Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic

Probiotic là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn probiotic giúp hoàn thiện hệ tiêu hóa, giảm nhiều bệnh về tiêu hóa do vi khuẩn gây ra, giúp cải thiện tình trạng không hấp thụ thức ăn…Đặc biệt vi khuẩn probiotic không gây hại cho vật chủ.Với sự phát triển của khoa học công nghệ cũng như trình độ dân trí ngày càng được nâng cao nên probiotic đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…Sử dụng probiotic trong dược phẩm và chăn nuôi có thể hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động đến sức khỏe con người. Trong số các vi sinh vật được dùng để sản xuất probiotic thì các vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến như : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus…Để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus thì chế phẩm MRS vẫn được coi là môi trường chuẩn. Tuy nhiên chế phẩm MRS rất đắt tiền làm cho sản phẩm vi khuẩn tạo thành có giá thành cao và khó được áp dụng rộng rãi. Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất sinh khối Lactobacillus plantarum chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tối ưu môi trường thay thế rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic”.

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -1- GVHD: TS Đặng Đức Long LỜI MỞ ĐẦU Probiotic vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ cách giúp cân hệ vi sinh vật đường ruột Vi khuẩn probiotic giúp hồn thiện hệ tiêu hóa, giảm nhiều bệnh tiêu hóa vi khuẩn gây ra, giúp cải thiện tình trạng khơng hấp thụ thức ăn…Đặc biệt vi khuẩn probiotic không gây hại cho vật chủ Với phát triển khoa học cơng nghệ trình độ dân trí ngày nâng cao nên probiotic ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, chăn nuôi…Sử dụng probiotic dược phẩm chăn ni hạn chế việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động đến sức khỏe người Trong số vi sinh vật dùng để sản xuất probiotic vi khuẩn lactic sử dụng phổ biến : Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus…Để phân lập nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus chế phẩm MRS coi mơi trường chuẩn Tuy nhiên chế phẩm MRS đắt tiền làm cho sản phẩm vi khuẩn tạo thành có giá thành cao khó áp dụng rộng rãi Với mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để thay cho môi trường MRS sản xuất sinh khối Lactobacillus plantarum chọn đề tài “ Nghiên cứu tối ưu môi trường thay rẻ tiền nuôi Lactobacillus plantarum để phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic” SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -2- GVHD: TS Đặng Đức Long PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử probiotic Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cường sức khỏe người Theo Ayurveda, số ngành y học lâu đời vào khoảng 2500 năm trước công nguyên, tiêu thụ sữa chua (một sản phẩm sữa lên men) ủng hộ để trì sức khỏe tốt Các nhà khoa học đầu tiên, Hippocrates người khác định sữa lên men với tính chất dinh dưỡng thuốc nó, chữa trị rối loạn ruột dày Khoa học giải thích cho ảnh hưởng có lợi vi khuẩn lactic có sữa lên men cung cấp lần vào năm 1907 nhà sinh lý học người Nga, Eli Metchnikoff Metchnikoff đưa giả thuyết sống khỏe mạnh lâu dài nông dân Bungari tiêu thụ sản phẩm sữa lên men Ông cho vi sinh vật sản phẩm sữa lên men có ảnh hưởng tốt đến hệ vi sinh vật kết, giảm hoạt động vi khuẩn độc, nhờ kéo dài tuổi thọ Một điều thú vị vài năm trước thảo luận Metchnikoff, Henry Tissier phân lập Bifidobacteria từ phân trẻ nuôi sữa mẹ nhận thấy chúng thành phần bật hệ vi sinh vật ruột Như tương tự Metchnikoff, Tissier tin vào ảnh hưởng Bifidobacteria đến sức khỏe đứa trẻ nuôi từ sữa mẹ đứa trẻ nuôi sữa hộp Mặc cho diễn chiến tranh Thế giới thứ Metchnikoff làm giảm quan tâm tới liệu pháp diệt khuẩn ông, tảng cho khái niệm đại probiotic rõ ràng thành lập Các kiến thức có thơng qua nghiên cứu thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp sản phẩm sữa Từ quan sát từ sớm Metchnikoff nhà nghiên cứu khác, lịch sử probiotic với sản phẩm lên men tiếp SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -3- GVHD: TS Đặng Đức Long tục tận Điều hiển nhiên thấy rõ qua thực tế ngày hôm thị trường thực phẩm sữa-probiotic khổng lồ tồn tại.