Một số phương pháp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủHóa biến nạpĐiện biến nạpBiến nạp tế bào trần (protoplast)Phương pháp bắn genPhương pháp vi tiêmTải nạpKỹ thuật tách dòng (tạo dòng)Tạo DNA tái tổ hợp (Vector tái tổ hợp)Việc tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vector đã được cắt cùng một enzyme cắt hạn chế loại II, khi đó, chúng sẽ ghép đôi những đầu dính lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung.Một phản ứng ghép nối xảy ra với sự có mặt của enzyme DNA ligase của E. Coli hoặc phage T4 để hoàn chỉnh phân tử lai.
DEAE-dextran DEAE-dextran polycation Ðây tác nhân hóa học sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy Trong phương pháp này, DNA ngoại lai cho vào trường nuôi cấy với có mặt DEAE-dextran DEAE-dextran kết hợp với DNA tích điện âm (Hình 1) Sự dư thừa điện tích dương phức hợp DNA-polycation đóng góp polycation, cho phép phức hợp đến kết hợp chặt chẽ với màng tế bào tích điện âm Sự xâm nhập phức hợp đạt nhờ nhập bào (endocytosis) Sự kết hợp DEAE-dextran DNA Phương pháp sử dụng thành công việc chuyển DNA vào tế bào biểu thời, có nghĩa thời gian biểu ngắn vài ngày trình nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp nói chung không hữu ích nghiên cứu cần chuyển nhiễm ổn định dựa vào hợp DNA ngoại lai vào nhiễm sắc thể, hiệu biến nạp thấp, sử dụng cho số loại tế bào cho kết tốt tế bào ex vivo Các polycation khác sử dụng để chuyển DNA vào tế bào polybrene, polyethyleneimine dendrimers Kỹ thuật calcium phosphate Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) phát triển để xác định lây nhiễm DNA virus (Graham,1973) sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp DNA virus DNA tách chiết từ tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980) Kỹ thuật yêu cầu ủ tế bào nhận với chất đồng kết tủa DNA calcium phosphat (Hình 2) Kết tủa bám vào tế bào sau hấp thụ vào tế bào qua trình ẩm bào (Loyter, 1982) Trong tế bào, phân tử DNA ngoại lai nằm không bào tạo thành ẩm bào lysosome thứ hai DNA đến nhân vả hợp vào genome chủ Phức hợp DNA-calcium phosphat Cho đến nay, kỹ thuật vô có giá trị nghiên cứu chuyển gen vào tế bào soma nuôi cấy sử dụng nhiều để chuyển dòng genome vào tế bào đích Tỉ lệ tế bào biến nạp ổn định kỹ thuật tương đương với phương pháp vi tiêm khác với vi tiêm nhiều tế bào biến nạp lần Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ tế bào ung thư vào tế bào nhận không ung thư cho thấy phương pháp để nghiên cứu kiểm soát di truyền ung thư Phương pháp sử dụng phổ biến đơn giản, protocol dễ thực hiện, tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, biểu gen thời ổn định quan trọng việc thiết kế vector virus tái tổ hợp Tuy nhiên hiệu biến nạp mức độ biểu gen chuyển thấp Chuyển gen qua liposome Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo sử dụng để đưa DNA vào tế bào Lipid với toàn lưới tích điện dương pH sinh lý thành phần lipid tổng hợp phổ biến liposome phát triển cho chuyển gen (Hình 3) Thường lipid cation trộn với lipid trung tính Ldioleoyl phosphatidyl-ethanolamine (DOPE) (Hình 4) Phần cation phân tử lipid kết hợp với DNA tích điện âm kết chứa đầy DNA phức hợp liposome-DNA (Hình 5) Ðối với tế bào nuôi cấy, toàn lưới tích điện dương phức hợp liposome-DNA nói chung gây hiệu chuyển gen cao cho phép phức hợp kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền Nhờ chế nhập bào, phức hợp xuất endosome sau vào nhân (Hình 2.6) Chưa rõ DNA phóng thích từ endosome qua màng nhân DOPE xem lipid kích thích dung hợp vai trò phóng thích phức hợp từ endosome làm cho dung hợp màng tế bào phía với phức hợp liposome-DNA xảy dễ dàng Trong phương pháp này, đại phân tử trước hết đưa vào túi phospholipid Các loại túi khác mô tả, túi lớp mỏng thích hợp cho chuyển gen chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước bên tương đối cao đơn vị lipid chúng có tỉ lệ phân phối cao Sự dung hợp liposome với màng plasma kiện Hiệu biến nạp phương pháp thấp so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân Các nổ lực nghiên cứu tiến hành để tìm điều kiện thí nghiệm mà làm tăng phóng thích phân tử kết nang từ đường ẩm bào Cấu trúc tổng quát lipid cation tổng hợp Cấu trúc DOPE (L-diolecyl phosphatidylethanolamine) hợp liposome-DNA Phức Sơ đồ hoạt động vector liposome Liposome sử dụng để đưa protein, lipid phân tử nhỏ vào nhiều loại tế bào nuôi cấy, nhiên