KĨ THUẬT BẢO QUẢN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Bảo quản đông lạnh là kĩ thuật trữ tế bào và mô sống ở điều kiện nhiệt đ ộ thấp trong một th ời gian rất dài. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (196 0 C), hầu hết mọi ph ản ứng hoá học đều không xảy ra, tất cả hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại. Các phân tử nước lúc này tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự tổn hại nào cho tế bào được trữ. Theo cách này thì tế bào và mô có thể hồi phục sự phát triển bất cứ khi nào con người cần sử dụng. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng tới tế bào là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên, trên thực tế yếu tố này không quan trọng. Một số nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi giải đông, chuột con sinh ra không có dị tật b ẩm sinh nào.

1

CHƯƠNG 8

KĨ THUẬT BẢO QUẢN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

ThS Đặng Thị Tùng Loan

PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Tp.HCM

I GIỚI THIỆU

1 Khái niệm

Bảo quản đông lạnh là kĩ thuật trữ tế bào và mô sống ở điều kiện nhiệt độ thấp trong một thời gian rất dài Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-1960C), hầu hết mọi phản ứng hoá học đều không xảy ra, tất cả hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại Các phân tử nước lúc này tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự tổn hại nào cho tế bào được trữ Theo cách này thì tế bào và mô có thể hồi phục sự phát triển bất cứ khi nào con người cần sử dụng

Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng tới tế bào là bức xạ từ môi trường Tuy nhiên, trên thực tế yếu tố này không quan trọng Một số nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi giải đông, chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào

2 Mục đích

(1) Giảm thiểu sự biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền

(2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào

(3) Ngăn cản quá trình biệt hoá tế bào

(4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào

(5) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong in vitro

(6) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái

(7) Giảm chi phí nuôi cấy

(8) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng

(9) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen

(10) Thuận lợi cho vận chuyển

(11) Thuận lợi cho việc thương mại hoá

(12) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng một lúc, cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức

II SINH HỌC ĐÔNG LẠNH

1 Cơ sở khoa học của bảo quản đông lạnh

1.1 Các biến đổi của tế bào trong bảo quản bằng phương pháp đông lạnh

1.1.1 Sự hình thành tinh thể nước đá

Khi nhiệt độ hạ thấp, sự xuất hiện những tinh thể nước đá đầu tiên là dấu hiệu bắt đầu của sự biến đổi giai đoạn Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ bên trong tế bào bằng với độ

hạ băng điểm của dung dịch mà băng điểm của dung dịch này lại phụ thuộc vào nồng độ của chất hòa tan Tuy nhiên, nồng độ bên trong tế bào đậm đặc hơn bên ngoài tế bào nên sự biến đổi giai đoạn ở bên trong tế bào được xảy ra ở một nhiệt độ thấp hơn ở bên ngoài tế bào Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường ngoài tế bào, vì vậy nồng độ chất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển động ra ngoài tế bào và dung tích tế bào giảm Tốc độ mất nước của tế bào lại phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh Ở trên tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả năng tạo băng đá nội bào tăng; những tinh thể nước đá tăng kích thước và do đó, sự tổn hại tế bào cũng nhiều hơn Ngược lại, ở dưới tốc độ giới hạn, sự sống của tế bào giảm do nồng độ của chất hoà tan nội bào tăng lên Người ta nhận thấy trong môi trường huyền phù, nước biến đổi chậm hơn và sự mất nước nội bào được duy trì sao cho có sự cân bằng thẩm thấu với môi trường bên ngoài, do

2

đó sẽ gây tổn hại tế bào ít hơn Sự có mặt của băng đá nội bào và “hiệu ứng của dung dịch” là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, quyết định khả năng sống của tế bào

Sự hoạt động phối hợp của 4 yếu tố sau đây quyết định hình dạng tinh thể nước đá được tạo thành trong quá trình đông lạnh:

 Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn

 Tốc độ làm lạnh

 Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch

 Nồng độ dung dịch

Hình 1 Sự hình thành tinh thể đá

Ở môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đá thường hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15o

