Luận án tiến sĩ sinh học Phạm Văn Phúc Chuyên ngành: Sinh lý Người và Động vật Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM Ung thưvú (UTV) là một bệnh phức tạp. Nhiều nghiên cứu đã tiến hành đểtìm ra nguyên nhân và phương pháp điều trị căn bệnh này. Trong 20 năm qua, tỉlệtửvong do UTV đã giảm nhiều. Sựgiảm này là do sựphát triển các kĩthuật chẩn đoán sớm và các liệu pháp trị liệu hiệu quả, kểcảcác liệu pháp bổtrợ. Tuy nhiên, vẫn có đến 50% khối u vú không đáp ứng thuốc, cũng nhưkháng với các liệu pháp này và có hơn 70% bệnh nhân sẽtái phát sau 5 năm điều trị. Nguyên nhân của tình trạng này là sựtồn tại của tếbào gốc ung thưvú (TBGUTV) trong tất cảcác khối u vú. Những TBGUTV được cho là nguồn gốc của các khối u và đóng góp vào sựdi căn và tái phát trong bệnh nhân UTV. Do đó, liệu pháp tấn công vào TBGUTV được xem là liệu pháp mới và hứa hẹn.
Trang 19 Pham PV, Vu NB, Duong TT, Nguyen TT, Truong NH,
Phan NLC, Vuong TG, Pham VQ, Nguyen HM, Nguyen KT,
Nguyen NT, Nguyen KG, Khat LT, Le DV, Truong KD, Phan NK
(2012) “Suppression of human breast tumors in NOD/SCID mice by
CD44 shRNA gene therapy combined with doxorubicin treatment”
OncoTargets and Therapy 2012(5), pp.77-84
!
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHẠM VĂN PHÚC
PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ VÚ NGƯỜI VIỆT NAM VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM
Chuyên ngành: Sinh lý Người và Động vật
Mã số: 62 42 30 01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Tp Hồ Chí Minh năm 2012
!
Trang 2Công trình được hoàn thành tại
PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp.HCM
Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS Trương Đình Kiệt
TS.BS Lê Văn Đông
Phản biện 1: GS.TS Trần Linh Thước
Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Sào Trung
Phản biện 3: TS Huỳnh Nghĩa
Phản biện độc lập 1: PGS.TS Trần Cát Đông
Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Đăng Quân
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào
tạo họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia
Tp.HCM vào hồi 14 giờ 00 ngày 16 tháng 11 năm 2012
Có thể tìm hiểu luận án này tại thư viện:
1 Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
2 Thư viện Trường Đại học KHTN, Đại học Quốc gia
Tp.HCM
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
1 Phạm Văn Phúc, Lê Thành Trung, Trương Hải Nhung, Vương Gia Tuệ, Dương Thanh Thủy, Phan Kim Ngọc (2010) “Thu
nhận tế bào ung thư từ khối u vú”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 8(4),
tr.1775-1783
2 Phạm Văn Phúc, Chi Jee Hou, Lê Văn Đông, Trương Đình Kiệt, Phan Kim Ngọc (2010) “Biệt hóa in vitro tế bào đơn nhân từ
máu cuống rốn người thành tế bào tua”, Tạp chí Công nghệ sinh học,
8(3B), tr.1111-1120
3 Pham Van Phuc, Tran Thi Thanh Khuong, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet, Tran Tung Giang and Phan Kim Ngoc (2010)
“Isolation and characterization of breast cancer stem cells from
