi cấy theo lô không liên quan trực tiếp với tăng trưởng (Gaden Jr, 1959) Sự tạo thành protease tạo sporulation theo mô hình song song nuôi cấy theo đợt bắt đầu điều kiện tương tự Tuy nhiên, xác nhận phụ thuộc hình thành protease hình thành bào tử từ liệu theo đợt Việc sản xuất proteaza ngoại bào chủng Bacillus bị ảnh hưởng mạnh đàn áp catabolit chuyển hóa nitơ (Bierbaum cộng sự, 1994 Ignatova cộng sự, 1999, Jurjen cộng sự, 1986 Kaur cộng sự, 2001) Quá trình nuôi cấy gián đoạn cho thấy hình thành hoạt tính proteolytic bị ảnh hưởng lớn cân nguồn carbon nitơ môi trường Sự cân bị xáo trộn mạnh áp dụng nồng độ môi trường Glucose sau chuyển hóa không hiệu dẫn đến gia tăng axit hữu Điều làm thay đổi tỷ lệ carbon nguồn nitơ môi trường, điều giải thích hoạt động proteolyt thấp tìm thấy thí nghiệm theo mẻ cách tăng nồng độ trung bình Các điều kiện nuôi cấy nhiệt độ (Chinyuan cộng sự, 1996, Wang cộng sự, 1999), pH (Ayhan cộng sự, 2001, Moon Parulekar, 1991) nồng độ oxy (Cruz cộng sự, 2000 , Shariati cộng sự, 1995, Zheng cộng sự, 2001) có ảnh hưởng đáng kể tới tiết dịch enzyme dịch nhầy Trong công trình này, chuyển sang nhiệt độ thấp sau giai đoạn tăng trưởng theo mũ cho thấy tác động tích cực đáng kể lên hình thành protease Fed-Batch Cultures Trong nuôi cấy gián đoạn, tỷ lệ tối ưu nguồn carbon: nitơ đặt để tối đa hóa mật độ tế bào (X) để tối đa hóa hoạt tính proteolytic gram sinh khối (prot / X), hai Đối với trình cho ăn theo phần, thức ăn có đường glucose sử dụng để cải thiện hình thành sinh khối trình tăng trưởng theo mũ bổ sung thay đổi chất sắt: nguồn nito môi trường để tạo thành protease ngăn chặn hình thành bào tử thời gian sau tăng trưởng theo hàm mũ Theo cách hình thành sinh khối tối ưu hóa điều kiện môi trường cho phép tạo thành tối đa hoạt tính proteolytic gram sinh khối dẫn đến cải tiến đáng kể sản xuất protease nuôi cấy mẻ theo kiểu nuôi xen Tương tự trình làm giảm nhiệt độ sau gpha log tăng cường hình thành protease cho trìnhbổ sung chất Mặc dù thí nghiệm cho ăn thức ăn cho thấy phần hình thành protease tách rời khỏi trình bào tử, xác định hình thành bào tử protease trình hoàn toàn độc lập, phần hình thành protease có liên quan đến hình thành bào tử Nuôi cấy liên tục Nuôi cấy liên tục chứng minh hình thành protease hình thành bào tử trình độc lập Mặc dù phối hợp hai điều kiện mô hình protein điều kiện ban đầu, điều kiện hạn chế hình thành protease phải giải thích để phản ứng với giới hạn dinh dưỡng với mục đích khai thác nguồn dinh dưỡng bổ sung, nguồn dinh dưỡng sẵn có cạn kiệt Tạo bào tử phải coi bước cuối chiến lược sống để trì điều kiện bất lợi thêm chất dinh dưỡng Trong mô hình nuôi liên tục giai đoạn, tỷ lệ pha loãng cho sản lượng tối đa sinh khối sản lượng tối đa protease rõ ràng xa Vì vậy, có nỗ lực để đưa nhiều giai đoạn áp dụng tỷ lệ pha loãng tối ưu điều kiện cho giai đoạn nuôi cấy Mặc dù giai đoạn chạy điều kiện tối ưu, hoạt động proteolytic tối đa thấp so với trình nuôi cấy liên tục giai đoạn chạy tốc độ pha loãng tối ưu cho sản xuất protease Một lý nằm cấu trúc tuổi quần thể tế bào giai đoạn thứ hai Các tế bào giai đoạn đầu tiên, chạy tốc độ pha loãng cao, tăng trưởng tương đối trẻ Các tế bào vào giai đoạn thứ hai không hoạt động thời gian dài (thời gian chín) trước chúng bắt đầu sản xuất protease Do đó, thời gian cư trú dài trung bình khối lượng nuôi lớn cần thiết để đạt sản lượng protease tối ưu giai đoạn thứ hai Thêm vào giai đoạn sản xuất protease tế bào trưởng thành ngắn Kết là, phần tổng thể thể tích giai đoạn thứ hai thực chứa tế bào trưởng thành sản xuất protease Phần lớn thể tích nuôi cấy chứa tế bào không hoạt động (sau sinh sau sinh) làm giảm hoạt động proteolytic tế bào hoạt động tạo (Mantzaris cộng sự, 1999) Vấn đề khắc phục cách tách tế bào có cấu trúc tuổi khác cách đưa thêm nhiều giai đoạn cách áp dụng lò phản ứng sinh học dạng ống Một lý khác cho hoạt động proteolytic thấp tế bào giai đoạn thứ hai hoàn toàn chất nền, tế bào giai đoạn nuôi cấy đơn bể nuôi cấy đơn giản chất hạn chế Chạy thêm thức ăn thông qua bể khuấy thứ hai nên kéo dài đáng kể thời gian sản xuất protease tế bào trưởng thành; Đây đề tài nghiên cứu sâu  ... thử nghiệm cho thí nghiệm nuôi cấy liên tục hai giai đoạn thể Hình Tương tự, việc thiết lập môi trường nuôi cấy liên tục giai đoạn đạt Trong nuôi cấy liên tục giai đoạn thể tích làm việc không... kiện cho giai đoạn nuôi cấy Mặc dù giai đoạn chạy điều kiện tối ưu, hoạt động proteolytic tối đa thấp so với trình nuôi cấy liên tục giai đoạn chạy tốc độ pha loãng tối ưu cho sản xuất protease. .. chuẩn bị cho nuôi cấy liên tục hai giai đoạn, nuôi cấy liên tục giai đoạn đầu tiến hành với tỷ lệ pha loãng 0,7 h-1 cho suất sinh khối tối đa mà không phát hoạt tính proteolytic Môi trường tăng