Sáng kiến kinh nghiệm sinh học ứng dụng vào nông nghiệp

2- Yêu cầu : Trình bày đợc ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau: - Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn - Chọn dòng

§Ò tµi: “øng dông c«ng nghÖ sinh häc

Mục lục

Tran g

Phần B: Nội dung nghiên cứu

I Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật 4

II Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn

3.4 Chọn dòng chống chịu các stress của môi trờng. 14

3.5 Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao. 17

V Chuyển gen ở thực vật

5.1 Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật. 26

5.2.1 Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens. 27

5.2.2 Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens và virus. 28

5.3 ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong nông nghiệp 31

VI Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam 31VII Kết quả nghiên cứu và thực nghiệm s phạm 33VIII Điều kiện áp dụng đề tài

Phần C: Kết luận và kiến nghị

III Những hạn chế và hớng phát triển tiếp của đề tài 35

Phần A: đặt vấn đề

I Lí do chọn đề tài

Thế kỉ XXI là thế kỉ của công nghệ sinh học, nó đang trở thành ngành khoa học mũi nhọn và then chốt của nhiều nớc Sự phát triển của công nghệ sinh học là một trong những tiêu chí hàng đầu để đánh giá trình độ phát triển của một nớc nào đó Chính vì vậy, các nớc đã tập trung rất ngân sách của và nhân lực cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học (biotechnology)

Với tầm quan trọng nh vậy nên ở tất cả các Trờng Đại học: Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy Sản, Y học và Sự phạm đều có bộ môn hay khoa công nghệ sinh học

Trong chơng trình môn Sinh học và Công nghệ Trung học phổ thông có khoảng từ

5 -10 bài học có liên quan đến công nghệ sinh học Trong các đề thi tuyển sinh đại học có khoảng 2 - 5 câu hỏi trắc nghiệm có liên quan đến công nghệ sinh học Điều này đòi hỏi các đồng chí giáo viên và các em học sinh phải có những hiểu biết sâu sắc và toàn diện về công nghệ sinh học Tuy nhiên, do đây là nội dung mới nên các đồng chí giáo viên và các

em học còn nhiều bỡ ngỡ

Xuất phát từ những lí do trên, nên khi tiến hành nghiên cứu viết sáng kiến kinh nghiệm, tôi đã mạnh dạn chọn đề tài:

“ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp”

II Mục đích và yêu cầu của đề tài

1- Mục đích :

Xây dựng và hoàn thiện chuyên đề “ ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp” và trở thành nguồn t liệu quý cho giáo viên và học sinh

2- Yêu cầu :

Trình bày đợc ứng dụng của công nghệ sinh học thực vật trong các lĩnh vực sau:

- Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô thực vật

- Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn

- Chọn dòng tế bào thực vật

- Lai tế bào thực vật

- Chuyển gen thực vật

- Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam

III ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn t liệu phong phú giúp cho mỗi giáo

viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công

nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo

viên và học sinh trở thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự phát triển của ngành công nghệ sinh học nớc nhà

Ngoài ra, đề tài này còn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt môn Sinh học nói chung và chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học nói riêng Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ vào chuyên ngành khối B của các trờng Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp

IV Đối tợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu: Thực vật.

Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực

Tuy nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn, chọn dòng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật chuyển gen ở thực vật Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy - học và ôn thi đại học và cao đẳng của học sinh Trung học phổ thông

V Phơng pháp nghiên cứu

Phơng pháp nghiên cứu các tài liệu đợc lấy từ các nguồn thông tin nh giáo trình đại học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dỡng giáo viên các trờng chuyên, internet, Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.Phơng pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia

Phơng pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề “ Công nghệ sinh học”

Phơng pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ơng, Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học,

Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp tham gia đề tài cấp nhà nớc “Chuyển gen sinh auxin và gen mẫn cảm auxin hoạt động đặc thụ bầu nhụy vào cây cam Vinh và quýt Đờng canh“

Phơng pháp đánh giá qua thực tiễn s phạm

Phần B Nội dung nghiên cứu

I VI NHâN GIốNG bằng nuôi cấy mô thực vật

Vi nhân giống bằng nuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhân giống in vitro Quá trình nhân giống này phải trải qua nhiều công đoạn:

Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những quyết định sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo Các công trình của D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trởng của chồi mới bảo đảm sự ổn định về di truyền Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thớc nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân

Các chồi nhân ban đầu thờng đợc tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên môi trờng thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh trởng (xitokinin và auxin) Vi nhân giống đợc bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân sau đó khử trùng và đa vào nuôi cấy ở môi trờng phù hợp có xitokinin

Sự phát triển nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ Chồi đợc nhân lên sau 3 đến 4 tuần Các chồi hình thành lại đợc tách ra chuyển sang môi trờng mới và qui trình cứ thế đợc lặp lại Để tạo rễ thì chồi nhân phải chuyển sang môi trờng có auxin

Đây là phơng pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phơng pháp nhân qua giai đoạn mô sẹo hoặc phôi, nhng các chồi nhân giữ lại đợc những đặc điểm của phôi gốc, ít hoặc không bị thay đổi về mặt di truyền Hiện nay nhờ phát triển những môi trờng và hệ thống nhân phù hợp, hệ số nhân đã đợc tăng lên nhiều (58 – 515 chồi/tháng) Đặc biệt là nhân chồi trong môi trờng lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor

Trong một số trờng hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo Phơng pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhng thờng kéo theo sự biến dị sôma nên trớc khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ những thay đổi về di truyền

Vi nhân giống có những u việt sau:

- Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đa giống vào sản xuất

- Nhân đợc một số lợng cây lớn trong một diện tích nhỏ Trong 1 m2 nền có thể để

đợc tới 18.000 cây

- Cây đợc làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các cây giống sạch bệnh.

- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15kg) Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4oC trong hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đến 95%

Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều Mấy năm gần đây, hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 50 triệu cây, ớc tính phải đạt 250 triệu cây/năm mới đáp ứng

đợc yêu cầu thực tiễn

Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phơng pháp vi nhân còn cao (300

- 8000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật quí hiếm và có giá trị kinh

tế cao Trên thực tế cây nhân bằng phơng pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây giống từ hạt

Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây nh lan, hoa cúc, hoa hồng, cẩm chớng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông

Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây, còn có thể rút ngắn thời gian đa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai

II TạO CâY ĐơN BộI bằng nuôi cấy hạt phấn

Có nhiều phơng pháp tạo cây đơn bội, nhng từ những năm 60, việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đợc phát triển Cây đơn bội có thể nhận bằng nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trờng thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs, 1977) hoặc môi trờng lỏng (Wernicke & cs, 1976) Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn phân chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây

2.1 Các yếu tố ảnh hởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo

2.1.1 Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy

Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hởng rất lớn đến hạt phấn nuôi cấy in vitro Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng nh nhiệt độ là những yếu tố ảnh hởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội Kết quả nghiên cứu của Dunwell (1976) cho thấy tỉ lệ phôi cao nhận đợc khi sử dụng những nụ hoa hình thành sớm và cây

phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cờng độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn.

ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn Vấn đề kiểu gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ Ngoài ra, xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 - 10oC) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ hạt phấn (Wenzel & cs, 1977)

2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro

Thành phần cacbonhydrat trong môi trờng hết sức quan trọng, đặc biệt là đờng sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4% Đối với khoai tây và lúa cần đến 6%, thậm chí 12%

Trong các chất hữu cơ, các axit nh glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi

ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá Các dịch chiết tự nhiên nh dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác nh vitamin C, nớc dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi cấy bao phấn

Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhng lại ức chế tạo phôi Vì thế trong ờng hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin Nói chung auxin thờng có tác dụng ở giai đoạn nuôi cấy ban đầu Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy Trong một số ít trờng hợp etylen kích thích tạo mô sẹo Wilson & cs (1978) cho biết nuôi cấy bao phấn trong môi trờng lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch

tr-Bổ sung vào môi trờng than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn

Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy Đối với thuốc lá mật độ tối u là 105 hạt/ml môi trờng Đối với các cây khác mật độ dao động

từ 104 - 105

ánh sáng đối với nuôi cấy bao phấn lúa cần đến 3200 lux, đối với thuốc lá chỉ cần 300-500 lux Nhiệt độ bình thờng từ 25-28oC là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và hạt phấn của hầu hết các giống cây

2.2 Tái sinh cây

Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tơng đối dễ, thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trờng tạo mô sẹo hoặc tạo phôi Đối với một số loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trờng nuôi cấy ban đầu chứa chất sinh trởng và đờng cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải chuyển sang môi trờng không có chất điều hòa sinh trởng Một số trờng hợp phải dùng zeatin và nớc dừa mới có thể tái sinh cây