malignant tumours in Vietnamese women”, Journal of Cell and Animal Biology, 4(12), pp.163–16
4 Pham Van Phuc, Siah Chia Keng, Nguyen Thi Minh Nguyet, Duong Thanh Thuy, Phan Kim Ngoc (2010) “Isolation and comparison of tumorigenicity of different cell population in MCF-7
breast cancer cell line based on CD44 and CD24 markers”, Journal
of Biotechnology, 8(4), pp.13-19
5 Phuc PV, Lam DH, Ngoc VB, Thu DT, Nguyet NTM, Ngoc
PK (2011) “Production of functional dendritic cells from menstrual
blood—a new dendritic cell source for immune therapy”, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 47(5-6), pp.368-375
6 Pham Van Phuc, Chi Jee Hou, Nguyen Thi Minh Nguyet, Duong Thanh Thuy, Le Van Dong, Truong Dinh Kiet and Phan Kim Ngoc (2011) “Effects of breast cancer stem cell extract primed dendritic cell transplantation on breast cancer tumor murine
models”, Annual Review & Research in Biology, 1(1), pp.1-13
7 Phuc PV, Nhan PLC, Nhung TH, Tam NT, Hoang NM, Tue
VG, Thuy DT, Ngoc PK (2011) “Downregulation of CD44 reduces doxorubicin resistance of CD44+CD24- breast cancer cells”,
OncoTargets and Therapy, 4, pp.71-7
8 Phuc V Pham, Nhan LC Phan, Nhung T Nguyen, Nhung H Truong, Thuy T Duong, Dong V Le, Kiet D Truong and Ngoc K Phan (2011) “Differentiation of breast cancer stem cells by
knockdown of CD44: promising differentiation therapy”, Journal of Translational Medicine, 9(1), p.209
Trang 31
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú (UTV) là một bệnh phức tạp Nhiều nghiên cứu đã tiến hành để tìm ra nguyên nhân và phương pháp điều trị căn bệnh này Trong 20 năm qua, tỉ lệ tử vong do UTV đã giảm nhiều Sự giảm này là do sự phát triển các kĩ thuật chẩn đoán sớm và các liệu pháp trị liệu hiệu quả, kể cả các liệu pháp bổ trợ Tuy nhiên, vẫn có đến 50% khối u vú không đáp ứng thuốc, cũng như kháng với các liệu pháp này
và có hơn 70% bệnh nhân sẽ tái phát sau 5 năm điều trị Nguyên nhân của tình trạng này là sự tồn tại của tế bào gốc ung thư vú (TBGUTV) trong tất cả các khối u vú Những TBGUTV được cho là nguồn gốc của các khối u và đóng góp vào sự di căn và tái phát trong bệnh nhân UTV Do đó, liệu pháp tấn công vào TBGUTV được xem là liệu pháp mới và hứa hẹn
Trong 5-10 năm qua, nhiều đặc điểm của tế bào gốc ung thư (TBGUT) đã được xác định và sử dụng như đích tấn công trong một
số chiến lược trị liệu Vài đích tấn công trên TBGUTV đã được sử dụng thử nghiệm lâm sàng; trong số đó đã có một số đã được phát triển trở thành thuốc điều trị thường quy cho UTV Tuy nhiên, vì sự phức tạp trong kiểu hình của UTV giữa các chủng tộc và vùng địa lý,
mà hiệu quả điều trị UTV bằng các liệu pháp này vẫn còn thấp Mặc
dù chưa có số liệu về hiệu quả của các liệu pháp này trong điều trị UTV trên bệnh nhân Việt Nam, các nhà nghiên cứu trên nhiều quốc gia đều cho thấy có đến hơn 50% khối u không đáp ứng với các liệu pháp này cũng như kháng thuốc Vì thế, các nghiên cứu về đặc điểm TBGUTV được phân lập từ khối u người phụ nữ Việt Nam cũng như tìm kiếm các phương pháp trị liệu mới nhằm cải thiện hiệu quả điều trị UTV ở bệnh nhân Việt Nam là cần thiết