C Tuy nhiên, đá chỉ tạo thành tự nhiên ở nhiệt độ

-10oC Ở nhiệt độ -5 đến -10oC cần có điều kiện kết hợp Đó là sự tham gia của một phần nhỏ chất rắn (ví dụ như hạt bụi hoặc tinh thể đá nhân tạo) Sự tạo đá càng tăng khi nhiệt độ càng giảm Ở nhiệt độ khoảng -130oC, tất cả chất liệu không còn ở dạng lỏng mà đều ở dạng hạt kết tinh hay dạng thủy tinh.Đây là hiện tượng kết tinh hóa hay còn được gọi là thủy tinh hóa Hiện tượng này xảy ra do môi trường có pha chất hoà tan cũng như chất bảo quản đông lạnh

có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan

3

Hình 2 Sự biến đổi vật lý của tế bào khi đông lạnh

A Không có chất bảo quản lạnh, B Có chất bảo quản lạnh

Sự tăng thêm nồng độ của các chất hoà tan trong môi trường đông lạnh ảnh hưởng đến việc hình thành những tinh thể nước đá Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượng nước ở thể lỏng giảm đi Do đó, nồng độ các chất hoà tan tăng lên gây mất cân bằng về áp suất thẩm thấu, kéo nước bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng tế bào

Việc tăng nhiệt độ tiềm năng cũng là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá.Phân

tử nước khi chuyển từ thể lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra một nhiệt lượng Nếu nhiều phân tử cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ của môi trường đang từ vài độ âm lên lại 0oC Thay đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau

khi giải đông

1.1.2 Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh

Nhiệt độ chính xác để kết tinh và thủy tinh hóa hoàn toàn phụ thuộc vào phức hợp có trong nước Trong dung dịch NaCl có cùng một áp suất, hiện tượng thủy tinh hóa xảy ra ở nhiệt độ -20oC đến -30o

Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti Vì vậy, trước khi đạt đến điểm này NaCl vẫn ở dạng dung dịch Số lượng phân tử nước có ở dạng dung dịch giảm xuống cùng với nhiệt độ, kết quả trực tiếp là giảm độ thẩm thấu của môi trường, môi trường trở nên ưu trương

Hình 3 Khi nhiệt độ của dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm đông,

hiện tượng kết tinh đá và nồng độ NaCl tăng lên

Làm lạnh ở nhiệt độ xấp xỉ 0oC làm giảm sự khuếch tán một chiều của protein màng

Ở những nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng độ muối cao, nhất là trong quá trình đông lạnh chậm Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự co thể tích trong quá trình mất nước Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ các ion tăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy cảm với các stress trong quá trình đông lạnh khi nhiệt độ giảm (choc thermique) hoặc khi pha loãng môi trường (choc de la dilution) trong quá trình giải đông

1.1.3 Tốc độ khử nước

4

Tốc độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố Các yếu tố này thay đổi khác nhau tùy theo từng loại tế bào và vì vậy đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình bảo quản đông lạnh ở điều kiện tốt nhất Các yếu tố liên quan là tính thấm nước của màng tế bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước này (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích của tế bào (SA/V)

Bằng cách đo tỉ lệ thay đổi về diện tích bề mặt tế bào và thể tích tế bào ở các độ thẩm thấu khác nhau, có thể xác định được tính thấm của màng tế bào (Lp) Diện tích bề mặt càng lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) càng lớn Đối với hầu hết các tế bào của đông vật có vú, tính thấm của màng tế bào (Lp) có giá trị khoảng 0.43

m3/m2.phút.atmosphere Tuy nhiên, đối với hồng cầu và tinh trùng thì tính thấm của màng tế bào (Lp) lớn hơn nhiều Điều này có nghĩa là hồng cầu và tinh trùng mất nước nhanh hơn trong dung dịch ưu trương; do đó, tốc độ bảo quản đông lạnh tốt nhất đối với loại tế bào này

là rất quan trọng

Yếu tố quan trọng thứ hai trong quá trình khử nước là năng lượng hoạt hóa cho tính thấm nước (dH*) Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả năng thấm nước Trước đây, bằng cách đo tính thấm của màng tế bào (Lp) ở các nhiệt độ khác nhau để xác định dH* đối với trứng Về thực hành, đây là khoảng nhiệt độ trên điểm đông lạnh Kết quả đo được là 14.5 Kcal/mol Giá trị này tương đối cao và nói chung, nhiệt độ cứ hạ 10oC thì tốc độ khử nước sẽ giảm một nửa

Cuối cùng, tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích cũng góp phần quan trọng đối với tốc

độ khử nước của tế bào Nếu tỉ lệ này cao thì tế bào sẽ khử nước nhanh hơn

Hình 4 Tốc độ mất nước của tế bào trong môi trường ưu trương phụ thuộc vào nhiệt độ