[6] 1.2 Định nghĩa probiotic Theo định nghĩa Tổ chức Y tế giới (WHO), probiotic vi sinh vật sống Khi đưa vào thể lượng vừa đủ, chúng có lợi cho sức khỏe Đường ruột có nhiều loại vi khuẩn tốt, xấu tạo thành hệ sinh thái đông đúc Những probiotic có nhiệm vụ chiến đấu, ngăn chặn xâm lấn vi khuẩn có hại giúp thể khơng bị mắc bệnh Do đó, dù khơng phải chất bổ thật quan trọng [7] 1.3 Cơ chế tác động probiotic  Tác động kháng khuẩn probiotic Sở dĩ vi khuẩn probiotic có khả kháng khuẩn trình trao đổi chất tạo sản phẩm có tính kháng khuẩn axit hữu (axit lactic axit acetic), hydroperoxide, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO 2, reuterin, bacteriocin Các sản phẩm trao đổi chất “vũ khí” kháng khuẩn probiotic [8] - Khả kháng khuẩn acid hữu Các acid hữu sinh vi khuẩn lactic chủ yếu acid lactic acid acetic, acid góp phần làm giảm pH tiêu diệt vi khuẩn có hại E.coli, Clostridium perfringens, Staphilococcus aurius Do nội bào vi khuẩn có pH=7 nên có chênh lệch pH so với môi trường acid bên ngồi, H+ từ mơi trường vào bên tế bào vi khuẩn làm pH nội bào giảm Vi khuẩn phải sử dụng chế bơm ATPase để đẩy H + khỏi tế bào làm cho vi khuẩn lượng Mặt khác pH giảm ức chế trình đường phân làm cho tế bào vi khuẩn cạn kiệt lượng dẫn đến bị tiêu diệt Ngoài ra, anion acid gây rối loạn thẩm thấu màng tế bào Những nguyên nhân làm cho vi khuẩn bị chết [8] - Khả kháng khuẩn probiotic nhờ tiết độc tố bacteriocin Bacteriocin chất kháng khuẩn có chất protein ribosome tổng hợp từ chuỗi peptide protein vi khuẩn Gram (-) Gram (+) Bacteriocin có tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn gây thối rữa SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -4- GVHD: TS Đặng Đức Long mầm bệnh phổ biến vi khuẩn Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Cơ chế tác động bacteriocin đa dạng, làm biến đổi enzyme, ức chế sản sinh bào tử, chúng xâm nhập vào tế bào làm lực đẩy proton, làm giảm màng nguyên sinh chất thay đổi pH nội bào, tạo lỗ thủng khắc phục dẫn đến tế bào bị phá vỡ - Các lợi khuẩn probiotic cịn có khả cạnh tranh dinh dưỡng vị trí bám dính để ngăn chặn xâm nhập hại khuẩn vào đường ruột Ngồi ra, probiotic cịn có tác động kháng độc tố hại khuẩn [8]  Tác động mơ biểu bì ruột - Đẩy mạnh liên kết chặt chẽ tế bào biểu mô - Giảm việc kích thích tiết hậu phản ứng viêm lây nhiễm vi khuẩn - Đẩy mạnh tạo phân tử phòng vệ chất nhầy [9]  Tác động lên hệ miễn dịch Probiotic xem phương tiện phân phát phân tử kháng viêm cho đường ruột Cụ thể: - Đẩy mạnh báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm - Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng Hình 1.1 Tác động probiotic lên hệ - Cải thiện hệ vi sinh vật miễn dịch đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy táo bón [9]  Tác động đến vi khuẩn đường ruột Điều chỉnh thành phần cấu tạo vi khuẩn đường ruột Khả sống sót probiotic tiêu hóa phận khác hệ tiêu hóa khác giống Khi tập trung khoang ruột, chúng tạo nên cân tạm thời hệ sinh thái đường ruột giúp SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt Hình 1.2 Tác dụng probiotic lên vi khuẩn đường ruột LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -5- GVHD: TS Đặng Đức Long cho tiêu thụ thức ăn Tuy nhiên, lợi khuẩn lưu trú tạm thời đây, thức ăn tiêu thụ số lượng vi khuẩn probiotic giảm xuống Vi khuẩn probiotic điều hòa hoạt động trao đổi chất vi sinh vật đường ruột Chúng làm giảm pH phận tiêu hóa, gây cản trở cho hoạt động tiết enzyme vi sinh vật đường ruột Đồng thời tăng dung nạp đường lactose, giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu hấp thu loại thức ăn có chứa nhiều lactose làm tăng vi khuẩn có lợi giảm vi khuẩn gây hại 1.4 Chức probiotic  Thủy phân lactose, tăng hấp thụ lactose Suốt trình lên men, vi khuẩn lactic sinh enzyme thủy phân lactose thành glucose galactose Các