Từ hiểu biết của mình, chúng tôi thấy rằng các liệu pháp gen
và liệu pháp miễn dịch là hai hướng điều trị phù hợp có thể được sử dụng để tấn công TBGUTV
Trang 42
Vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với tên đề tài
“Phân lập, xác định đặc điểm tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam
và bước đầu ứng dụng điều trị thực nghiệm” nhằm phát triển các
liệu pháp mới để tấn công TBGUTV dựa vào liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch
Mục tiêu của nghiên cứu
Mục tiêu chính của nghiên cứu này là:
- Phân lập và nuôi cấy được tế bào ung thư vú (TBUTV) từ khối u vú
ác tính của người Phụ nữ Việt Nam
- Phân lập và nuôi cấy TBGUTV từ các quần thể TBUTV phân lập được
- Thiết lập một số bước cơ bản trong liệu pháp gen và liệu pháp miễn
dịch để tấn công TBGUTV thực nghiệm
Vấn đề chính yếu trong nghiên cứu này là thiết lập được những dòng TBGUTV đầu tiên ở Việt Nam từ khối u vú ác tính mà nó
là nguyên liệu quan trọng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo để sử dụng liệu pháp gen và liệu pháp miễn dịch tấn công TBGUTV để điều
trị UTV
Trang 53
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Sự tồn tại TBGUT có thể giúp giải thích tại sao và làm thế nào sự thay đổi trong hóa mô của mô phản ánh các cấp độ ác tính của khối u Với các đặc điểm tương tự tế bào gốc (TBG), TBGUT có thể gây xâm lấn mạnh (bởi vì tính tự làm mới) và gây dị hợp kiểu hình biệt hóa mạnh trong khối u (bởi vì khả năng biệt hóa) (Kakarala & Wicha, 2008; Shay & Wright, 2010)
TBG trưởng thành thường tăng sinh chậm hơn các tế bào đã biệt hóa, do đó chúng có thể gia tăng tuổi thọ Vì nguyên nhân này, chúng có thể tiếp xúc với nhiều tác nhân gây đột biến hơn các tế bào biệt hóa, do đó chúng có thể tích lũy nhiều đột biến hơn Và những đột biến này có thể truyền sang các thế hệ con cháu (gọi là các tế bào tăng
sinh nhanh hay các tế bào khuếch đại chuyển tạm thời) (Dontu et al.,
2003) Điều này có nghĩa là các con cháu của những TBG trưởng thành bình thường có thể là các TBGUT Nghĩa là trong cùng một khối u nếu chúng ta có thể thu nhận cả TBG bình thường và TBGUT thì các TBGUT sẽ thừa hưởng nhiều đặc điểm của TBG bình thường Thật vậy, một số nhà nghiên cứu cho thấy rằng các TBGUT có thể chia sẻ một số con đường truyền tín hiệu với TBG cũng như một số marker Chẳng hạn, con đường truyền tín hiệu Notch biểu hiện mạnh trong cả TBGUTV và TBG tuyến vú (Farnie and Clarke, 2007) Vấn đề chính của TBGUT là khả năng tạo ra khối u từ chỉ một vài tế bào, do đó nó có thể dễ dàng gây nên tái phát và khả năng kháng mạnh với hóa chất và xạ trị Sự tái phát cao là bởi vì tính tự làm mới