hiệu thấp vi tiêm RNA protein Cũng thế, chuyển gen qua liposome biểu gen chuyển không vượt qua phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), biểu gen chuyển thường thời, ức chế thành phần huyết xảy Bên cạnh đó, kỹ thuật có nhiều ưu điểm gen chuyển không hợp vào genome chủ, có hiệu tốt tế bào in vitro in vivo, mang DNA có kích thước lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, sử dụng với tế bào mà biến nạp kỹ thuật calcium phosphat hiệu Ứng dụng tương lai kỹ thuật chủ yếu khả phân phối thuốc vào tế bào thể sống Hiện kỹ thật phát triển để cải tiến phân phối đặc hiệu liposome cách ghép kháng thể đặc hiệu với bề mặt liposome đích Phương pháp vi tiêm Sự thành công nghiên cứu tạo chuột chuyển gen phương pháp vi tiêm vào tiền nhân công bố vào năm 1980 (Gordon, 1980) Mặc dầu cấu trúc tổ hợp gen chuyển chứng minh tích hợp vào genome chuột, xếp lại gen ngoại lai không biểu Các công bố (Brister, 1981; Costantini Lacy; 1981) chứng minh với phương pháp vi tiêm, gen chuyển tích hợp có khả biểu Vào năm 1982, lần thay đổi kiểu hình nhìn thấy chuột nhắt chuyển gen mô tả (Palmiter, 1982) Ðây kết biểu gen hormon sinh trưởng chuột cống chuột nhắt Từ đến có nhiều công trình chuyển gen, phần lớn nghiên cứu hiệu gen vi tiêm với sinh trưởng động vật có vú bệnh học Nguyên tắc phương pháp vi tiêm lượng nhỏ DNA tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần tế bào nguyên vẹn cách học kính hiển vi Phương pháp cho phép đưa gen vào vị trí mong muốn tế bào với hiệu tương đối cao.Tuy nhiên đòi hỏi phải tinh vi, tỉ mỉ xác nên hạn chế số lượng tế bào vi tiêm làm tổn thương đến tế bào phôi tác nhân học gây tiến hành vi tiêm Ðể biến nạp gen vào tế bào phương pháp vi tiêm trước hết phải chế tạo kim tiêm kim giữ Kim tạo từ ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-1,5 mm có sợi wolfram mảnh nhờ hệ thống thiết bị làm kim Hệ thống gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài kim máy gia cố kim Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân trứng thụ tinh Ðể tạo kim tiêm trước hết phải tạo đầu kim nhọn nhờ máy kéo kim Sau sử dụng máy gia cố để cắt đầu nhọn ống capillar sau kéo tạo mũi kim tiêm có đường kính thích hợp Ðường kính bên mũi kim tiêm tuỳ thuộc vào loại tế bào chuyển gen Ðối với trứng tiền nhân động vật có vú có đường kính khoảng 70 µm đường kính kim tiêm khoảng 0,75 µm thích hợp, phôi cá tế bào đường kính kim tiêm khoảng 3-4 µm Cuối đưa kim lên máy mài để làm sắc nhọn trơn láng đầu kim Kim giữ chế tạo từ ống capillar có đầu nhẵn bình thường để cố định trứng trình vi tiêm Ðể tạo kim giữ, dùng máy kéo kim tự động để tạo đầu kim nhỏ sau dùng bút kim cương sợi platin đốt nóng cắt bớt đầu nhọn để tạo đầu kim với đường kính thích hợp Làm nhẵn đầu kim giữ cách để đứng kim mặt đoạn cong platin máy gia cố Ðốt nóng sợi platin điều chỉnh đầu kim giữ cho chảy từ từ Quan sát kính hiển vi dừng lại đầu kim đạt yêu cầu Vi tiêm tiến hành hệ thống thiết bị vi tiêm Hệ thống gồm có hai phận kính hiển vi máy vi thao tác Các máy làm kim (Hãng Narishige) Máy gia cố kim Microforge Máy mài kim Máy kéo kim tự động Pipette Puller Kính hiển vi dùng cho mục đích kính hiển vi soi ngược (vật kính xoay ngược lên) Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá tế bào khoảng từ 40-60 lần Máy vi thao tác gồm phần giống hệt bố trí hai bên kính hiển vi, dùng để điều chỉnh kim tiêm, dùng cho kim giữ Tính máy cho phép điều chỉnh kim theo không gian chiều Kim tiêm kim giữ lắp vào máy vi thao tác nối với syringe qua ống chất dẻo nạp đầy dầu parafin Chuẩn bị dung dịch gen chuyển: gen chuyển xen vào vector plasmid tạo dòng E.coli Các vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp phát môi trường nuôi cấy có thuốc kháng sinh plasmid mang gen kháng thuốc đặc hiệu Các vi khuẩn sống sót sinh trưởng môi trường dinh dưỡng thích hợp plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển chép tế bào vi khuẩn phân chia Sau đó, hàng triệu plasmid tái tổ hợp mang gen chuyển tách chiết từ tế bào vi khuẩn đoạn gen chuyển tách từ plasmid tái tổ hợp nhờ sử dụng enzym hạn chế Ðể tinh sạch, gen chuyển điện di gel agarose Hoà tan gen chuyển dung dịch đệm đặc trưng (như dung dịch Tris-EDTA; dung dịch TE ) tính nồng độ dung dịch gen chuyển nhờ quang phổ kế Nồng độ dung dịch DNA sử dụng cho vi tiêm thường 1-5 µg/ml Trước chuyển vào phôi, gen chuyển kiểm tra biểu tế bào