1.1.4 Sự giảm thể tích thực của tế bào

Sự thay đổi thể tích tế bào có thể đo được để biểu thị quá trình khử nước Quá trình khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) của tế bào Các giá trị này phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh Dựa trên cơ sở tính toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác định được ở các tốc độ làm lạnh khác nhau Vì vậy, ở tốc độ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều, và thể tích tế bào không giảm nhiều như

5

ở tốc độ làm lạnh thấp Tốc độ làm lạnh thấp sẽ làm cho tế bào mất nước Tuy nhiên, thể tích giảm thực sự ít hơn so với tính toán, điều này có thể là do sai lầm trong phép ngoại suy đối với năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định ở nhiệt độ trên điểm đông lạnh)

Hình 5 % khối lượng tế bào giảm so với khối lượng ban đầu ở các nhiệt độ khác nhau

Các đường cong tương ứng với tốc độ làm lạnh khác nhau

Hình 6 % khối lượng tế bào giảm so với khối lượng ban đầu được tính (đường liền)

và được ghi lại bằng thực nghiệm (dường đứt)

1.1.5 Sự giảm tốc độ hoạt động của Enzyme

Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37oC xuống còn 7oC, hoạt động của enzyme giảm 8 lần Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử phản ứng Từ 20oC, tốc độ phản ứng enzyme giảm theo nhiệt độ một cách ổn định theo trình

tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 10oC (Q10) Tuy nhiên, trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt

độ thì sự thay đổi tốc độ phản ứng enzyme (ở nhiệt độ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn đến

sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein Các chất bảo quản đông lạnh có thể đề phòng sự biến đổi này

1.1.6 Độ pH của dung dịch

Trong quá trình đông lạnh, độ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt độ, sự cân bằng acid – base của môi trường biến đổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa của các hợp chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng (salting out) Các chất bảo quản đông lạnh có thể biến đổi cân bằng acid – base của dung dịch, chẳng hạn như glycerol và các glycol hoạt động như những base yếu, ester hoạt động như base mạnh (DMSO chẳng hạn) Sự biến đổi độ pH của dung dịch theo nhiệt độ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản được sử dụng: với nồng độ DMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH của dung dịch PBS tăng nhanh, nhưng lại ổn định hơn với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%)

độ pH của dung dịch PBS và glycerol ổn định, trong khi đó, pH dung dịch đệm Tris có sự thay đổi nổi bật Tuy nhiên, pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc vào nhiệt độ Người ta nhận thấy rằng tế bào có thể sống sau bảo quản ở nhiệt độ xấp xỉ 0oC với pH trên 9

1.1.7 Sự hình thành bọt khí

Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành đá Hơn nữa, tinh thể nước đá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị đông lạnh tăng lên (tỉ trọng của đá thấp hơn

tỉ trọng của nước) Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giải đông tế bào Năm 1988, Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác động của sự hình thành đá Kích thước của bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm và tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh Số lượng bọt khí tương ứng với tốc độ làm lạnh

Bên cạnh các khí hoà tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO2

làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng

6

hoà tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại tế bào Trong quá trình giải đông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành không bào lớn bên trong tế bào, làm tế bào phình to Trong thực tế, bọt khí hình thành rất nhanh, dẫn đến vỡ tế bào

Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường đông lạnh có chứa bicarbonat

Vì vậy, PBS thường được sử dụng hơn

1.2 Thuyết hai yếu tố

Căn cứ vào những quan sát thực nghiệm về mối quan hệ giữa sự sống sót của tế bào với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đã đưa ra giả thuyết hai yếu tố về những tổn thương khi đông lạnh tế bào Hai yếu tố này đã đặt nền tảng cơ sở cho hai cơ chế khác nhau, và có thể chúng là các nguyên nhân trực tiếp, gây ra những tổn hại cho tế bào, trong suốt quá trình tiến hành đông lạnh và lưu giữ

Bảng 30.1 Khả năng phản ứng của tế bào khi gặp phải các tác nhân gây stress trong tiến

trình đông lạnh

bộ xương tế bào Gia tăng nồng độ các chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu

tan của màng protein

Tính nhớt môi trường tăng Quá trình khuếch tán, kể cả sự thẩm thấu bị hạn chế

(1) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh chậm, sự tổn thương xảy ra do những tác động dung dịch (ví dụ như nồng độ chất tan/chất điện li, sự mất nước của tế bào nhanh đột ngột, và sự giảm phần không bị đóng đá trong khoảng không ngoại bào)