và khả năng kháng mạnh với hóa chất và tia xạ Bởi vì đặc tính TBG của TBGUT có thể biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau và có thể tạo ra một khối u dị hợp về kiểu hình (Campbell & Polyak, 2007) Mặc dù tế bào trưởng thành thiếu khả năng tự làm mới và
tiềm năng tăng sinh thấp (Ginestier et al., 2007), cả tế bào trưởng thành và TBG đều có thể hình thành TBGUTV (Dontu et al., 2003)
Trang 64
Thật vậy, các tế bào trưởng thành hay các tế bào tiền thân cũng có thể
trở thành TBG thông qua quá trình khử biệt hóa – đây là quá trình mà
từ một tế bào trưởng thành có thể đạt các đặc điểm của TBG
(Cobaleda et al., 2007)
Phát hiện đầu tiên về TBGUT trong khối u vú được báo cáo
vào năm 2003 bởi Al-Hajj và cs Họ phát hiện một quần thể nhỏ các tế
bào có biểu hiện marker bề mặt là CD44+CD24-/lowESA+ và Lin
-(không biểu hiện CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 và
CD140b) Chỉ với 200 tế bào này, chúng có thể gây ra khối u khi tiêm
vào chuột NOD/SCID trong khi đó 104 tế bào không biểu hiện marker
này thì không thể gây khối u (Al-Hajj et al., 2003) Khối u này có kiểu
hình dị hợp, chứa một quần thể tế bào có kiểu hình TBG ban đầu
CD44+CD24-/dimLin- và có thể tiếp tục gây u khi cấy vào chuột liên tục
nhiều lần (Al-Hajj et al., 2003)
Sau đó kiểu hình CD44+CD24- được sử dụng để xác định và
tách TBGUT với khả năng gây u tăng cao Thật vậy, các khối cầu
(mammosphere) thu từ việc nuôi TBUTV có kiểu hình CD44+CD24
-/dim có thể gây u mạnh khi tiêm vào chuột NOD/SCID Tuy nhiên, chỉ
cần một ít tế bào CD44+CD24-/low cũng có thể hình thành nên khối cầu
(Ponti et al., 2005) Thật vậy, các dòng TBUTV chứa đến 90%
TBGUTV CD44+CD24-/low có khả năng gây u không cao hơn các dòng
tế bào mà chỉ chứa 5% tế bào có cùng kiểu hình này (Fillmore &
Kuperwasser, 2008) Điều này cho thấy rằng chỉ một quần thể nhỏ tế
bào có kiểu hình CD44+CD24-/low là có khả năng tự làm mới và sinh u
Do đó liệu pháp tấn công TBGUTV được xem xét là liệu pháp tốt nhất
để loại bỏ sự tái phát và kháng với hóa và xạ trị trong điều trị UTV
21
ĐỀ NGHỊ
Nghiên cứu này có một số giới hạn Để có thể ứng dụng liệu pháp gen làm giảm biểu hiện CD44 và liệu pháp tế bào tua nạp kháng nguyên TBGUTV trong lâm sàng, một số thí nghiệm tiếp theo cần được tiến hành:
1 Đánh giá tính an toàn của cấu trúc vector shRNA CD44, nghiên cứu cải tiến để làm giảm độc tính nếu có thể hay thay thế bằng hệ vector khác hoặc phương pháp khác để điều hòa giảm biểu hiện CD44 với hiệu quả tương tự
2 Đánh giá các tác động phụ của liệu pháp tế bào tua, đặc biệt đáp ứng miễn dịch mà có thể gây bệnh tự miễn
3 Đánh giá liều vector lentivirut hay liều tế bào tua có thể
sử dụng hiệu quả trên người
4 Nghiên cứu các biến đổi trong nhiều con đường truyền tín hiệu liên quan đến sự điều hòa giảm biểu hiện CD44 trong TBGUTV
5 Tối ưu hóa việc đánh giá hiệu quả điều trị UTV bằng tế bào tua trên mô hình chuột nhân hóa hệ miễn dịch; sử dụng hệ thống quét tín hiệu để đo sự di căn và kích thích khối u thay vì quan sát khối u bằng mắt thường
Trang 720
doxorubicin, trọng lượng khối u giảm đáng kể đến 4,38 lần so với