nuôi cấy chuyển nhiễm (transfection) Máy vi thao tác Olympus (Hãng Narishige) Kính hiển vi soi ngược Máy vi điều chỉnh Vi tiêm tiến hành qua bước: nạp gen vào kim tiêm phương pháp capillar (ngâm đầu kim tiêm vào dung dịch gen khoảng 10-12 giờ) bơm trực tiếp dung dịch gen vào, lắp kim tiêm kim giữ vào máy vi thao tác, chuyển trứng tiền nhân vào đĩa petri có chứa môi trường đặt kính hiển vi, giữ trứng tiền nhân vào đầu kim giữ lực hút syringe, điều chỉnh kính hiển vi để xác định đĩa phôi điều chỉnh máy vi thao tác để đưa kim tiêm vào vị trí trứng tiền nhân, đẩy gen vào trứng tiền nhân cách vặn nhẹ syringe Khi thấy trứng tiền nhân phồng to trở nên sáng dừng lại kéo nhanh kim tiêm Trứng tiền nhân sau tiêm di chuyển xa đến cuối đĩa petri trước tiêm trứng tiền nhân Mỗi nhóm trứng tiền nhân hoàn thành chuyển sang đĩa môi trường khác để ấp đánh giá mắt vài tiếng Sau tất trứng tiền nhân nhìn thấy rõ ràng chuyển vào ống dẫn trứng nhận Cho đến nay, kỹ thuật chuyển gen vào động vật phương pháp vi tiêm dung dịch DNA vào hợp tử phương pháp có hiệu động vật có vú phương pháp chủ yếu sử dụng để chuyển gen vào vật nuôi Ðối với thực vật phương pháp sử dụng tế bào tiền phôi hợp tử tế bào tiền phôi hạt phấn Tuy nhiên xâm nhập gen chuyển vào DNA tế bào vật chủ trình ngẫu nhiên xác suất để gen chuyển xen vào vị trí DNA vật chủ mà cho phép biểu thấp Hiệu vi tiêm không cao (Bảng 1) (Hammer cộng sự, 1985) Hiệu Số lượng trứng vi Loài động vật tiêm Thỏ 1907 Cừu 1032 Lợn 2035 vi tiêm số loài động vật Số lượng sinh từ trứng vi tiêm 218 (11,4%) 73 (7,1%) 192 (9,4%) Số lượng chuyển gen 28 (1,5%) 1(0,1%) 20 (1%) Chuyển gen vi tiêm Ph ươ ng pháp chuy ển gen nh vector virus Vào năm 1974, lần nhà khoa học phát thấy rằng, sau tiêm DNA retrovirus SV40 vào khoang phôi (blastocoel) túi phôi chuột, DNA tìm thấy sau tế bào chuột trưởng thành (Jaenisch,1974; Jaenisch Mintz,1974) DNA provirus Mo-Mulv sử dụng thí nghiệm tích hợp vào genome truyền lại cho hệ sau, tạo nên dòng chuột ổn định (Stuhlmann, Jahner Jaenisch,1981) Từ đó, việc sử dụng virus làm vector cho DNA ngoại lai phát triển Phương pháp thao tác phức tạp có ưu điểm hiệu chuyển gen cao Hơn gen cấu trúc gắn vào vector virus sử dụng promoter virus, promoter thường có hoạt tính cao gen cấu trúc biểu mạnh tế bào chủ Về nguyên tắc, loại virus sử dụng làm vector để chuyển vật liệu di truyền vào tế bào Nhiều nhóm số đó, papovavirus, adenovirus, retrovirus sử dụng vào mục đích chuyên biệt Ðể sử dụng làm vector, phần khác genome virus thay gen cấu trúc quan tâm Virus sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm phôi trước chuyển ghép vào mẹ Gen chuyển với vector retrovirus xâm nhập cách hiệu vào hệ gen vật chủ virus sử dụng phải virus an toàn, không gây bệnh Các thể chuyển gen sinh từ phương pháp dạng khảm, có nghĩa tất tế bào thể mang retrovirus Gen chuyển di truyền retrovirus hợp vào số tế bào sinh dục Ðối với phương pháp tỉ lệ sống động vật chuyển gen sơ sinh thấp Nếu thao tác di truyền chuẩn xác, không gây sẩy thai, hệ động vật (F1) cần kiểm tra biểu gen chuyển Khi gen chuyển hợp tế bào sinh dục gọi thể khảm dòng mầm sau chúng lai dòng khoảng 10-20 hệ thu động vật chuyển gen đồng hợp tử gen chuyển có mặt tất tế bào Ở giai đoạn này, phôi mang gen chuyển đông lạnh bảo quản cho trình cấy chuyển sau Chuyển gen nhờ vector virus Chuyển gen b ằng cách s d ụng t ế bào g ốc phôi Xuất phát từ lý tế bào gốc phôi (tế bào phôi giai đoạn 16-32 tế bào) tế bào đa (totipotent) nghĩa phân hoá thành loại mô từ tạo nên thể hoàn chỉnh Từ túi phôi nuôi cấy in vitro, người ta tiến hành tách chiết tế bào gốc phôi biến nạp gen ngoại lai vào tế bào Sau chọn tế bào biến nạp gen lạ người ta đưa vào phôi khác giai đoạn phôi nang để tạo động vật chuyển gen thể khảm Trên 30% động vật chuyển gen tạo thành động vật chuyển gen thể khảm dòng mầm mang kiểu gen dòng tế bào Ở tế bào gốc phôi sử dụng phương tiện để chuyển gen (Mintz, 1977) Ưu điểm phương pháp chuyển gen tỉ lệ phôi sống sót sau thao tác, tích hợp biểu tính trạng gen cao Ðiều quan trọng thực tế việc chuyển gen tiến hành thông qua thao tác với phôi dâu túi phôi Phôi giai đoạn thu nhận mà không cần phẫu thuật (đặc biệt bò), công việc chuyển gen tiến hành dễ dàng Phương pháp có ý nghĩa đặc biệt nghiên cứu kiểm tra di truyền trình phát triển Sự thuận lợi cho phép tạo cách xác đột biến gen xác định tái tổ hợp đồng