(2) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh nhanh, sự tổn thương do hình thành

đá nội bào gây chết Nhiệt độ làm lạnh tối ưu cho sự sống sót của tế bào phải đủ thấp để tránh

sự hình thành đá nội bào, nhưng cũng phải đủ cao để giảm đến mức tối thiểu những tác động của dung dịch

Thuyết 2 yếu tố

Hình 7 Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh lên sức sống tế bào

Quy trình đông lạnh-giải đông tối ưu

Tổn thương

“dung dịch”

Tổn thương

đá nội bào

Tốc độ làm lạnh Sức sống

7

Hình 7 mô tả nhiệt độ làm lạnh tối ưu, ở đó hai yếu tố gây thiệt hại được giữ một cách cân bằng, và xác suất sống của tế bào đạt đến một giá trị cực đại Những giá trị tốt nhất cho tất

cả các quá trình làm lạnh hữu dụng có thể được giải thích trong giới hạn của sự cân bằng giữa tác động dung dịch và sự hình thành đá nội bào

Mặc dù, từ những bằng chứng thực nghiệm đều thấy rằng, thuyết hai yếu tố nói trên như là một lời giải thích hiển nhiên, hợp lí về sự tổn thương của tế bào trong suốt quá trình làm lạnh, nhưng phương pháp bảo quản bằng đông lạnh tốt nhất sẽ khác nhau tuỳ vào từng loại tế bào

Bổ sung thêm cho hai cơ chế tổn thương này, còn có những cơ chế khác đáng quan tâm, chẳng hạn sự làm lạnh cũng có thể gây nên tổn thương hệ miễn dịch và kích hoạt tế bào chết theo chương trình (apoptosis), có thể những vấn đề nêu trên cũng là nguyên nhân gây ra

sự tổn thương tế bào

Tế bào ít khi tiếp xúc trực tiếp với các tinh thể nước đá, và đúng hơn là chúng tập hợp vào những nơi không có sự đóng băng, đồng thời cũng chính tại các vị trí này, tế bào được cô lập bởi các tác nhân vật lý, và điều này đã tạo nên các stress cho tế bào Đó là sự phản ứng tự nhiên của tế bào đối với các tác nhân này để chúng có thể sống sót và tồn tại

Tế bào phải chịu tác động của những tác nhân nói trên và luôn luôn thay đổi trong suốt quá trình đông lạnh Tuy nhiên, các phản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất là yếu tố có tính quyết định đầu tiên cho sự tồn tại của tế bào Trong những môi trường ưu trương, tế bào sẽ gặp phải sự mất tính thấm với nước, giới hạn tổn thương này phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh Sức chịu đựng của tế bào khi đông lạnh tại những thang nhiệt độ chậm sẽ phụ thuộc vào khả năng của tế bào, nhằm chống lại sự thâm nhập của các tác nhân stress

Sức chống chịu của tế bào trước áp lực của sự tăng khuếch tán nước, khi nhiệt độ làm lạnh tăng và những thành phần của tế bào có thể chậm đông hơn, trước khi tất cả những phần nước đóng băng bị loại thải Dưới những điều kiện này, tế bào co lại và sự tổn thương màng

sẽ giảm đến mức tối thiểu Những hiện tượng này xảy ra khi tốc độ làm lạnh được cho là tốt nhất

2 Chất bảo quản đông lạnh

2.1 Định nghĩa

Là những chất tan được trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với phân tử nước và có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào

2.2 Tác dụng

 Thâm nhập và thay chỗ cho nước bên trong tế bào

 Giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào

 Giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đa

 Hạn chế sự gia tăng nồng độ của các chất hoà tan

 Kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào

2.3 Đặc tính của chất bảo quản đông lạnh

 Có thể thấm qua màng tế bào một cách bị động

 Có khả năng hoạt động thay thế nước

 Chỉ độc với tế bào ở nồng độ cao

2.4 Phân loại

Trong quá trình đông lạnh, tế bào chỉ có khả năng sống được nếu trong môi trường có chất bảo quản đông lạnh thích hợp Hiệu quả của từng chất bảo quản đông lạnh lên từng loại

tế bào rất khác nhau Các loại chất bảo quản đông lạnh thường được sử dụng trong trữ tế bào:

 Glycerol

 DMSO (Dimethyl sulfoxide)

 1,2-propanodiol (propylene glycol)

 1,2-ethalnediol (ethylene glycol)