vi khuẩn đường ruột giúp chuyển hóa hầu hết lượng lactose không hấp thụ ruột non [9]  Làm giảm số bệnh đường tiêu hóa: - Bệnh ung loét Bệnh ung loét hệ thống tiêu hóa (do vi khuẩn Helicobacter pylori gây ra) có liên quan đến chế độ ăn uống hàng ngày sử dụng sản phẩm sữa lên men rau quả, sử dụng nhiều sữa, thịt, tinh bột Vi khuẩn lactic ngăn chặn phát triển vi sinh vật gây bệnh làm giảm hoạt tính enzyme urease cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh lưu trú môi trường acid dày [9] - Bệnh tiêu chảy vi sinh vật Kích thích hệ thống miễn dịch sản xuất IgA đặc hiệu chống lại nhiễm vi sinh vật gây bệnh Ngăn chặn bám dính phát triển vi sinh vật gây bệnh đường ruột Samonella, E.coli, Shingela [9]  Tác dụng ngăn chặn vi sinh vật gây bệnh SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -6- GVHD: TS Đặng Đức Long - Sinh acid acetic, acid lactic, acid hữu khác, làm giảm pH môi trường gây ảnh hưởng bất lợi số vi sinh vật nhạy cảm với tính acid - Sinh chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin): Bacteriocin peptide, polypeptide, protein chất mang cấu trúc gen protein cấu tạo từ amino acid, bao gồm amino acid lanthionine hay beta-methyllanthionine - Tranh giành nơi cư trú, tranh giành chất dinh dưỡng, ngăn chặn bám dính phát triển vi sinh vật gây bênh - Tạo cản trở không gian ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật gây bệnh [9] Chống dị ứng thức ăn Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt hệ vi sinh vật đường ruột, nguồn vi sinh vật kích thích hệ thống miễn dịch Qua nghiên cứu, người ta thấy người bị dị ứng có số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều Clostridia so với người thường bị dị ứng [9]  Tổng hợp số vitamin Các vi khuẩn đường ruột có khả sinh nhiều vitamin khác Việc hấp thu vitamin đường ruột kém, việc vi khuẩn có khả sinh vitamin quan trọng Các vi khuẩn sinh tất loại vitamin B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) vitamin K Theo nghiên cứu, L.Brevis có khả tổng hợp vitamin D vitamin K; B.longum tổng hợp vitamin B; B.bifidum L.acidophillus tổng hợp vitamin B niacin, folic acid, biotin, B6 vitamin K [9]  Giảm cholesterol Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu (coprostanol) cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -7- GVHD: TS Đặng Đức Long Theo nhà nghiên cứu, vi khuẩn probiotic khống chế làm cho cholesterol khó hấp thu vào máu thông qua chế chủ yếu sau: - Hấp thụ lượng cholesterol có mặt hệ thống ruột - Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác giảm hấp thu chất vào thể - Giảm hấp thu cholesterol ruột tăng tiết phân - Giới hạn biến đổi cholesterol thành acid mật cho gan dự trữ - Nếu hàm lượng chất béo cao bữa ăn, gây tăng cholesterol, việc sử dụng bổ sung vi khuẩn có lợi phương pháp giúp cân mức lipid chất béo, giữ hệ thống tim mạch mạnh khỏe [9]  Ngăn chặn ung thư - Kết hợp, ngăn chặn làm hoạt tính yếu tố gây ung thư - Giảm hoạt tính enzyme phân, nơi khơi nguồn mầm mống gây ung thư - Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn tạo thành khối u - Các vi khuẩn có lợi giảm enzyme liên quan đến tác nhân gây ung thư (β-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase β-glucosidase) làm giảm nguy gây ung thư ruột kết [9] 1.5 Các tiêu để chọn vi sinh vật làm Probiotic  Về mặt sản xuất: - Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn điều kiện lên men đơn giản rẻ tiền - Có thể tồn điều kiện kỵ khí hiếu khí - Có thể sống sót qua q trình ly tâm, lọc, đông lạnh sấy lạnh mà không bị giảm số lượng đáng kể - Có khả hoạt hóa nhanh sau sử dụng - Có thể sống sót điều kiên biến đổi khác chế biến thực phẩm bao gồm trình nhiệt độ cao 45 0C, chịu đựng nồng độ ethanol sodium chloride cao [9] SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -8- GVHD: TS Đặng Đức Long  Khả sống sót ruột - Khả chịu dịch tiêu hóa Acid dày muối mật ảnh hưởng mạnh đến sống sót vi sinh vật Các chủng có khả phát triển thực q trình trao đổi chất có mặt lượng mật sinh lý (lượng mật bình thường thể người) có khả sống sót