nhóm đối chứng
4 Bước đầu thiết lập thành công liệu pháp miễn dịch sử dụng tế
bào tua nạp kháng nguyên TBGUTV trên mô hình chuột
Tế bào tua từ tủy xương chuột được sản xuất thành công và sử
dụng chúng trong liệu pháp tế bào tua Nếu chuột được điều trị vào
ngày 10 sau khi tiêm TBGUTV, có đến 60,0 ± 20% chuột không hình
thành khối u sau khi tiêm tế bào tua đã nạp kháng nguyên TBGTV sau
18 ngày Trong khi đó có đến 100% chuột mang khối ở chuột đối
chứng (tiêm PBS) sau 15 ngày Có 0,095±0,018% tế bào tua tồn tại
trong tách vào ngày 3 sau khi ghép Lượng tế bào CD8 và CD45 trong
lô ghép tế bào tua tăng cao hơn so với chuột đối chứng
5
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phân lập TBUTV từ khối u vú ác tính
TBUTV được phân lập từ các khối u vú của bệnh nhân đã đồng ý tự nguyện cho mẫu Về cơ bản, các khối u sẽ được rửa sạch và cắt thành từ mảnh nhỏ Những mẩu mô này được nuôi trong điều kiện thích hợp Trong nghiên cứu này có hai loại môi trường nuôi được sử dụng để nuôi tế bào từ mảnh mô Trong giai đoạn 1, chúng tôi sử dụng môi trường được biến đổi từ Speirs et al (1998) Trong giai đoạn 2, chúng tôi sử dụng một loại môi trường khác, đó là M171 bổ sung với yếu tố kích thích phát triển tế bào biểu mô tuyến vú MEGS của Invitrogen Ltd
Các tế bào thu nhận được đánh giá biểu hiện marker CD24 bằng hóa tế bào miễn dịch và phân tích phần trăm tế bào biểu hiện CD24 và CD90 bằng kĩ thuật flow cytometry Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành loại bỏ các tế bào tạp nhiễm bằng kĩ thuật tách tế bào âm tính với marker CD90 Sau khi thu nhận được quần thể TBUTV, chúng tôi tiến hành xác định đặc điểm của tế bào này như:
khả năng gây u in vivo trên mô hình chuột, sự biểu hiện gen Brca1, sự
biểu hiện các gen liên quan đến sự hình thành khối u và di căn như
Cyclin D1, Cyclin E2, EGFR, Mucin 1 và Myc Cuối cùng, dòng tế
bào thu nhận được được phát hiện sự nhiễm mycoplasma
2.2 PHÂN LẬP TBGUTV
TBGUTV ứng viên được phân lập bằng tách quần thể CD44+CD24- Các TBGUTV ứng viên được nuôi cấy trong DMEM/F12 bổ sung 10% FBS và 1% antibiotic-mycotic, ủ trong tủ
ấm 370C, 5% CO2 Quần thể tế bào này được sử dụng để xác định đặc điểm đặc trưng của TBGUTV như xét nghiệm hình thành
mammosphere, khả năng gây u in vivo trên mô hình chuột
NOD/SCID, khả năng kháng thuốc chống khối u (doxorubicin và
Trang 86
verapamil) Cuối cùng, quần thể TBGUTV được đánh giá sự nhiễm
mycoplasma
2.3 ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU HIỆN CD44 VÀ SỰ KHÁNG
THUỐC DOXORUBICIN CỦA TBGUTV
siRNA được sử dụng để làm giảm biểu hiện CD44 trong
TBGUTV Việc chuyển nhiễm siRNA CD44 bằng bộ kit theo hướng
dẫn của nhà sản xuất (Santa Cruz Biotechnology Inc) Sau 48h chuyển
nhiễm, tế bào được sử dụng đánh giá sự biểu hiện của CD44 bằng
RT-PCR và hóa tế bào miễn dịch
Các tế bào sau khi được khẳng định điều hòa giảm biểu hiện
CD44 thành công, chúng được sử dụng để đánh giá khả năng kháng