dạng Trong tương lai phương pháp sử dụng tế bào gốc phôi sử dụng rộng rãi để tạo động vật chuyển gen Có ba cách tạo động vật chuyển gen từ tế bào gốc phôi mang gen chuyển: -Thứ nhất, phương pháp dùng trước mắt bơm số tế bào gốc phôi (khoảng 5-10 tế bào) vào xoang phôi nang tế bào động vật -Thứ hai, xen số tế bào gốc phôi vào bào thai thời kỳ tế bào -Thứ ba, nuôi cấy chung tế bào gốc phôi với phôi qua đêm - Cắt DNA thành đoạn có kích thước xác định enzyme RE loại II - thông thường, người ta sử dụng EcoRI, - Vector chọn để tạo dòng gen thường cosmid phage λ xử lý EcoRI, - Tạo vector tái tổ hợp đóng gói vỏ phage, - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ tạo dòng, - Xác định đặc tính biểu dòng vi khuẩn vừa lập, - Tiến hành sàng lọc, nghĩa phải tách vector có đoạn DNA ưa chuộng, từ xây dựng ngân hàng gen Đặc điểm ứng dụng: - Ngân hàng gen chứa đoạn DNA lớn 100 lần so với cDNA - Giải mã thông tin di truyền chứa gen, đặc biệt cấu trúc intron exon gen xác định - Tạo dòng trình tự DNA không mã hóa nằm cạnh gen mã hóa đóng vai trò định điều hòa biểu gen Ngân hàng cDNA Thiết kế ngân hàng cDNA Ngân hàng cDNA tập hợp cDNA từ tất mDNA tế bào Như vậy, ngân hàng thiết lập từ loại tế bào xác định (tế bào biệt hóa), thế, cDNA mang tính tế bào cao Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm bước sau đây: - Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn tế bào có chứa nhiều mRNA cần thiết sau đó, làm mRNA, - Chọn lựa mRNA chứa nhiều A (polyA) cách tách cột xenlulose oligo dT, - Tổng hợp cDNA sợi kép đầu từ mRNA tác dụng enzyme chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 kỹ thuật Gubler-Hoffman, - Metyl hóa vùng hạn chế (có đoạn cDNA sợi đôi) nhận biết enzyme EcoRI để bảo vệ vùng không bị cắt thao tác với EcoRI, - Tạo đầu dính cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết EcoRI, sau đó, cắt enzyme EcoRI Trong trường hợp này, có đoạn nối bị cắt cDNA nguyên vẹn (do metyl hóa) Đưa cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp, - Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp mở EcoRI khử nhóm phosphat, - Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa enzyme ligase để tạo vector tái tổ hợp, - Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ nuôi cấy điều kiện thích hợp để tạo dòng, - Xác định dòng cần tìm thành lập ngân hàng cDNA Mục đích việc thiết lập ngân hàng cDNA nhằm nghiên cứu biểu gen xác định với vấn đề liên quan đến điều hòa biểu gen mối tương tác gen trình sống Khi phân tích kết thu ngân hàng cDNA, cần ý tác dụng sinh lí thời điểm thí nghiệm Sàng l ọc ngân hàng cDNA Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng cDNA DNA plasmid từ mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro- xenlulose (màng lai) bị biến tính lai với mRNA tổng số Mỗi mRNA khác lai nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung Các mRNA bám vào màng lọc tách dùng để tổng hợp protein mà mã hóa hệ thống dịch mã invitro Protein hình thành đem phân tích xem có phải sản phẩm mRNA cần tìm hay không, từ đó, xác định vi sinh vật nuôi cấy chứa gen mong muốn Sàng lọc tất mẻ nuôi cấy theo cách để xác định dòng đơn thể gen tìm kiếm Khái niệm vector S ự chuyển gen Việc nghiên cứu gen xác định sinh vật eucaryote gặp phải nhiều khó khăn, gen trình tự nhỏ nằm lọt toàn gen có kích thước lớn Để thu nhận lượng gen tinh với hàm lượng lớn người ta phải chuyển tạo dòng gen Để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho) sang tế bào B (tế bào nhận) thực cách đính gen cần chuyển vào yếu tố trung gian gọi đoạn dẫn Những đoạn dẫn có khả hướng dẫn, vận chuyển đoạn gen cần nghiên cứu vào tế bào nhận Đoạn dẫn vector chuyển gen Vector Vector phân tử DNA nhỏ (ngắn) dạng thẳng dạng vòng, đó, người ta cài mảnh DNA (gen quí) cần nghiên cứu Những mảnh DNA cài gọi đoạn cài (insert) DNA ngoại lai DNA lạ Các phân tử DNA nhỏ thường thực khuẩn thể plasmid mà gen chúng có tín hiệu cần thiết cho chúng tái bản, chúng lại tái (sinh sôi nẩy nở) Chúng cần đưa vào tế bào chủ (ví dụ tế bào vi khuẩn chẳng hạn) Nh ững yêu cầu t ối thiểu c m ột vector chuyển gen Vector phải có vùng nhận biết enzyme giới hạn loại II Vùng vùng cài lắp DNA (gen cần nghiên cứu) xử lý enzyme giới hạn Thật vậy, RE tạo đầu so le riêng, có khả gắn với đoạn DNA mang đầu so le tương ứng Hơn nữa, vùng nhận biết thường đặt vào gen thị để tiện theo dõi biểu hoạt động