Trong trờng hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên môi trờng không có chất điều hòa sinh trởng, nhng thờng thì phải chuyển sang môi trờng có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin Các cytokinin thờng hay dùng là BAP và kinetin Cho thêm các chất nh casein, lactoabumin thủy phân và nớc dừa thờng làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc

Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thờng cho tỉ lệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc th-ờng có hiện tợng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%) Wang và cs (1977) thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao Ngoài

ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping, 1978)

Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhng ở một số loài cây có cả cây nhị bội và đa bội Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy

2.3 ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn

Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trớc hết là làm nguyên liệu để tạo các dòng thuần Muốn tạo dòng thuần phải lỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây Nh đã nói trên,

ở một số loại cây có thể nhận đợc cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn, nhng trong trờng hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lỡng

Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng Chúng đợc sử dụng tạo các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tơng hợp ( Chu & cs, 1978) và rút ngắn thời gian tạo hạt lai Các dòng đơn bội kép đã tạo đợc ứng dụng trong sản xuất lúa mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc lá cho năng suất cao và chất lợng tuyệt hảo đã đợc tạo ra bằng phơng pháp cấy bao phấn (Hu han & cs, 1978) Nhiều giống lúa mới nh Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs, 1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã đợc tạo bằng phơng pháp nuôi cấy hạt phấn Ngoài ra các dòng đơn bội kép còn đợc sử dụng để phát triển quần thể cho việc lập bản đồ phân tử.

Trong nghiên cứu, cây đơn bội là đối tợng tốt để nghiên cứu kết hợp đôi giữa các cặp NST, ngoài ra phân tích di truyền trên quần thể cây đơn bội để xác định kiểu di truyền các tính trạng lặn Các cây đơn bội còn dùng làm nguyên liệu tạo các cây đa bội lệch Cây

đơn bội cũng đợc dùng trong lai khác loài để rút ngắn thời gian ổn định về NST Nuôi cấy bao phấn có thể ứng dụng để nghiên cứu và tạo đột biến

Sơ đồ ứng dụng nuôi cấy bao phấn

Bao phấn hoặc Giống mới hạt phấn

đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi Khi những tế bào đợc tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhng trong suốt quá trình sinh trởng và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di truyền do ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa sinh trởng Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tợng hết sức lí tởng trong việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa Cũng nh cây trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình Một loại là kết quả của sự thay đổi gen, đợc gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay

đổi gen, đợc gọi là biến đổi ngoài gen Những thay đổi ngoài gen không di truyền đợc

Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tợng phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào

có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phơng pháp chọn lọc nào Hiện tợng này gọi là hiện tợng phân dòng sôma Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh

từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980) Larkin va Scowcroft (1981) đa ra một định nghĩa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả những thay

đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào

3.2 Vật liệu và phơng pháp chọn dòng

Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng Các vật liệu có thể là

tế bào cho đến các mô phân hóa Mỗi loại vật liệu có những u điểm và nhợc điểm riêng Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các ph ơng pháp nuôi cấy đối với từng loại cây

Vật liệu thờng dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus) Mô sẹo đợc dùng

để chọn các dòng chống chịu nh chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối (McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986)

Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phơng pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên môi trờng chọn lọc chứa một nồng độ nhất định của chất chọn lọc, các mô và tế bào đột biến có tính chọn lọc hơn hẳn so với quần thể, Một số tác giả khác lại sử dụng phơng pháp chọn lọc từng bớc tức là khi mô hoặc tế bào sống sót trên một nồng độ nhất định của

tác nhân chọn lọc thì lại chuyển sang nồng độ cao hơn Ngoài ra cũng có thể sử dụng kết hợp cả hai phơng pháp Sự ổn định của mô chọn lọc là khả năng phát triển bình thờng liên tục trên môi trờng chọn lọc hoặc khi chuyển môi trờng chọn lọc và sau một thời gian dài cấy trên môi trờng không chọn lọc vẫn mất đi đặc điểm đã đợc chọn lọc.