thuốc với thuốc chống khối u Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng doxorubicin để khảo sát ở các nồng độ 0, 1, 3 và 6 µg/mL Tế
bào được tiếp xúc với các nồng độ này của doxorubicin trong 48 giờ
và sau đó được sử dụng để đánh giá chu kì tế bào, sự tăng sinh và
apoptosis
2.4 BIỆT HÓA TBGUTV BẰNG CÁCH LÀM GIẢM BIỂU
HIỆN CỦA CD44
Trong thí nghiệm này, đầu tiên chúng tôi tiến hành phân lập
các quần thể tế bào, trong đó có quần thể TBGUTV đã được phân lập
và 3 quần thể khác biểu hiện marker khác với TBGUTV là CD44
-CD24-, CD44+CD24+, CD44-CD24+ Ba quần thể này được trộn đều
với tỉ lệ 1:1:1 để hình thành quần thể mới được gọi là tế bào không có
kiểu hình TBGUTV và được gọi là chung là TBUTV
Tiếp theo, TBGUTV được làm giảm biểu hiện CD44 bằng
việc chuyển CD44 shRNA trên vector lentivirut Các tế bào được
chuyển nhiễm và chọn lọc các tế bào nhận vector chuyển bằng cách
chọn lọc trong môi trường bổ sung puromycin dihydrochloride theo
hướng dẫn của nhà sản xuất Sự điều hòa giảm biểu hiện của CD44
19
- Trong điều kiện in vitro, các TBGUTV điều hòa giảm biểu hiện
CD44 biểu hiện một số đặc điểm:
+ tăng sinh chậm sau khi xử lí với doxorubicin
+ tăng mức apoptosis và thay đổi chu kì tế bào Tác động gây apoptosis được quan sát rõ trong TBGUTV đã bị điều hòa giảm biểu hiện CD44 có thể đạt đến 34,19% tế bào chết khi xử lí 1,0 µg/mL doxorubicin và đạt đến 40.2% khi xử lí doxorubicin ở nồng độ 6,0 µg/mL
+ Thay đổi biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến
tính gốc, tính kháng thuốc và di căn như Muc-1, MMP9 và Myc biểu hiện giảm, sự biểu hiện của LEF1 liên quan đến tính gốc cũng giảm
+ chu kì tế bào cũng bị tác động Pha G2/M và pha S trong TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 tương tự với TBUTV Pha G2/M trong TBGUTV bị điều hòa giảm CD44 giảm tương tự với TBUTV (24,23±0,34% so với 23,41±0,50%) trong khi đó pha S thì tăng từ 13,93±0,69% ở TBGUTV lên 16,98±0,95% trong TBGUTV đã điều hòa giảm biểu hiện CD44, so với 20,08±0,31% trong TBUTV
- Trong mô hình chuột NOD/SCID, TBGUTV điều hòa giảm biểu hiện CD44 cho thấy khả năng gây u giảm về cả tốc độ phát triển khối
u và kích thước khối u hình thành so với TBGUTV
+ TBGUTV gây u trên 66,67% (2/3) chuột khi bị tiêm 103 tế bào; trong khi đó TBUTV cần đến 106 tế bào để gây u 33,33% (1/3) chuột Ở liều 104 tế bào, TBGUTV đã điều hòa giảm biểu hiện CD44 không có khả năng gây u so với 100% chuột bị u khi tiêm TBGUTV + Kích thước và trọng lượng khối u có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm điều trị theo phác đồ điều trị bằng liệu pháp điều hòa giảm CD44 kết hợp doxorubicin trên mô hình chuột So với chuột đối chứng, kích thước của chuột giảm đi 1,74; 3,04 và 12,47 lần tương ứng trong trong nhóm Doxorubicin, CD44 shRNA, và CD44 shRNA kết hợp doxorubicin Trong nhóm kết hợp CD44 shRNA kết hợp
Trang 918
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 KẾT KUẬN
1 Tế bào ung thư vú từ 23 mẫu khối u vú đã được phân lập và