gen tái tổ hợp Thông thường, gen kháng kháng sinh, gen mã hóa tổng hợp enzyme có khả chuyển hoá chất tạo màu dễ phát mặt thạch Vector phải tồn tế bào chủ qua nhiều hệ gây xáo trộn tế bào chủ Vector có kích thước nhỏ tốt để thu nhận lượng DNA tối đa dễ biến nạp vào tế bào chủ Vector phải có khả tự chép tích cực tế bào chủ, không phụ thuộc vào chép gen tế bào chủ Đảm bảo di truyền bền vững DNA tái tổ hợp Chúng khả sống sót tế bào chủ không chuyển vào tế bào chủ khác đường tiếp hợp Có trình tự điều hoà tạo điều kiện thuận lợi cho việc phiên mã gen đưa vào Khả biến nạp lớn nghĩa có khả thấm tốt vào tế bào chủ vector mang gen tái tổ hợp Dễ theo dõi biểu gen tái tổ hợp, yêu cầu cần thiết cho việc phát dòng cần tìm Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn gen gắn vào vector Ngày vector chuyển gen ngày hoàn thiện tiện lợi cho việc sử dụng Không có vector toàn cho chuyển gen mà cần có lựa chọn tùy đối tượng tùy kích thước đoạn gen cần tạo dòng Chúng cấu tạo với nhiều tính chất chuyên biệt để mang trình tự nucleotide mong muốn M ột s ố ứng d ụng c vector chuy ển gen - Một ứng dụng để tiến hành trình gọi tách dòng nhằm khuếch đại lượng lớn DNA xác định - Nghiên cứu biểu đoạn DNA chưa biết - Đưa gen mà người cần nghiên cứu vào tế bào chủ - Sản xuất protein từ gen tạo dòng - Sản xuất RNA với khối lượng lớn từ DNA tạo dòng Các vật chủ thu nh ận vector chuyển gen Mọi thao tác với DNA việc tạo dựng phân tử DNA tái tổ hợp thực ống nghiệm Nhưng việc tạo dòng gen momg muốn phải thực tế bào sống Do vậy, việc biến nạp, tiếp nhận thể gen tế bào sống quan trọng trình nghiên cứu Tế bào nhận gen tái tổ hợp phải thể phù hợp với gen phải có biện pháp chọn lọc tế bào chủ tiếp nhận gen Ngày nay, người ta biết có bốn loại vật chủ thu nhận vector chuyển gen - Vật chủ vi khuẩn E Coli vi khuẩn khác, - Vật chủ nấm men nấm mốc, - Vật chủ tế bào thực vật bậc cao, - Vật chủ tế bào động vật có vú Các loại vector chuyển gen Những ứng dụng DNA tái tổ hợp Dựa vào nguồn gốc người ta phân - Các vector plasmid, - Các vector phage, - Các vector lai nhân tạo như: cosmid, bluescript Dựa vào chức người ta phân - Vector tách dòng (có kèm theo biểu không biểu protein), - Vector biểu (vector tổng hợp) Vector chuyển gen plasmid Các plasmid mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm nhiễm sắc thể, tìm thấy tế bào số vi khuẩn Chúng chép nhờ số enzyme có mặt tế bào vi khuẩn không phụ thuộc vào chép nhiễm sắc thể vi khuẩn Tùy kiểu plasmid mà số plasmid vi khuẩn khác Một số plasmid có chúng tự tái lần mổi lần phân bào Một số khác có số lớn chúng tái nhiều lần chu kỳ phân bào Những plasmid có từ 10 đến 100 tế bào chủ xem plasmid có cao Plasmid khác có từ đến tế bào chủ, xếp vào nhóm có thấp Trong sinh vật eucaryote, plasmid có tế bào nấm men Mỗi plasmid có chuỗi mã di truyền (sequence) mang chức măng tự tái DNA Nếu vị trí khởi đầu phiên mã (ori) này, DNA tự tái lập tế bào chủ Với tính chất tự tái bản, plasmid vector chuyển gen để nhân dòng DNA cần thiết Do kích thước nhỏ nên plasmid chứa gen chọn lọc, thường đặc tính chọn lọc kháng kháng sinh Từ phát đến nay, plasmid không ngừng cải tiến ngày có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng plasmid nhân tạo mà tạo từ plasmid tự nhiên cài thêm số chuỗi DNA Các plasmid hệ th ứ Thế hệ plasmid tìm thấy tự nhiên pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1 góp phần vào lịch sử tạo dòng Tuy plasmid có đặc tính cần thiết Sau này, nhà nghiên cứu tìm plasmid nhân tạo hệ hai, ba cách tập trung nhiều đặc tính quí nhiều plasmid tự nhiên vào cấu trúc Plasmid hệ th ứ hai pBR322 - plasmid sử dụng phổ biến vào năm 1980 để nhân dòng tế bào E.Coli Nó tìm vào năm 1977 Bolivar Rodrigues Các plasmid hệ thứ cấu tạo phức tạp bắt nguồn từ plasmid nhỏ cấu tạo thêm nhiều đoạn gen quí Cấu tạo plasmid pBR322 pBR322 có kích thước 4.363bp hai gen kháng thuốc, chống chịu ampicilline (ampR) chống chịu tetracycline (tetR) Có nhiều điểm nhận biết enzyme cắt hạn chế số có nhiều điểm nhận biết nằm gen kháng kháng sinh Ví dụ, gen kháng ampicilline có ba trình tự nhận biết ba enzyme cắt hạn chế PstI, PvuI, ScaI Còn gen kháng tetracycline có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII, NnuI Việc cài DNA lạ tiến hành hai gen kháng thuốc Nếu gen kháng với kháng sinh hai gen không nhận đoạn cài Điều cho phép để chọn lựa plasmid tái tổ hợp Một ứng dụng pBR322 