Sử dụng mô sẹo làm nguyên liệu CDTBTV có u điểm là đơn giản nhng nguyên liệu này có một số nhợc điểm là: dễ tạo ra các dạng khảm vì trong mô chọn lọc còn có nhiều

tế bào bình thờng nên khi tái sinh cây, trong quần thể cây tái sinh có cả những cây mang

đặc điểm chọn lọc và những cây vẫn mang đặc điểm giống bố mẹ, thậm chí trong một cây

có thể có phần chứa các tế bào chọn lọc, phần khác vẫn chứa các tế bào bình thờng Để khắc phục nhợc điểm này có thể giảm kích thớc của mô: mô càng nhỏ càng tốt Trọng l-ợng mô thờng dùng là 100-150 mg, nhng có thể giảm xuống đến 10-20 mg (Wakaha & Widholin, 1987)

Tế bào nuôi cấy dịch lỏng đã đợc nhiều tác giả sử dụng trong CDTBTV (Kishinami

& Widholin, 1986; Watad và cs, 1985) Đối với loại tế bào này các phơng pháp chọn lọc trực tiếp và chọn từng bớc cũng đã tiến hành có kết quả trên nhiều đối tợng Sử dụng tế bào dịch lỏng để CDTBTV có u điểm là tế bào hoặc cụm nhỏ các tế bào đợc tiếp xúc

đồng đều với tác nhân chọn lọc, nhng một nhợc điểm quan trọng là sau khi chọn lọc khả năng tái sinh cây bị giảm đáng kể và trong nhiều trờng hợp có thể mất hẳn Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dịch lỏng đều không nhận đuợc cây (Dix, 1990) Vì thế hệ thống tế bào dịch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng có khả năng tổng hợp

và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn Trong trờng hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp ứng đợc mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp

Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng đợc nhiều mặt trong CDTBTV Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất Từng tế bào đợc phát triển đồng

đều trong môi trờng, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng

là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh đợc hiện tợng khảm Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã đợc chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast

Trớc đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất

là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế Hiện nay hệ thống nuôi cấy

protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng nhkhoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã đợc công bố Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu

lý tởng cho CDTBTV Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tợng quan trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế bào và chuyển gen

Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu CDTBTV Một trong những mô phân hóa đợc sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984) Fluhr & cs (1985) đã chọn đợc dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh McCabe & cs (1989) cũng nhận đợc dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá

Bên cạnh việc sử dụng các phơng pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo, tế bào dịch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi tách bằng tia cực tím (UV) hoặc N -methyl-N-Nitro- N-Nitrosoguanidine (MNNG) Ph-

ơng pháp tơng tự cũng đợc một số tác giả khác tiến hành có hiệu quả khi sử dụng N -ethyl-N-Nitrosourea (Cseplo & cs, 1985), MNNG, UV, và tia X (Maliga & cs, 1981) Ngoài ra có thể xử lí mẫu vật bằng các chất gây đột biến trớc khi đa vào nuôi cấy và chọn lọc

3.3 Chọn dòng chịu bệnh

Mặc dù phơng pháp truyền thống có thể tạo đợc các dòng hoặc giống chịu bệnh nhng trong một vài trờng hợp không thể chọn đợc các dòng chịu bệnh bằng những phơng pháp này hoặc chọn đợc nhng tốn nhiều công sức và thời gian Việc gây nhiễm bệnh nhân tạo cho một số lợng lớn cây để tạo chọn giống chịu bệnh là cả một vấn đề, ngoài ra gây nhiễm trong nhà kính nhiều khi cũng không thành công Không những thế bằng phơng pháp truyền thống việc chọn các đột biến đơn gen hoặc đa gen kháng cùng một loại bệnh gặp rất nhiều hạn chế: thứ nhất là phải chọn bố mẹ phù hợp, thứ hai là lai ngợc mất rất nhiều thời gian, thứ ba là không chuyển đợc các gen lặn hoặc nhiều gen một lúc Đặc biệt

đối với các loài cây chỉ nhân vô tính thì chuyển gen không thể thực hiện đợc bằng lai tạo

Đột biến thực nghiệm có thể tạo đợc giống cây chịu bệnh nhng tần số xuất hiện các đột biến đơn gen rất thấp (10-4 - 10-6), ngoài ra tỉ lệ khảm ở các cây đột biến tơng đối cao

Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc phục đợc nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh nh: qui mô thí nghiệm, thời gian chọn lọc, khống chế đợc điều kiện gây nhiễm Ngoài ra có thể nhận đợc các đột biến đơn gen

và đột biến lặn Nếu tần số đột biến đơn gen trong trờng hợp đột biến thực nghiệm là 10-4

- 10-6 thì ở quần thể cây tái sinh (Ro) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin & Scowcroft, 1981) Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981)

Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần nghiên cứu giải quyết nh vấn đề tơng hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tợng lây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh)

Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc

tố gây bệnh (ĐTGB)

Phần lớn tác nhân gây bệnh đã đợc sử dụng là virus và đối tợng đợc lây nhiễm là protoplast Vấn đề then chốt là phải tạo đợc quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân biệt đợc tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi vấy và chọn lọc Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trờng phù hợp cho

sự sinh trởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào sạch virus sinh trởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trởng chậm hơn

và có màu vàng

Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh nh Phoma lingam, Plamidomonas brassicae

(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs, 1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs,

1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae

(Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977), Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã đợc sử dụng để chọn dòng chịu bệnh.