nuôi cấy Đã thiết lập thành công 2 dòng tế bào ung thư vú
VNBRC1 và VNBRC2 từ các mẫu này Các tế bào ung thư vú thu
nhận được biểu hiện các đặc điểm chính sau:
- chứa 0,11% tế bào dương tính CD90, 96,45±1,76% tế bào dương
tính với CD24
- biểu hiện rất thấp gen Brca1, trong khi đó biểu hiện mạnh các gen
cyclin D1, cyclin E2, EGFR và Mucin 1 so với dòng tế bào ung thư vú
thương mại MCF-7
- hình thành khối u trong chuột NOD/SCID khi tiêm 2.106 tế
bào/chuột
- âm tính với các mycoplasma chính M arginini, M faucium, M
fermentans, M hyorhinis, M orale) và Acholeplasma laidlawii
2 Thiết lập thành công hai dòng tế bào gốc ung thư vú (BCSC1 và
BCSC2) Các TBGUTV biểu hiện các đặc điểm đặc trưng sau:
- biểu hiện mạnh protein CD44, không biểu hiện hay biểu hiện rất yếu
protein CD24 trên bề mặt tế bào
- có khả năng tự làm mới in vitro và hình các khối cầu trong môi
trường không huyết thanh
- có khả năng gây u trên chuột NOD/SCID với liều 103 TBGUTV khi
tiêm dưới da
- kháng mạnh với verapamil ở nồng độ cao (50 µg/mL) so với tế bào
ung thư vú
- âm tính với các mycoplasma chính M arginini, M faucium, M
fermentans, M hyorhinis, M orale) và Acholeplasma laidlawii
3 Liệu pháp gen điều hòa giảm biểu hiện CD44 được thiết lập
thành công trên mô hình chuột
7
được khẳng định bằng kĩ thuật flow cytometry và hóa tế bào miễn dịch
Sau khi đánh giá biểu hiện CD44, chỉ những mẫu có >90% tế bào không biểu hiện CD44 được sử dụng để tiến hành các đánh giá tiếp theo
Trạng thái biệt hóa của TBGUTV được đánh giá dựa vào sự tương đồng của TBGUTV sau khi điều hòa giảm biểu hiện CD44 với TBUTV và sự khác biệt giữa TBGUTV và tế bào đã điều hòa giảm biểu hiện CD44 Các đặc điểm khảo sát bao gồm khả năng sinh u trên
mô hình chuột NOD/SCID, sự biểu hiện các gen liên quan đến tính gốc và di căn, chu kì tế bào
Có 22 gen được chia thành 2 phức hợp gen được khảo sát, bao
gồm: Phức hợp 1 gồm 17 gen: Bcl-2 [Genebank:NM_000633], Fos [Genebank: NM_005252], ICAM1 [Genebank:NM_000201], CCND1 [Genebank: NM_053056], MMP7 [Genebank:NM_002423], Myc [Genebank:NM_002467], PRKCE [Genebank:NM_005400], TP53 [Genebank:NM_000546], VCAM1 [Genebank:NM_001078], IL4R [Genebank:NM_000418], PTCH1 [Genebank:NM_000264], HSPB1 [Genebank: NM_001540], PTGS2 [Genebank: NM_000963], HSF1 [Genebank:NM_005526], LEF1 [Genebank:NM_016269], TCF7 [Genebank:NM_003202], and FASN [Genebank:NM_004104]; phức hợp 2 gồm 5 gen: Muc-1 [Genebank:NM_002456], cyclin E2 [Genebank:NM_004702], EGFR [Genebank:NM_005228], Myc [Genebank:NM_002467], and cyclin D1 [Genebank:BC001501]
2.5 ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN KHỐI U TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT BẰNG LIỆU PHÁP GEN ĐIỀU HÒA GIẢM BIỂU HIỆN CD44 KẾT HỢP VỚI DOXORUBICIN
Trong thí nghiệm này, chúng tôi xác định tỉ lệ xâm nhiễm cho hiệu quả nhất giữa lượng hạt virus mang shRNA CD44 và tế bào của khối u Các tỉ lệ được khảo sát bao gồm 2:1, 1:1 và 1:2 tương ứng với