chúng có số lớn Thực nghiệm cho thấy 15 plasmid tái tổ hợp biến nạp E Coli, số lượng tăng lên từ 1.000 đến 3.000 điều kiện nuôi cấy tốt Các plasmid hệ ba Đây plasmid mạnh đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác với hàng chục trình tự nhận biết chúng nối tiếp thành đoạn dài gọi polylinker Kích thước nhỏ, chép nhanh tế bào vi khuẩn, tạo số lượng lớn Các plasmid hệ chia làm nhóm lớn - Dãy pUC như: pUC18 , pUC19 - Dãy Gemini: Plasmid pGEM3 , Plasmid pCR 2.1 - Nhóm plasmid Bluescript Dãy pUC pUC plasmid University California, có kích thước 2,6kb có số đặc trưng sau - Có mảnh operon lacZ, vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để tổng hợp enzyme βgalactosidase - Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn 13 enzyme cắt hạn chế - Ở pUC18 , vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI, HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III) - Ở pUC 18 , vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III .EcoRI) - Có gen bền với ampicilline, gen mã hoá cho protein (enzyme) vốn tiết khoảng ngoại biên màng sinh chất vi khuẩn Cấu tạo plasmid pUC Sự diện lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp cách quan sát vi khuẩn thạch để chọn vi khuẩn có khả tiếp nhận plasmid Sự có mặt gen kháng ampicilline cho phép pUC tiến hành nuôi cấy môi trường có ampicilline Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn Vùng polylinker cho phép gắn xen trình tự DNA lạ nào, cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác mà không cần chất gắn Plasmid pGEM3 Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini) Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết 13 enzymee cắt hạn chế tương tự vùng polylineker pUC19 Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 T7 hai bên vùng polylinker Vì có ưu điểm cho phép phiên mã đoạn DNA gắn vector thành nhiều RNA, mà RNA thường dùng làm mẫu dò, dùng nghiên cứu cấu trúc chức RNA Nhóm plasmid bluescript Bluescrip vector lai nhân tạo phage sợi plasmid kết hợp tất ưu điểm phage ưu điểm plasmid, xem nhóm có tiềm Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng 2.961bp, bao gồm: Cấu tạo pBluescript SK (+/-) - Một mảnh lacZ đầu 5’ gen có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI, PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI ngược lại Ở vùng polylinker người ta tìm thấy vùng nhận biết tương đối (NotI) mà dãy pUC Với promoter T T để thu đoạn cài RNA chiều ngược chiều qua việc sử dụng RNA- polymerase phage T nhận biết promoter T ngược lại - Một mảnh DNA phage tùy mục đích sử dụng phage M13 phage f1 Vùng sử dụng người ta muốn DNA tái dạng sợi đơn sợi đôi, vùng chứa điểm khởi đầu cho tái (ori) Song tái xảy đồng gây nhiễm với virus trợ giúp (virus helper) Virus bổ khuyết chức thiếu cách mang đến gen mã hóa enzyme cần thiết cho tái Phụ thuộc vào cài đặt mảnh DNA so với chiều gen lacZ, người ta có vector bluescipt + − Cặp cho phép nhận sợi chiều ngược chiều Một gen chống chịu ampicilline, gen cho phép chọn lựa tất vi khuẩn sát nhập bluescript Trong vector bluescript có điểm khởi đầu chép colEI ori, chuỗi cho phép nhân phagemid (bluenscript) E Coli plasmid Giống gốc E Coli sử dụng thường XL1Blu, máy di truyền chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp tetracycline Điều cho phép dễ dàng chọn lựa vector sát nhập vào vi khuẩn Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta sử dụng bluescript để nhân đoạn DNA sợi đơn sợi kép chép RNA invitro để sản xuất đầu dò lai hóa tạo ngân hàng cDNA Các vector chuyển gen phage Phage (thực khuẩn thể) virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm so với vector plasmid - Dễ xâm nhập vào vi khuẩn, - Khả nhân lên nhanh tế bào chủ, - Khả tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn plasmid Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi - Thao tác ghép DNA lạ phức tạp, - DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc DNA tái tổ hợp plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất mặt thạch phủ đầy vi khuẩn Phần lớn nhóm phage sử dụng làm vector bắt nguồn từ phage λ thuộc hệ thứ Phage λ (thế hệ đầu) Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA đóng gói vỏ protein Phần đuôi cho phép virus tự cố định tế bào chủ vi khuẩn - DNA phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen Đầu tận cuả DNA sợi đơn gồm 12 nucleotide chúng gọi đầu