8

2.5 Nguyên tắc hoạt động của chất bảo quản đông lạnh

Hoạt động của chất bảo quản đông lạnh thể hiện qua 2 hiện tượng “khử nước” trong quá trình đông lạnh và “bù nước “ trong quá trình giải đông

2.5.1 Sự khử nước

Theo nguyên tắc, phôi ở môi trường nuôi cấy có sử dụng chất bảo quản đông lạnh phải trải qua phản ứng thẩm thấu, vì vậy sẽ mất nước Sau một thời gian (thời gian này nhanh hơn khi ở nhiệt độ cao so với ở nhiệt độ thấp), tế bào hấp thụ chất bảo quản đông lạnh và trở lại thể tích ban đầu Khi tế bào trở lại thể tích bình thường thì quá trình đông lạnh bắt đầu Do có

sự bổ sung chất bảo quản đông lạnh nên nước trong tế bào có ít hơn và do đó, ít hình thành tinh thể đá hơn

Hình 8 Khối lượng tế bào phôi tương ứng trong quá trình A.Trữ trong nitơ lỏng B Tan đông

C Tái thủy hợp D Trong môi trường nuôi cấy

2.5.2 Sự bù nước

Sau khi tan đông, trong quá trình bù lại nước, phản ứng của phôi hoàn toàn ngược lại Quá trình này diễn ra chậm Nếu có quá ít chất bảo quản đông lạnh trong môi trường bù nước,

tế bào sẽ phồng lên và vỡ do áp suất thẩm thấu trong tế bào cao Vì vậy, quá trình bù nước xảy ra từng bước một, tế bào được nuôi trong môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh giảm dần Mỗi lần như vậy, thể tích của phôi tăng lên do hấp thu nước, rồi trở lại bình thường

do chất bảo quản đông lạnh thoát ra

2.5.3 Các chất không thấm

Chất không thấm là những đại phân tử tuy không xâm nhập tế bào nhưng cũng được xem như những chất bảo quản đông lạnh, được dùng kèm với những chất bảo quản đông lạnh nội bào Các chất không thấm hoạt động phối hợp với các chất bảo quản đông lạnh, làm giảm

áp suất thẩm thấu bên ngoài tế bào, dẫn đến hiện tượng chất bảo quản đông lạnh thoát ra nhiều hơn Do đó, tế bào được bảo vệ tránh khỏi các tổn thương do tế bào bị phình to trong quá trình bù nước

Các chất không thấm thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide Sucrose và dextran được sử dụng phổ biến

Hình 9 Sự thay đổi khối lượng tế bào trong quá trình đông lạnh có sử dụng kèm sucrose ở

các quá trình

9

A Trữ trong nitơ lỏng B Tan đông

C Tái thủy hợp khi có đường sucrose D Trong môi trường nuôi cấy

2.6 Nồng độ chất bảo quản đông lạnh

Tất cả chất bảo quản đông lạnh đều là những chất gây độc cho tế bào Việc sử dụng chúng phù hợp cho từng loại tế bào, từng giai đoạn của tế bào cũng như sử dụng với một nồng

độ thích hợp là rất quan trọng Các tính chất của chất bảo quản đông lạnh như: khả năng thấm được vào trong tế bào, tính độc đối với tế bào, cũng như những ảnh hưởng sinh học trên tế bào sẽ được xác định trên thực nghiệm để đánh giá, lựa chọn chất bảo quản tốt nhất

Độ đậm đặc của các chất bảo quản đông lạnh tăng lên khi nhiệt độ giảm Điều này dẫn đến độ nhớt của dung dịch tăng, từ đó, chuyển động của nước và sự xáo trộn của các thành phần trong dung dịch giảm

III KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1 Nguyên, vật liệu được dùng trong đông lạnh

1.1 Môi trường đông lạnh

Môi trường đông lạnh và giải đông được lọc vô trùng với phin 0,22 µm và giữ ở nhiệt

độ 40

C, được sử dụng ở nhiệt độ phòng trong 48h Ngoài chất bảo quản đông lạnh, các chất được bổ sung vào môi trường bảo quản bao gồm:

1.1.1 HEPES

Vì quá trình đông lạnh và làm tan đông được thực hiện ngoài tủ ấm CO2 nên môi trường có đệm HEPES thường được sử dụng Môi trường này có thể là môi trường nuôi cấy