Prasad và cs (1984) đã chọn đợc dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sơng bằng phơng pháp tái sinh cây từ hoa tự non đã bị nhiễm nấm Sun & cs (1986) đã nuôi mô sẹo từ phôi lúa cùng với vi khuẩn gây bệnh Xanthomonas oryzae và đã chọn đợc các dòng kháng

bệnh Một số tác giả khác đã tiến hành gây nhiễm các cây tái sinh từ mô trong điều kiện

in vitro và nhận đợc những kết quả đáng ghi nhận (Peros, 1984; Barlass, 1986; Joung &

cs, 1987) Ngoài ra có thể đa các cây tái sinh từ mô hoặc tế bào trồng trên đất bị nhiễm nấm, nhng hớng này cha đợc tiến hành nhiều

Các độc tố gây bệnh (ĐTGB) từ một số nấm và vi khuẩn đã đợc dùng nhiều trong chọn dòng chịu bệnh, sử dụng ĐTGB trong chọn dòng có u điểm là các tế bào có thể bị nhiễm đồng đều và nhiều ĐTGB có tác dụng lây nhiễm tế bào (Daly, 1981), vì thế có thể

sử dụng các nguyên liệu một cách đa dạng Ngoài ra còn có sự tơng quan thuận giữa kháng ĐTGB trong điều kiện in vitro và in vivo Chọn các dòng kháng ĐTGB đã đợc tiến hành thành công đối với protoplast (Shahim & Spivey, 1986), tế bào nuôi dịch lỏng (Connell & Heale, 1986), mô sẹo từ protoplast (Thanutong & cs, 1983; Shahim & Spivey, 1986), phôi thứ cấp (Sacristan, 1982) và đỉnh chồi (Gantotti & cs, 1985) Sử dụng ĐTGB

đối với tế bào còn mở ra nhiều triển vọng chọn đợc các đột biến kháng bệnh hiếm (Carlson, 1973)

Bên cạnh những u điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lu ý một số vấn

đề nh xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều trờng hợp cây bị bệnh nhng không phát hiện có độc tố hoặc xác định đợc trong cây có độc tố gây bệnh nhng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983) Một vấn đề nữa là trong nhiều trờng hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại không có khả năng kháng bệnh Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc

điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhng nếu ta tái sinh đợc số lợng cây nhiều đến mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mong đợi Điều này đã

đợc khẳng định bằng công trình của Thanutong & cs (1983) Các tác giả đã nhận đợc 20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria.

10-ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết 10-ĐTGB thô dới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn đợc sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã đợc công bố khi sử dụng ĐTGB thô nh khoai tây kháng

P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá

kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984) Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã

nhận đợc dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng

độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên

Ngoài phơng pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào, mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn đ ợc dòng chịu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng chịu bệnh theo phơng pháp này Giống mía chịu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka, 1974) và giống lhoai lang “Sarlet” chịu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã đợc chọn và đa vào sản xuất Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo hớng này có nhiều hứa hẹn và trên thực tế đã có các giống chịu bệnh đuợc đa vào sản xuất nhng có một số mặt hạn chế của phơng pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều kiện tự nhiên; thứ hai là phân dòng sôma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều khi chọn đợc dòng chị bệnh nhng lại ảnh hởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney & Shepard, 1981).

Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn dòng chịu bệnh ở cây trồng nhng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết nh cơ chế tơng hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây bệnh, liên quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro Một vấn

đề quan trọng nữa là xác định đợc vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn lọc in vitro Một số vấn đề liên quan về mặt kĩ thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút ngắn thời gian nuôi cấy và tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số đặc điểm khác Việc chọn lựa đối tợng để áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào vào chọn dòng chịu bệnh cũng rất quan trọng Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế bào có thể áp dụng để chọn dòng chịu bệnh ở các loài cây sinh sản vô tính thì phù hợp và có kết quả hơn (Daub, 1986; Jones, 1990) Ngoài ra nuôi cấy mô và tế bào có thể áp dụng để chọn các dòng chịu bệnh đơn gen hoặc chịu bệnh mang gen lặn (Jones, 1990) Việc sử dụng các ĐTGB không đặc hiệu để chọn các dòng chịu bệnh đặc biệt mà bằng các phơng pháp thông thờng không chọn đợc cũng đã đợc đề cập (Jones, 1990)

3.4 Chọn dòng chống chịu các stress của môi trờng

Các stress môi trờng bao gồm những điều kiện bất lợi của môi trờng nh phèn, chua, mặn, khô, hạn, nóng, lạnh Việc chọn tạo những giống cây trồng chống chịu đợc các stress môi trờng là rất cần thiết Theo Nabors (1990) hiện nay có ít nhất 25% đất trồng bị mặn (chủ yếu do NaCl), 25% số đất chua (là do ion nhôm) 40-60% đất khô hạn

Ngoài ra do việc cải tạo môi trờng nh tới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ và diệt cỏ cũng dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các tác nhân trên.

Nh đã trình bày ở các phần trên, nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp một phần trong việc tạo chọn các dòng chống chịu các stress môi trờng Trớc khi giới thiệu một số thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở cũng

nh phơng pháp chọn các dòng chống chịu stress môi trờng Ngoài một số vấn đề chung

đ-ợc đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao, chọn dòng chống chịu stress môi trờng còn có một số vấn đề liên quan đến cơ sở của tính chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hoàn chỉnh Đặc biệt là cơ sở di truyền của tính chống chịu stress môi trờng còn cha đợc biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thể có nhiều alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trờng, ngoài ra các alen này thờng là lặn nên không thể hiện trong trờng hợp dị hợp tử Đây là những vấn đề làm cho việc chọn các dòng chống chịu stress môi trờng cha có đợc những thành tựu mong muốn Ngoài ra một

số vấn đề quan trọng nữa là tơng quan giữa khả năng chống chịu các stress môi trờng ở cây hoàn chỉnh và tế bào nuôi cấy rất phức tạp vì thế chọn dòng bằng nuôi cấy mô có thể không tạo đợc cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên đồng ruộng Mặc dù có một

số vấn đề hết sức quan trọng đợc nêu ở trên, thực tế vẫn có những cơ sở và số liệu đáng tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn các dòng chống chịu với các stress môi trờng: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đa gen có thể biến đổi bởi đột biến xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm này Những kết quả nghiên cứu của Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã cho thấy tính chống chịu với một số stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di truyền qua thế hệ sau Ngoài ra đã có những số liệu về sự phân ly theo Mendel của các đặc điểm đợc chọn lọc (Comner & Meredits, 1985)

Cho đến nay hầu hết các công trình chọn dòng chống chịu stress môi trờng đều chọn theo phơng pháp chọn lọc trực tiếp Việc tiến hành xử lý các stress có thể tiến hành khi mô sẹo (callus) mới hình thành hoặc khi mô sẹo đã phát triển Các stress có thể ở mức

độ thấp hoặc ở mức độ gây chết, và có thể xử lý một nồng độ nhất định hoặc khi tế bào chịu đợc một nồng độ nào đó lại đa lên nồng độ cao hơn Việc tiến hành xử lý có thể liên tục hoặc gián đoạn, thời gian xử lý có thể ngắn hoặc dài Cho đến nay cha có những nghiên cứu so sánh cụ thể đối với từng trờng hợp trên Tốt nhất tùy từng đối tợng cụ thể

mà kết hợp việc chọn lọc theo cách này hay cách khác Đây là một vấn đề nghiên cứu về

mặt phơng pháp nhng hết hết sức quan trọng, nó đóng góp vào sự thành công trong việc chọn các dòng chống chịu stress môi trờng Muốn nhận những đột biến mới hoặc đột biến lặn, chọn lọc có thể tiến hành ở mô đơn bội từ hạt phấn, nếu chọn lọc ở mô đơn bội từ hạt phấn lai F1 có thể nhận đợc các đột biến đơn gen và các tái tổ hợp của các alen sẵn có.