tốt suốt trình đường ruột - Khả cư trú ruột: Những chỗ cư trú gần mô bào màng nhầy hệ thống ruột giàu dinh dưỡng, số vi sinh vật gây bệnh đường ruột khả bám dính xem điều kiện tiên việc xâm chiếm lây nhiễm Khi vi khuẩn có lợi có khả bám chặt vào tế bào bên đường ruột, chúng có khả cạnh tranh góp phần tiêu diệt vi sinh vật có hại [9]  Đặc tính riêng - Có khả sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để phát triển - Khả tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K) - Có khả ngăn chặn mầm bệnh: Samonenella typhimurium, Clostridium pefringens, Escherichia coli… - Có khả tổng hợp acid, hydrogen peroxide, bacteriocin - Có thể sử dụng kết hợp với vi sinh vật khác [9]  Tính an tồn - Khơng gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe [9] 1.6 Một số lĩnh vực ứng dụng probiotic  Trong dược phẩm - Probiotic thực phẩm chức y tế, nâng cao chất therapeutically sử dụng để ngăn ngừa tiêu chảy, cải thiện khả sử dụng lactose kháng khuẩn Chúng có tiềm để ngăn ngừa bệnh ung thư giảm cholesterol Lactobacillus, Bifidobacterium số vi khuẩn có lợi khác đưa vào thể tạo hiệu cách thay đổi thành phần SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -9- GVHD: TS Đặng Đức Long hệ vi sinh vật đường ruột Chế phẩm sinh học probiotic có khả chống nhiễm trùng vi khuẩn vius, chống ung thư, kích thích hoạt động hệ miễn dịch, làm giảm cholesterol… [10] - Ứng dụng probiotic điều trị chứng bệnh dày, viêm ruột kết (gọi chung IBS): nguyên nhân bệnh tượng không dung nạp thức ăn, gây lên men tạo chất độc khơng có đủ enzyme để phân hủy hết chất độc ảnh hưởng đến sức khỏe Theo điều tra nghiên cứu ổn định hệ vi sinh vật đường ruột phụ thuộc vào nhiều yếu tố : acid dày, nhu động ruột, muối mật, pH môi trường ruột cạnh tranh dinh dưỡng lợi khuẩn hại khuẩn Thuốc kháng sinh chữa bệnh vi khuẩn gây Nhưng người ta chứng minh kháng sinh làm ảnh hưởng đến cân hệ vi sinh vật đường ruột cách ức chế trình trao đổi chất lợi khuẩn hại khuẩn Qua phân tích, nhà khoa học kết luận có thay đổi đáng kể tổng số vi sinh vật ruột người bị chứng bệnh IBS Trong đó, lượng Lactobacillus Bifidobacteria giảm nhiều so với người khỏe mạnh, thay vào thống trị hại khuẩn E.coli, Streptococus, Clostridium tượng đầy tượng phổ biến thường gặp người bị bệnh Khi sử dụng thuốc kháng sinh thời gian sau xảy tượng kháng thuốc, gây vơ hiệu hóa tác dụng thuốc Nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic cho người mắc chứng khơng dung nạp thức ăn sau hai tuần bệnh thun giảm rõ rệt khơng có thay đổi thơng số sinh hóa huyết học suốt trình nghiên cứu Khi thử nghiệm sử dụng chế phẩm men vi sinh với L.plantarum chiếm thành phần chủ yếu cho bệnh nhân IBS triệu chứng đầy giảm 50% tổng số bệnh nhân Do đó, phải kết hợp sử dụng nhiều chủng vi sinh vật probiotic giải triệt để bệnh [11]  Trong thực phẩm SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -10- GVHD: TS Đặng Đức Long Sử dụng vi khuẩn để muối chua rau quả, ủ chua thức ăn gia súc, làm chin sinh học loại quả: tạo sinh khối vi khuẩn có ích, át vi sinh vật gây thối Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm Chuyển rau dạng “chín sinh học” mà hiệu suất tiêu hóa tăng Một số chủng dùng để sản xuất sữa chua đặc như: Lactobacillus bulgaricus, Strepticoccus faecalist…Một số chủng thêm vào sữa bột: Lactobacillus, Bifidobacterium…Tại nước phát triển, có nhiều ứng dụng bổ sung probiotic vào nhiều loại thực phẩm sữa chua ăn, phomat, kem, sản xuất nước ép trái probiotic …[12]  Trong mỹ phẩm Xu hướng probiotic ngày thịnh Dòng thực phẩm probiotic ngày phong phú Trong nghiên cứu gần đây, nhà vi sinh vật học mỹ phẩm Biotherm phát tinh chất PTP thành phần tự nhiên có tác động mạnh lên tế bào da, chúng kích thích điều chỉnh tế bào da tương tự probiotic thực tế bào ruột.