dính - Cũng tất virus, DNA bao bọc vỏ protein Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách - Chu kỳ tan: phage sinh sôi nẩy nở vi khuẩn Các phage tạo khỏi vi khuẩn cách làm tan vi khuẩn Cấu tạo phage λ - Sinh tan: Là kiểu sinh sản khác virus, phage không làm tiêu tan vi khuẩn, thay tự sinh sản tế bào chất, phage sát nhập DNA với DNA vi khuẩn Các biến hình phage λ (phage hệ sau) Các phage thuộc hệ thứ hai đa dạng, loại thích ứng với mục đích sử dụng Giảm số vùng hạn chế giống Phage λ tự nhiên (chưa biến hình) gọi phage hoang dại có chứa nhiều vùng hạn chế giống - vùng EcoRI - Nhiều vùng Hind III Không thể cắt vector EcoRI HindIII đề cài vào mảnh DNA lạ Người ta biến hình loại phage λ chứa vùng nhận biết EcoRI tạo vector cài hai vùng EcoRI tạo vector thay - λ NM607 vector cài chứa đoạn cài DNA dài 9kb vị trí cắt EcoRI gen CI - λ charon 16: DNA cài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen lacZ - λ EMBL4 vector thay thế, đoạn DNA thay dài 23kb Làm khuyết phần không cần thiết Phage λ nhận DNA lạ chừng mực hạn chế Khả bị giảm nhiều độ dài genon (bộ gen) lớn 105% (51 ÷ 52kb) nhỏ 78% (38 ÷ 38,5kb) so với độ dài ban đầu Người ta tìm cách tăng chiều dài đoạn cài cách giảm nhiều chiều dài phần không cần thiết genon phage λ Trong số vector bỏ 1/3 phần trung tâm gen J N Trong giữ lại đầu 5’ (tay trái) vốn mã hoá cho protein đầu, đuôi Cũng đầu 3’ (tay phải) vốn mã hoá cho protein thiết yếu cho tái chu kỳ tan Phage λ biến hình Phần trung tâm gen J N không cần thiết cho sinh sản phage thay DNA lạ Các đầu mảnh 5’ 3’ đầu dính Cài mảnh operon lacZ Mục đích chọn phage tái tổ hợp mà đem lại khả phân biệt mắt phage λ sát nhập đoạn cài vào gen chúng Cơ chế phản ứng thủy phân X-Gal enzyme β-galactosidase Bắt đầu từ phage λ người ta cấu tạo nên (biến hình) phage gtλ 11 vector biểu Phage có cài vào gen lacZ DNA cần tạo dòng Các phage gtλ 11 tạo vùng tan trắng chúng cài DNA lạ vào gen lacZ (gen chịu trách nhiệm tổng hợp β-galactosidase) Các phage gtλ 11 tạo vùng tan xanh chúng không tiếp nhận đoạn cài DNA lạ Để phát phage λ tái tổ hợp, người ta cho vào môi trường chứa phage λ tái tổ hợp (môi trường nuôi cấy) đường X-Gal (5brome-4chloro- indolyl-β-galactopyroside) Giống đường lactose, bị thuỷ phân enzyme β-galactosidase Người ta dễ dàng phát có mặt enzyme β-galactosidase Các vector chuyển gen M13 Đặc tính cấu tạo: Là phage thể sợi, xâm nhiễm đặc trưng E Coli DNA phage mạch đơn, có kích thước 6,4kb, có khoảng 10 gen Ứng dụng: Do ưu điểm loại vector tạo lượng lớn phần tử DNA mang trình tự mạch, nên chúng thường dùng xác định trình tự nucleotide phương pháp Sanger Các biến hình phage M13 - Vector M13 mp2 dạng đơn giản nhất, có hai trình tự nhận biết EcoRI nhận đoạn cài có đầu dính cắt enzyme EcoRI - Vector M13 mp7 tạo thành cách đưa thêm vị trí cắt hạn chế vào gen lacZ vector M13 mp2 Vector có điểm nhận biết bốn enzyme cắt hạn chế: EcoRI, BamHI, SalI PstI Các vector chuyển gen khác Các cosmid Đặc tính cấu tạo Các cosmid vector lai nhân tạo từ plasmid với trình tự cos phage λ (được sử dụng từ năm 1978) Các trình tự cos điều khiển đóng gói DNA tái tổ hợp vào đầu phage Khi bao gói vùng cos bị cắt, phần DNA cosmid giới hạn đầu dính với đoạn cài DNA lạ bao gói Trong phản ứng bao gói in vitro, protein cần thiết cho tạo thành đầu đuôi phải thêm vào phage tự hợp thành Cosmid plasmid có vùng giới hạn mà đây, người ta cài lắp DNA lạ gen chống chịu ampicilline Kích thước cosmid ≈ 5kb đó, nhận đoạn cài 35÷45kb tới 47kb (như thấy Mục trên, đầu phage λ bao gói 52kb) Vào thời điểm gây nhiễm E Coli, DNA tái tổ hợp phóng vào vi khuẩn Trong vi khuẩn đầu dính bắt cặp tạo cosmid tái tổ hợp khép kín dạng vòng tái plasmid Ưu điểm ứng dụng cosmid Cũng phage, cosmid cho khả xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận đoạn cài có kích thước lớn Cấu tạo cosmid Trong tế bào chủ, tự nhân plasmid Cho nên người ta nhận khuẩn lạc, đĩa phân giải mặt thạch, thuận lợi cho việc quan sát Với tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ gen lớn để tạo ngân hàng genom (bộ gen) Những vi khuẩn mang vector có khả chống chịu với môi trường có ampiciline Tuy việc ứng dụng cosmid để tách dòng khó khăn vất vả Các nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men YAC (Yeart - Artificial - Chromosomes) Do nhu cầu tạo dòng với trình tự DNA ngày lớn, nhà nghiên cứu tìm tòi phát triển