Trong những năm gần đây đã có những bớc tiến đáng kể trong việc chọn dòng chống chịu muối, hạn, chua và nhiệt độ Nhiều dòng chịu muối (NaCl) đã đợc chọn lọc từ mô nuôi cấy của các loài Nicotiana tabacum (Nabors 1980, 1983), Cicer arietium, Ipomoea babatas L (Pandey & Ganapathy, 1984; Salgado Garcigila & cs, 1985), Medicago sativa L (McCoy 1987, Winicov, 1991), Linum usitatium (Mc Hughen and

Swartz, 1984) Tính chống chịu trong một vài trờng hợp đợc thông báo là ổn định ở mức

độ tế bào và cây hoàn chỉnh (Winnicov, 1991) Về cơ chế của tính chịu muối cũng đã có những kết quả đáng ghi nhận ở Việt Nam việc tiến hành chọn các dòng thuốc lá địa ph-

ơng chịu muối cũng đợc tiến hành và đã thu đợc những kết quả tiến bộ (Nguyễn Hoàng Lộc & cs, 1990) Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) là chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lợng 26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987) Mối tơng quan giữa ABA, tính chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú trong những năm tới Các dòng chịu hạn đã đợc thông báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs, 1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000 đa vào môi trờng

để chọn Vấn đề tạo dòng kháng nhôm đợc Couner và cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner & Meredith, 1985) Các tác giả đã chọn đợc các dòng thuốc lá kháng nhôm ổn định, tính kháng nhôm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau Việc chọn các dòng chống chịu với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs (1983) đã nhận đợc các cây cúc chịu đợc nhiệt độ thấp Nhìn chung phần lớn các nghiên cứu từ trớc đến nay đều tập trung vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và chịu nóng Những kết quả của Chen và Gusta (198) nhận đợc trên Triticum aetivum L, Secale cereale L, và Bromus inermis Leyss cho thấy

ABA làm tăng khả năng chịu lạnh đáng kể Các tác giả cho rằng ABA là chất cần thiết để tạo dòng chịu lạnh Orr và cs cũng nhận đợc những kết quả tơng tự về tác dụng của ABA Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt các protein mới nhng vai trò cụ thể của từng loại protein mới này nh thế nào? Chúng có vai trò gì trong quá trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao? Đây là những câu hỏi còn đang để ngỏ

Chọn dòng chống chịu stress môi trờng là yêu cầu chiến lợc trong công tác giống cây trồng nhng cho đến nay phần lớn các công trình tập trung vào tìm kiếm các phơng pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này Những kết quả nhận đợc mới chỉ

là những cơ sở hết sức ban đầu Để có đợc những thành công trong tơng lai và có đợc những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hớng trên vẫn là điều quan tâm hàng đầu

3.5 Chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao

Các chất thứ cấp ở thực vật là những hợp chất trong cơ thể thực vật nhng không có vai trò đối với các quá trình sống cơ bản, những hợp chất này giữ vai trò thứ cấp trong cây Thực ra về mặt tiến hoá, các chất thứ cấp đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình đấu tranh sinh tồn vì đây là những chất độc đối với động vật và vi sinh vật, các chất

có tác dụng quyến rũ côn trùng hoặc có mầu sắc và hơng vị đặc biệt Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào trong những năm gần đây đã mở ra triển vọng sử dụng kỹ thuật này để nuôi sinh khối lớn có khả năng tổng hợp các chất thứ cấp Hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm đã ký với các hãng sản xuất để thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy trên quy mô công nghiệp Một trong những yêu cầu của quá trình công nghiệp hoá tế bào nuôi cấy để thu nhận các chất thứ cấp là vấn đề tạo các dòng cho năng suất cao và ổn định

Vật liệu thờng dùng để chọn dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao là mô hoặc tế bào nuôi cấy dịch lỏng

Đối với các chất thứ cấp có màu, có thể chọn bằng mắt Đối với các chất thứ cấp không có màu trớc khi cấy chuyển cần đợc phân tích Đây là việc làm tốn khá nhiều công sức và thời gian Để khắc phục, Ogino và cs (1978) đã đa ra phơng pháp ép tế bào Theo phơng pháp này, các cụm tế bào hoặc mô đợc ép giữa hai tờ giấy lọc, nhựa tế bào sẽ ngấm vào giấy lọc sau đó dùng phơng pháp nhuộm để xác định Đối với một số chất đợc tế bào tiết ra môi trờng thì có thể xác định theo phơng pháp dùng màng phủ than hoạt tính để hấp thụ các chất sau đó dùng tia cực tím (UV) để xác định (Knoop and Beiderback, 198) Ngoài ra có thể sử dụng phơng pháp xác định dựa vào tính chất kìm hãm sự phát triển của

vi khuẩn của các chất do tế bào tiết ra nh berberine chẳng hạn (Suzuki & cs, 1987) Các phơng pháp khác nh phóng xạ hoặc phân biệt tế bào bằng huỳnh quang cũng đã đợc sử dụng

Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi cấy là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn cha đợc sáng tỏ.Tuy nhiên vai trò của các chất điều hoà sinh trởng và nồng độ đờng đã đợc ghi nhận Hàm lợng các chất thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra môi trờng của các chất này.