[13]  Trong nuôi trồng thủy sản Trong nuôi trồng thủy sản, probiotic cịn chế phẩm xử lý mơi trường Thay cho mục đích chủ yếu kích thích gia tăng vi sinh vật có lợi ao nuôi Một thành phần khác thấy chế phẩm probiotic tập hợp enzyme có nguồn gốc vi sinh vật : amylase, protease, lipase , số vitamin thiết yếu acid amine chất khống…nhằm kích thích hoạt tính ban đầu vi sinh vật chế phẩm xúc tác cho hoạt động enzyme môi trường Hiện nay, việc sử dụng chế phẩm sinh học giải pháp ưu việt để có suất, chất lượng, bền vững thủy sản nuôi [14]  Trong bảo vệ mơi trường Do có tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây thối (sinh loại khí H2S, SO2,NH3…) nên phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh, chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi cách nhanh chóng Đồng thời số lượng ruồi, muỗi, ve,các loại côn trùng khác giảm số lượng đáng kể [15] SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -432 Stt = Vậy: GVHD: TS Đặng Đức Long 0, 072 = 0, 024 Stt 0, 024 F= = = 4,8 Sth 0, 005 Tra bảng chuẩn Fisher, Fb(p,f1,f2) với mức ý nghĩa p = 0,05, f1 = N - L, f2 = m-1 = Fb(0,05;3,2) = 19,2 Do F < Fb nên phương trình hồi quy (3.7) tương thích với thực nghiệm phương trình sử dụng để tìm kiếm tối ưu Sử dụng phần mềm Excel Solve để tìm nghiệm tối ưu hàm mục tiêu với miền ràng buộc: -1 ≤ x1,x2,x3 ≤ Sau chạy chương trình tìm kiếm tối ưu ta kết sau: ymax = 10,589; x1opt = x2opt = x3opt = Do x1, x2, x3 biến mã hóa ma trận thực nghiệm nhận giá trị nên ta phải tiến hành đổi chúng biến thực theo công thức sau: x max j = Z max − Z j j λj =1 (3.10) [5] Áp dụng cơng thức (3.10) ta có: max x max x max x Z1max − Z10 = = λ1 m Z ax − Z = λ2 m Z ax − Z λ3 = → Z1max = m = → Z ax = 16 = → Z3max = 13 Vậy theo thực nghiệm, nồng độ thành phần môi trường dinh dưỡng để sau q trình ni cấy thu lượng sinh khối vi khuẩn L.plantarum lớn là: Nồng độ cà chua SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt : 8% LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -44Nồng độ nước dừa GVHD: TS Đặng Đức Long : 16% Nồng độ cao nấm men : 13g/l 3.5.3 Tiến hành nhân sinh khối vi khuẩn L.plantarum với thơng số mơi trường tối ưu vừa tìm được: - Nồng độ cà chua : 8% - Nồng độ nước dừa : 16% - Nồng độ cao nấm men : 13% - Nhiệt độ nuôi cấy : 300C - Tỷ lệ giống : 1% - Thời gian nuôi cấy : 36h Tiến hành thí nghiệm với điều kiện để lấy kết trung bình Sau 36h nuôi cấy lắc, tiến hành đo OD môi trường ta kết sau Bảng 3.8 Kết kiểm chứng lại điều kiện môi trường tối ưu vừa tìm Mơi trường TN1 TN2 TN3 OD Số khuẩn lạc/µl 0.086 10.499 0.086 10.499 0.087 10.624 (Chú thích: Số khuẩn lạc/1µl bảng tính dựa theo đường chuẩn OD số khuẩn lạc trình bày mục 3.4.2) Kết khuẩn lạc trung bình thí nghiệm 10,541/µl Tuy kết thực nghiệm thấp so vói lý thuyết không đáng kể Điều chứng tỏ kết tính tốn theo lý thuyết phù hợp với thực nghiệm 3.5.4 Đánh giá hiệu môi trường tối ưu so với môi trường MRS: 3.5.4.1 So sánh hiệu tăng sinh khối Môi trường MRS sau hấp khử trùng có màu đậm nên dùng cho phương pháp đo mật độ quang Vì để so sánh hiệu tạo sinh khối L.plantarum môi trường MRS môi trường thử nghiệm phải sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc cách cấy lượng giống vào SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -45- GVHD: TS Đặng Đức Long hai loại môi trường Giống mơi trường MRS lỏng pha lỗng đến nồng độ 10-7, sau hút 100µl trang lên mặt đĩa petri Kết số khuẩn lạc mọc lên bề mặt hai loại môi trường sau: Mơi trường thay Mơi trường MRS Hình 3.12 Kết so sánh hiệu tạo sinh khối L.plantarum môi trường MRS môi trường rẻ tiền Số lượng khuẩn lạc mọc môi trường MRS 75 khuẩn lạc, cịn mơi trường thay rẻ tiền 52 khuẩn lạc Áp dụng công thức : Số tế bào/ml mẫu = Ai × Di V Trong đó: Ai số khuẩn lạc V thể tích dịch mẫu đem cấy Di độ pha loãng Vậy: Số tế bào/ml môi trường MRS là: Ai 75 × Di = ×107 = 75 ×105 V 100 (tế bào/ml) Số tế bào/ml môi trường thay rẻ tiền : Ai 52 × Di = ×107 = 52 ×105 V 100 SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (tế bào/ml) LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -46- GVHD: TS Đặng Đức Long Dựa vào kết hình 3.11 kết tính số tế bào/ml mơi trường ta thấy, sau nuôi tủ ấm 30 0C lượng khuẩn lạc mọc lên bề mặt môi trường MRS nhiều so với môi trường thay lượng không đáng kể Thay vào đó, khuẩn