vector ngày Ngày người ta tạo YAC cho phép tạo dòng với đoạn DNA dài 150÷1.000kb, trung bình 350kb Bằng nghiên cứu cho thấy nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm sắc thể muốn nhân đôi phân ly tốt cần ba trình tự - TEL (telomere): Trình tự đầu cuối NST - CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm NST, đảm bảo chia đôi cực tế bào - ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự chép tự chủ tương tự ori plasmid Dựa vào người ta cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói với cấu tạo gồm cánh tay, cánh tay người ta cài đặt đoạn DNA cần tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb Trên cánh tay gồm gen đánh dấu di truyền để chọn lọc tế bào nấm men có chứa YAC chuỗi tận có chức telomer đoạn cuối NST Một hai cánh tay mang mảnh DNA hoạt động tâm động nguồn tái ori Việc cài DNA lạ vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine làm biến đổi màu sắc khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) có mặt DNA lạ Đây dấu hiệu diện YAC tái tổ hợp tế bào nấm men Các nhiễm sắc thể đưa vào tế bào chủ (nấm men), nhân lên NST khác tế bào nấm men ta có gen mong muốn Các nhiễm sắc thể nhân tạo động vật có vú Cấu tạo: Tương tự YAC bao gồm - Trình tự TEL - Trình tự CEN - Trình tự ARS Nhưng khác với YAC trình tự TEL CEN có nguồn gốc từ người Điều cho phép MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) vào tế bào động vật có vú giữ ổn định tế bào Mục đích sử dụng Chủ yếu sử dụng nghiên cứu cho tế bào bậc cao mà không sử dụng với tế bào nấm men Khi đưa NST vào tế bào chủ, tồn nhân lên tế bào chủ Các vector virus eucaryote Là vector từ virus tế bào tiếp nhận vector tế bào eucaryote Nó có cấu tạo giống phage λ Tuy nhiên loại vector có tính đặc hiệu cao người ta xây dựng dựa hiểu biết cụ thể [...]... thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển. ..Phương pháp chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi Chuyển tế bào gốc phôi vào túi phôi Chuyển gen tr ực ti ếp vào protoplast Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có... vector chuyển gen - DNA tái tổ hợp phải có hoạt tính khi đưa vào tế bào chủ - DNA tái tổ hợp phải có những dấu hiệu dễ phát hiện trong quần thể vi khuẩn Và dễ quan sát sự hoạt động và biểu hiện của gen tái tổ hợp Các công đoạn chính tạo DNA tái t ổ h ợp Chọn nguyên liệu DNA được chọn làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là DNA plasmid và DNA phage Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào vi sinh vật, . .. non và hãy còn chưa chắc chắn là có thích hợp đối với các protein cần thiết với liều lượng khớp một cách tinh vi không Sơ đồ cơ chế hoạt động của vi n gen 1 Vi n gen phân phối DNA đến ruột non 2 DNA được hấp thụ vào các tế bào ruột 3 Protein dược phẩm tổng hợp trong các tế bào 4 Protein dược phẩm tiết vào máu Kỹ thuật vi n gen khai thác một cách tích cực khoảng thời gian sống ngắn của các tế bào biểu... của tế bào gốc tinh hoàn Protocol này đã được sử dụng một cách thành công để chuyển gen vào tế bào gốc trong quá trình nuôi cấy Ðiều này đạt được nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu quả Các tế bào gốc cấy chuyển vào con đực nhận đã xử lý bisulfan dẫn đến kết Sử dụng các tế bào tiền thể của tinh trùng để chuyển gen Các bước khác nhau của sự biệt hóa tế bào gốc thành tinh trùng Các tế bào gốc hoặc các tế. .. 2000) Ph ươ ng pháp chuyển gen gián ti ếp nh ờ Agrobacterium Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn Thật không may mắn cho các nhà trồng cây ăn... công có thể mang các đặc tính di truyền mới Chuyển gen bằng súng bắn gen Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Các ứng dụng của kỹ thuật bắn gen bao gồm - Tạo thực vật chuyển gen: đây là phương... vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 2.21) Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999) Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào. .. thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào. .. có cách nào làm cho có thể áp dụng rộng rãi phương pháp này đối với các động vật lớn hơn chuột Quả thực cấu trúc của các ống dẫn tinh khác nhau và vi c tiêm DNA là khó Mặt khác, lượng DNA tiêm vào có thể là rất lớn và khó điều khiển Chuyển gen vào tiền thể của tinh trùng một cách trực tiếp DNA bình thường hoặc DNA bám vào thể chuyển nhiễm được tiêm trực tiếp vào các ống sinh tinh Các tế bào đã hợp