1.1.2 Huyết thanh

Mặc dù vai trò của huyết thanh trong trữ lạnh tế bào chưa được làm rõ Một số nghiên cứu chứng tỏ rằng khi sử dụng môi trường có bổ sung huyết thanh, sau giải đông, khả năng sống của tế bào tăng; đối với tế bào phôi, ngoài sức sống tế bào tăng, tỉ lệ có thai cũng như tỉ

lệ thai làm tổ sau khi chuyển phôi cũng gia tăng Tuy nhiên, việc dùng huyết thanh trong trữ lạnh làm gia tăng nguy cơ các bệnh truyền nhiễm cũng như phải chấp nhận tính không ổn định của huyết thanh với rất nhiều thành phần không thể xác định được

1.1.3 Kháng sinh

Việc sử dụng kháng sinh nhằm mục đích hạn chế sự nhiễm khuẩn trong quá trình đông lạnh và giải đông

1.1.4 Muối: đóng vai trò đệm sinh lí

1.1.5 Đường

Đường là nguồn cung cấp năng lượng chính và cũng được xem như một tác nhân bảo quản đông lạnh do có tương tác trực tiếp với màng tế bào Đường sẽ ngăn cản sự khử nước quá mức của màng và làm giảm sự chuyển phase của phospholipid khi hạ nhiệt độ Sucrose là một trong những loại đường được sử dụng với mục đích này

1.1.6 Một số chất khác: như Natri pyruvat, polyethylenglycol (PEG 8000), …

1.2 Ni-tơ lỏng

Ni-tơ lỏng là ni-tơ dạng khí được cô đặc lại Chúng không màu, không mùi, không dễ cháy, không độc Ni-tơ lỏng rất lạnh, có nhiệt độ là -1960

C, nhiệt độ sôi khoảng -2100C Do

đó, khi thao tác với ni-tơ lỏng phải mang găng tay và mắt kính bảo vệ

1.3 Thiết bị trữ lạnh bằng ni-tơ lỏng

Thiết bị này là những bình chứa ni-tơ lỏng được thiết kế đặc biệt

 Bình này được gắn nhôm, cô lập hoàn toàn với bên ngoài

 Cổ bình thường được làm bằng nhựa tổng hợp

 Bình chịu nhiệt và rất rắn chắc

10

Bình trữ ni-tơ lỏng có nhiều loại và thường xuyên được cải tiến nhằm phục vụ cho việc bảo quản đông lạnh một cách hiệu quả và tiện lợi hơn

Hình 10 Sự phân bố nhiệt độ trong bình trữ ni-tơ lỏng

Các thiết bị trữ lạnh nitơ lỏng cho phép trữ lạnh ở pha khí ở trên có nhiệt độ từ

-140oC đến -180o

C và pha lỏng ở dưới có nhiệt độ dưới -196oC Việc trữ ở pha khí làm giảm đáng kể nguy cơ rò rỉ hay nổ của các ống/tube chứa mẫu trong lúc lấy ra để giải đông Tuy nhiên, vì một lượng lớn ni-tơ lỏng bị giảm để cung cấp không gian cho việc trữ ở pha khí nên thời gian giữ lạnh (duy trì nhiệt độ trữ mà không cần bổ sung ni-tơ lỏng) giảm xuống Điều này làm giảm giới hạn an toàn và đòi hỏi phải kiểm soát và bổ sung thường xuyên Nhiệt độ trong bình chứa ni-tơ lỏng có sự khác biệt giữa các vùng, phân bố như hình 10

Những bình trữ ni-tơ lỏng có khả năng duy trì nhiệt độ dưới -130oC phù hợp với việc trữ lạnh trong thời gian dài Mặc dù hầu hết các thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng và một số thiết bị lạnh cơ học đạt được yêu cầu này, thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng vẫn được các phòng thí nghiệm nuôi cấy tế bào chuộng hơn Quyết định chọn cuối cùng thường dựa trên việc cung cấp ni-tơ lỏng ổn định, nhu cầu về khả năng trữ, và ngân sách

Điều quan trọng khi sử dụng thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng là việc kiểm tra định kì mức chất lỏng trong bình chứa Hơi khí ni-tơ phụ thuộc vào cả mức độ sử dụng và thời gian giữ tĩnh (yên lặng) của bình chứa Sự gia tăng đột ngột tỉ lệ khí có thể gây ra nhiều vấn đề cho bình trữ Sự hình thành đá hay tuyết bên ngoài cổ bình có thể làm gia tăng tỉ lệ khí ni-tơ và làm tăng nhiệt độ của phần trên của pha khí trong bình