lạc mọc bề mặt mơi trường thay lại có kích thước lớn Cũng trước cấy trải vào đĩa thạch, giống nuôi môi trường MRS lỏng nên cấy vào mơi trường MRS giống nhanh thích nghi so với môi trường thay rẻ tiền nên số lượng khuẩn lạc mọc lên nhiều Tuy nhiên thời gian nuôi cấy vi khuẩn L.plantarum môi trường MRS 48h, cịn thời gian ni cấy mơi trường thay rút ngắn lại 36h Đây yếu tố quan trọng nuôi cấy vi khuẩn phục vụ cho nhiều lĩnh vực Ví dụ sản xuất công nghiệp, rút ngắn thời gian nuôi cấy giống vi sinh vật giảm chi phí lớn, tiết kiệm thời gian sản xuất, quay vịng nhanh quy trình sản xuất… 3.5.4.2.So sánh hiệu kinh tế - Giá thành chế phẩm MRS Broth: Hiện giá MRS Broth 75,7 USD/500g [25], tương đương với 1.514.000 đồng Vậy 1g chế phẩm MRS Broth có giá 3028 đồng Để pha 1lít mơi trường MRS lỏng cần 68,2g chế phẩm vào lít nước cất Vậy, chi phí cần thiết để pha lít mơi trường MRS lỏng là: 68,2 x 3028 = 206.600 đồng - Giá thành môi trường thay vừa tìm được: Cà chua : 10.000 đồng/kg , Nước dừa : 12.000 đồng/quả/600ml Cao nấm men: 190,76 SGD/500g [36] = 3.039.379 đồng/500g Vậy 1g cao nấm men có giá 6.000 đồng Để pha 1lít mơi trường thay cần có chi phí cho thành phần sau: SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -47- GVHD: TS Đặng Đức Long - Cà chua : cần dùng 80g, có giá 800 đồng Nhưng trình sơ chế phải bỏ ruột vỏ nên tính giá cà chua 1000 đồng - Nước dừa : cần dùng 160ml, có giá 3.200 đồng - Cao nấm men : cần dùng 13g, có giá 78.000 đồng Tổng chi phí để pha lít mơi trường thay : 1.000 + 3.200 + 78.000 = 82.200 (đồng) Ta có chênh lệch giá thành chế phẩm MRS Broth môi trường thay : 206.600 ≈ 2,5 lần 82.200 Rõ ràng chênh lệch giá thành chế phẩm MRS Broth môi trường thay lớn Mức độ chênh lệch nâng lên cần chuẩn bị lượng lớn môi trường dinh dưỡng Kết hợp kết so sánh yếu tố môi trường MRS môi trường thử nghiệm rút kết luận sử dụng mơi trường tối ưu vừa tìm để thay cho MRS phục vụ nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt -48- GVHD: TS Đặng Đức Long LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -49- GVHD: TS Đặng Đức Long KẾT LUẬN Từ kết em rút kết luận sau: - Chủng Lactobacillus plantarum mà tơi khảo sát giữ đặc tính vốn có - Lactobacillus plantarum sinh trưởng phát triển tốt môi trường MRS Vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt mơi trường có pH=6,5 300C thời gian nuôi cấy 48h - Tối ưu hóa mơi trường dinh dưỡng thay mơi trường MRS có thành phần sau: Cà chua 8% Nước dừa 16% Cao nấm men 13% Lactobacillus plantarum sinh trưởng phát triển tốt môi trường thay rẻ tiền vừa tìm pH = 6,5 36h 30 0C Tuy hiệu suất tạo sinh khối Lactobacillus plantarum môi trường MRS cao mơi trường rẻ tiền chút Nhưng mơi trường thay có nhiều đặc tính vượt trội như: giá thành thấp môi trường MRS nhiều, rút ngắn thời gian ni cấy Do dùng mơi trường rẻ tiền thay MRS để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic Kiến nghị Từ ứng dụng to lớn vi khuẩn probiotic L.plantarum ưu việt môi trường thay môi trường chế phẩm MRS em có kiến nghị nên đưa mơi trường thay vào để phục vụ việc nhân sinh khối L.plantarum Em hi vọng việc sử dụng mơi trường góp phần không nhỏ nhiều lĩnh vực SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -50- GVHD: TS Đặng Đức Long TÀI LIỆU THAM KHẢO  TÀI LIỆU TRONG NƯỚC [1] Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ vi sinh tập 2, 2002, NXB Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh [2] Bài giảng Cơng nghệ vi sinh vật trường cao đẳng Lương Thực – Thực phẩm [3] Lê Ngọc Tú (2003), Hóa sinh cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa học kỷ thuật, Hà Nội [4] Giáo trình Kỹ thuật phân tích cơng nghệ sinh học trường Đại học bách khoa Đà Nẵng [5] Giáo trình Mơ hình thống kê tối ưu hóa trường Đại học bách khoa Đà Nẵng  TÀI LIỆU INTERNET [6]http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/B%E1%BA%A1n_ %C4%91%C3%A3_%E1%BB%ABng_nh%E1%BA%AFc_ %C4%91%E1%BA%BFn_Probiotic_%3F! [7] http://www.tinmoi.vn/6-dieu-can-biet-ve-Probiotic-05202710.html [8] http://angi.com.vn/Desktop.aspx/Content/44/1087/ [9] http://www.scribd.com/doc/51106397/Probiotics#download [10] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11803126-probiotic-3356/ [11] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12215182 [12] http://vi.wikipedia.org/wiki/Probiotic [13]http://www.scribd.com/doc/51106397/7/IICh%E1%BB %A7nglactobacillus [14]http://www.microbelibrarys.org/ASMOnly/details.asp?id=2566&Lang [15] http://www.scribd.com/doc/60789260/bai-%C4%91%E1%BB%93- an-huan SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -51- GVHD: TS Đặng Đức Long [16] http://www.bacferm.com.au/silac/micro/micro.html [17] http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0740002090900149 [18] http://www.sid.ir/en/VEWSSID/J_pdf/82220093102.pdf [19] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18990201 [20] http://scialert.net/fulltext/?doi=ijds.2007.275.280&org=10 [21]http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showpost.php? p=48219&postcount=2 [22] http://vi.wikipedia.org [23]http://www.hua.edu.vn:85/cnts/index.php? option=com_content&task=view&id=1739&Itemid=330 [24] http://www.yakult.vn/news/detail/id/100/Hoi-thao-vi-khuan-duong- ruot-lan-thu-19,-va-hoi-nghi-yakult-Shitora-lan-6 [25]http://sidmaaldrich.com/catalog/product/fluka/69966? lang=en®ion=US [26]http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/92144? lang=en®ion=VN SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Đặng Đức Long PHỤ LỤC 1: MỘT SỐ THIẾT BỊ THƯỜNG DÙNG TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU a Cân kỹ thuật c Nồi hấp tiệt trùng b Máy đo pH d Tủ ấm f Máy nuôi cấy lắc e Tủ cấy nước g Máy đo mật độ quang Số hiệu hình Tên hình SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt Trang LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Đặng Đức Long 1.1 Tác động probiotic lên hệ miễn dịch 1.2 Tác động probiotic lên vi khuẩn đường ruột 1.3 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum 14 3.1 Kết hoạt hóa Lactobacillus plantarum từ effpendoft sang môi trường dinh dưỡng MRS với độ pha lỗng 10-7 24 3.2 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus plantarum quan sát kính hiển vi 25 3.3 Cấy chuyển Lactobacillus plantarum từ môi trường MRS đĩa thạch sang môi trường MRS lỏng 25 3.4 Đường cong sinh trưởng Lactobacillus plantarum môi trường thử nghiệm 26 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 Kết trải đĩa đếm khuẩn lạc môi trường thử nghiệm thời điểm 12h sau cấy giống (độ pha loãng 10-3) Kết trải đĩa đếm khuẩn lạc môi trường thử nghiệm thời điểm 36h sau cấy giống (độ pha loãng 10-6) Kết trải đĩa đếm khuẩn lạc môi trường thử nghiệm thời điểm 48h sau cấy giống Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng yếu tố cà chua đến lượng sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum tạo thành Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng yếu tố nước dừa đến lượng sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum tạo thành Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng yếu tố cao nấm men đến lượng sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum tạo thành Đường cong biểu diễn mối tương quan giá trị OD mật độ tế bào (số khuẩn lạc) Kết so sánh hiệu tạo sinh khối Lactobacillus plantarum môi trường MRS môi trường rẻ tiền 28 29 30 32 33 34 38 45 DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Số hiệu bảng 1.1 GVHD: TS Đặng Đức Long Tên bảng Trang Những vi sinh vật dùng làm probiotic người 13 2.1 Thành phần môi trường thử nghiệm 20 3.1 Mức, khoảng biến thiên yếu tố ảnh hưởng 35 3.2 Ma trận thực nghiệm TYT23 kết đo mật độ quang thí nghiệm 36 3.3 Kết giá trị OD số tế bào vi khuẩn 1µl nồng độ pha loãng 37 3.4 Mối tương quan giá trị OD số khuẩn lạc 38 3.5 Ma trận thực nghiệm TYT23 số lượng khuẩn lạc thí nghiệm 39 3.6 Bảng giá trị ttn tính theo chuẩn Student 41 3.7 Bảng kết tổng bình phương độ lệch giá trị hàm mục tiêu theo thực nghiệm giá trị hàm mục tiêu tính theo phương trình hồi quy 3.5 42 3.8 Kết kiểm chứng lại điều kiện môi trường tối ưu vừa tìm 44 PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Đặng Đức Long Bảng 2.1 Kết đo OD môi trường thử nghiệm Thời gian Môi trường 0h 12h 24h 36h 48h Nồng độMT1 cà chua 6% 0,006 8% 0,008 10% 0,018 12% 0,034 14% 0,032 Mật độ tế bào (OD) 0,042 0,085 MT2 0,004 0,005 0,061 0,063 0,033 0,084 0,02 0,084 Nồng độ nước dừa 4% 7% 10% 13% 16% MT3 0,005 0,014 0,044 0,083 0,080 Mật độ tế bào (OD) 0,054 0,058 0,063 0,081 0,079 Bảng 2.3 Kết đo OD khảo sát đơn biến ảnh hưởng nước dừa Kết men khuẩn biến ảnh hưởng 16% 4% 10% 13% Nồng độ caođến lượngđo OD khảo 7% đơnL.plantarum tạo thành cà Bảng 2.2 nấm sinh khối vi sát Bảng 2.4 đến lượng sinh0.04 vi 0.068 biến ảnh0.065thành cao Kết đo ODkhối sát đơn L.plantarumhưởng khảo khuẩn 0.077 0.056 chua tạo Mật độ tế bào (OD) nấm men đến lượng sinh khối vi khuẩn L.plantarum tạo thành MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử probiotic 1.2 Định nghĩa probiotic 1.3 Cơ chế tác động probiotic 1.4 Chức probiotic 1.5 Các tiêu để chọn vi sinh vật làm Probiotic 1.6 Một số lĩnh vực ứng dụng probiotic 1.7 Tình hình nghiên cứu sản phẩm probiotic: 11 1.7.1 Những nghiên cứu nước 11 1.7.2 Những nghiên cứu nước .12 1.8.1.Chủng Bifidobacterium 13 1.8 Các chủng vi khuẩn Lactic 13 1.9 Tổng quan Lactobacillus plantarum 14 1.9.1 Đặc điểm chung Lactobacillus plantarum .14 1.9.2.Vai trò L.plantarum 15 1.9.3 Các hoạt tính Lactobacillus plantarum 15 SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Đặng Đức Long 1.9.4 Ứng dụng L.plantarum 17 PHẦN 2: 17 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 Quy trình thực đề tài 17 2.2 Đối tượng nghiên cứu, dụng cụ thiết bị 18 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 18 2.2.2.1 Dụng cụ 18 2.2.2.2.Thiết bị 19 2.2.3 Môi trường nuôi cấy .19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp hoạt hóa Lactobacillus plantarum 20 2.3.1.1 Hoạt hóa vi khuẩn L.plantarum 20 2.3.1.2 Cấy chuyển giống vi khuẩn từ đĩa petri sang mơi trường lỏng bình tam giác 20 2.3.2 Phương pháp xác định mật độ tế bào 21 2.3.2.1.Phương pháp trải đĩa đếm khuẩn lạc 21 2.3.2.2 Phương pháp đo mật độ quang 21 2.3.2.3.Phương pháp chọn lọc mơi trường thích hợp mơi trường thử nghiệm 21 2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa mơi trường ni cấy .23 PHẦN 3: 24 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 24 3.1.Kết hoạt hóa chủng L.plantarum 24 3.2 Quan sát hình thái vi khuẩn L.plantarum kính hiển vi 24 3.3.Kết cấy chuyển vi khuẩn sang môi trường lỏng .25 3.4 Kết khảo sát sinh trưởng phát triển Lactobacillus plantarum môi trường thử nghiệm 25 3.5 Tối ưu hóa môi trường quy hoạch thực nghiệm 30 3.5.1 Khảo sát đơn biến yếu tố ảnh hưởng đến mật độ tế bào dịch nuôi cấy 31 3.5.1.1 Đặt vấn đề công nghệ 31 3.5.1.2 Ảnh hưởng cà chua .31 SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP GVHD: TS Đặng Đức Long 3.5.1.3.Ảnh hưởng nước dừa 32 3.5.1.4.Ảnh hưởng cao nấm men .33 3.5.2.Tìm điều kiện tối ưu .34 3.5.2.1 Tính hệ số b theo cơng thức (3.3) 39 3.5.2.2 Kiểm tra ý nghĩa hệ số b phương trình hồi quy 40 3.5.2.3.Kiểm tra tương thích phương trình hồi quy 41 3.5.3 Tiến hành nhân sinh khối vi khuẩn L.plantarum với thông số môi trường tối ưu vừa tìm được: 44 3.5.4 Đánh giá hiệu môi trường tối ưu so với môi trường MRS: 44 3.5.4.1 So sánh hiệu tăng sinh khối 44 3.5.4.2.So sánh hiệu kinh tế .46 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 SVTH: Nguyễn Thị Ánh Nguyệt LỚP 10SHLT ... trường rẻ tiền thay MRS để nhân sinh khối vi khuẩn Lactobacillus plantarum phục vụ sản xuất chế phẩm probiotic Kiến nghị Từ ứng dụng to lớn vi khuẩn probiotic L .plantarum ưu việt môi trường thay. .. sang môi trường MRS lỏng Nuôi cấy giống vào môi trường thử nghiệm rẻ tiền So sánh kết thu từ mơi trường để tìm mơi trường thích 2: thay cho MRS PHẦN hợp ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tối ưu. .. Những nghiên cứu nước Các sản phẩm probiotic bắt đầu người tiêu dùng biết đến thời gian gần đây, nhiên sản phẩm mẻ sản phẩm sử dụng thực phẩm chưa nghiên cứu nhiều, chủ yếu nghiên cứu chăn nuôi