Trang 108
tỉ lệ giữa TBGUTV và hạt lentivirut mang shRNA CD44 với lô đối
chứng không bổ sung hạt lentivirut Các tế bào được nuôi tiếp tục 5
ngày sau khi nhiễm với lentivirut và sử dụng để phân tích tỉ lệ phần
trăm tế bào biểu hiện CD44 bằng kĩ thuật flow cytometry
Sau đó, chuột NOD/SCID được tiêm TBGUTV để gây tạo
khối u dưới da Sau 2 tuần, khối u hình thành và đủ lớn, chúng được
chia thành 4 nhóm Nhóm 1 (đối chứng, 4 con), các chuột mang u
không được điều trị Nhóm 2 (Doxorubicin –Dox), chuột được tiêm
vào khối u doxorubicin với liều 2mg/kg hàng tuần trong 4 tuần Nhóm
3 (shRNA), chuột được tiêm với CD44 shRNA lentivirut với liều
được xác định trong thí nghiệm trên Nhóm 4 (CD44 shRNA kết hợp
với doxorubicin, shRNA+Dox), chuột được tiêm CD44 shRNA
lentivirut với lượng tương đương nhóm 3 cùng với doxorubicin với
lượng và chế độ tiêm cùng với nhóm 2 Kích thước và trọng lượng
khối u được ghi nhận
2.6 TÁC ĐỘNG CỦA TẾ BÀO TUA ĐƯỢC NẠP DỊCH CHIẾT
TBGUTV LÊN MÔ HÌNH CHUỘT MANG KHỐI U VÚ
Trong thí nghiệm này, dịch chiết TBGUTV được tạo ra như
sau 5.106 TBGUTV được thu nhận cho vào ống li tâm 1.5 mL Tế bào
được xử lí với 400µl Pro-PREP và trộn kĩ Huyền phù này được làm
lạnh nhanh trong -200C trong 10-20 phút Dịch nổi tế bào được
chuyển sang ống li tâm mới và bảo quản để sử dụng trong các thí
nghiệm tiếp theo
Tế bào tua được biệt hóa từ tế bào đơn nhân tủy xương chuột
Chuột mô hình u vú được tạo ra bằng cách tiêm 106 TBGUTV vào
dưới da vùng mỡ vú chuột Để ức chế sự đào thải tế bào ghép, chuột
được tiêm busulfan (liều 20 mg/kg) và cyclophosphamide (liều 200
mg/kg)
Chế phẩm tế bào tua sử dụng để tiêm cho chuột được tạo ra
như sau 100 µl dịch chiết TBGUTV được thêm vào 1 mL tế bào tua
17
sau 18 ngày ghép, trong khi đó có đến 100% chuột mang khối u trong
lô đối chứng sau 15 ngày tiêm PBS
Về khả năng di cư của tế bào tua ghép đến lách, phân tích sự tồn tại tín hiệu huỳnh quang Vybrant Dil-CM đã đánh dấu trên tế bào tua bằng kĩ thuật flow cytometry cho thấy có 0,095±0,018% tế bào tua ghép hiện diện trong lách trong tổng số tế bào lách Kết quả phân tích
mô học quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cũng cho thấy có sự tồn tại tín hiệu huỳnh quang trong lát cắt lách
Tiếp theo việc đánh giá sự thay đổi đáp ứng miễn dịch khi ghép tế bào tua thông qua thành phần tế bào CD8 và CD45 trong lách
so với chuột đối chứng và chuột bình thường cho thấy tỉ lệ tế bào CD8 tăng cao hơn so với chuột đối chứng và chuột bình thường (tương ứng
là 26,33%; 9,52% và 2,61% trong chuột ghép tế bào tua, chuột bình thường và chuột đối chứng) Điều này cho thấy rằng việc ghép tế bào tua đã kích hoạt đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T gây độc Kết quả phân tích cũng cho thấy việc ghép tế bào tua đã làm tăng tỉ lệ tế bào CD45 so với chuột đối chứng (76,97% so với 48,11%) Tuy nhiên, tỉ lệ này tương đối thấp so với chuột bình thường Điều này là
vì tác động của chất ức chế miễn dịch