Thờng thờng tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ sinh trởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trởng nhanh và không kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp Những tế bào nuôi cấy có tốc độ phân chia chậm thì có u thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp

Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề

đợc nhiều tác giả quan tâm Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có

năng suất cao cho hàm lợng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất thấp Cũng trên đối tợng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng suất cao không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao Kết quả này cũng đ ợc công bố trên những loài cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979) Cho đến nay vẫn cha có chứng minh chắc chắn về tơng quan giữa năng suất của cây làm nguyên liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy Theo Wilson (1990) nên sử dụng những cây đa dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu

Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dòng tế bào không ảnh hởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964) Nhiều tác giả khác lại nhận đợc các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của cây, thậm chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk & cs, 1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982) Hall và Yeoman (1987) còn cho biết trong quần thể tế bào nuôi cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các chất màu) cũng khác nhau giữa các tế bào Những sự biến động về tích lũy các chất thứ cấp này là những cơ sở để tìm các phơng pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòng cho năng suất cao

Cho đến nay đã tồn tại ba hệ thống chọn lọc, hệ thống thứ nhất là sử dụng các tế bào nuôi cấy đồng đều và ổn định; hệ thống thứ hai là sử dụng hổn hợp tế bào, nhng các

tế bào riêng rẽ ổn định; và hệ thống thứ ba là sử dụng hỗn hợp tế bào mà tế bào riêng rẽ không ổn định

Hệ thống chọn lọc thứ nhất tạo ra các dòng cho năng suất ổn định còn hệ thống thứ hai và thứ ba tạo ra các dòng ổn định và không ổn định.

Một vấn đề rất quan trọng mà cho đến nay vẫn cha sáng tỏ là cơ sở của những thay

đổi kiểu hình, quá trình điều khiển trao đổi các chất thứ cấp ở tế bào thực vật nuôi cấy in vitro Để có đợc những phơng pháp chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao những nghiên cứu về vấn đề này là rất quan trọng

Ngoài những phơng pháp chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất chất thứ cấp cao

đã nêu, ứng dụng công nghệ gen để tạo các dòng tế bào này là một hớng cần đợc tiến hành, tuy nhiên ở đây cũng còn nhiều vấn đề liên quan cha đợc hiểu biết đặc biệt là những cơ sở sinh hoá và phân tử trong chu trình trao đổi chất thứ cấp

Mặc dù còn một số vấn đề cần giải quyết nhng những thành tựu đạt đợc trong chọn dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao đã mở ra triển vọng lớn trong việc đa tế bào thực vật nuôi cấy vào sản xuất các chất thứ cấp có ý nghĩa trong nông nghiệp, công nghiệp và y học Đặc biệt là sự phát triển hệ thống công nghiệp để sản xuất sắc tố đỏ và chất diệt khuẩn Shikonin ở Nhật (Curtin, 1983) đã mở ra triển vọng công nghiệp hoá việc thu nhận các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy Viện Công nghệ sinh học Canada và các phòng nghiên cứu của hãng Vipont đã hợp đồng nghiên cứu phát triển hệ thống công nghiệp sản xuất Sangninarine sử dụng trong sản xuất thuốc đánh răng (Agricell Report, 1989)

Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công nghiệp dợc, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm Các chất này rất khó tổng hợp và hiện nay nguồn cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng nguồn cung cấp hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang đợc quan tâm đặc biệt Vấn đề tìm ra các phơng pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là khâu then chốt để đa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp Những thành tích đạt đợc trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hoá sản xuất Shikonin bằng tế bào nuôi cấy là những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để nhận các chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao

ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã đợc bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tợng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus Năm

1988, Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn đợc dòng tam thất cho hàm lợng saponin cao Những thay đổi về hàm lợng nicotine liên quan đến quá trình phân hoá mô và cây tái sinh cũng đã đợc công bố (Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 )