5.1. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen ở thực vật đã phát triển cùng với sự phát triển của các kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật. Nĩ trở thành một phơng tiện quan trọng để nghiên cứu cơ bản trong sinh học thực vật. Nĩ cho phép nghiên cứu cấu trúc và điều khiển hoạt động của gen. Ngồi ra nĩ mở ra triển vọng chuyển các gen cĩ ý nghĩa kinh tế vào cây trồng. Từ khi khám phá ra rằng chuyển gen cĩ thể thực hiện nhờ Agrobacterium tumefaciens (Klee & Rogers, 1989) các nhà khoa học tin rằng Arobacterium cĩ thể chuyển gen vào tất cả các lồi cây. Nhng sau đĩ kết quả thực tế cho thấy chuyển gen bằng Agrobacterium
khơng thể thực hiện đợc trên các cây ngũ cốc vì thế hàng loạt các kỹ thuật chuyển gen đã đợc phát triển đĩ là kỹ thuật chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1989), kỹ thuật bắn gen (Klein & cs, 1989), kỹ thuật vi tiêm (Neuhaus & cs, 1987), kỹ thuật chuyển gen qua hạt phấn (Hess & cs, 1977 ; Ohta, 1986), kỹ thuật đờng dẫn bằng ống phấn (Luo & cs, Wu, 1988), kỹ thuật ủ hạt hoặc mơ với ADN (Ledoux & cs, 1974), kỹ thuật nhiễm vi khuẩn (Grimsley & cs, 1986), sử dụng ADN của virus (Gronenborn & Matzeit,1989), Kỹ thuật điện di (Linsay & Jones, 1990), dung hợp liposom (Ahokas, 1987), phơng pháp vi tiêm (De la Pena & cs, 1987), và phơng pháp xử lý laser (Weber & cs, 1988). Đến nay nhờ cải tiến các vectơ chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A. tumefaciens đã thành cơng cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa (Hiei và cs, 1994). Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với chuyển gen ở thực vật.
Chuyển gen đợc thực hiện qua các bớc sau:
- Xác định gen liên quan đến tính trạng quan tâm. - Phân lập gen.
- Gắn gen vào các vectơ biến nạp. - Biến nạp vào E. Coli.
- Tách ADN plasmid.
- Biến nạp vào mơ hoặc tế bào thực vật. - Chọn các thể biến nạp.
- Chứng minh sự cĩ mặt của gen biến nạp trong cây tái sinh.
Khi đặt ra mục đích và thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học của hệ thống chuyển gen nh:
- Khơng phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng.
- Cây biến nạp chỉ cĩ thể tái sinh từ các tế bào cĩ khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genơm.
- Mơ thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào cĩ những khả năng khác nhau. Cần xem xét một số vấn đề nh: chỉ cĩ số ít tế bào cĩ khả năng tái sinh và biến nạp; một số khác cĩ một trong hai khả năng; một số nếu tạo điều kiện phù hợp thì trở nên cĩ khả năng; một số khác hồn tồn khơng cĩ khả năng tái sinh và biến nạp.
- Thành phần các quần thể tế bào đợc xác định bởi lồi, kiểu gen, từng cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mơ và cơ quan.
- Cho đến nay gen chỉ cĩ thể chuyển vào tế bào cĩ thành xellulơ bằng
Agrobacterium, virus, vi tiêm, bắn gen và chuyển gen trực tiếp.
Khả năng xâm nhập của gen vào genơm một cách ổn định khơng tỷ lệ với sự thể hiện tạm thời của gen.
Các ADN khơng phải là của virus khi cĩ trong genơm cha bảo đảm là đã gắn ổn định với genơm.
- Các ADN khơng phải của virus khơng chuyển rời từ tế bào nọ sang tế bào kia, nĩ chỉ ở nơi mà nĩ đợc đa vào.
- ADN virus khơng xâm nhập vào genơm cây chủ, chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và bị loại ở mơ phân sinh.
5.2. Các phơng pháp chuyển gen
5.2.1. Chuyển gen bằng Agrobacterium.
Chuyển gen bằng Agrobacterium là phơng pháp hữu hiệu đầu tiên dùng để chuyển gen ở thực vật. Phơng pháp này dùng Ti- plasmid của A. tumefaciens hoặc Ri plasmid của
A. rhizogenes làm vectơ đa ADN vào tế bào. Ti plasmid gồm hai thành phần T -ADN và
vùng vir (virulence). T-ADN cĩ thể chuyển từ Agrobacterium vào tế bào thực vật, chính nhờ vậy mà cĩ thể gắn gen muốn chuyển nạp vào T -ADN để đa vào tế bào. T -ADN chức gen điều hồ sinh trởng cục bộ và gen tổng hợp các chất opine. Đoạn cuối cĩ 25 cặp bazơ lặp lại, bất kỳ đoạn nào trong vùng này cũng cĩ thể xâm nhập vào phân tử ADN thực vật.
Vùng vir gồm sáu nhĩm từ virA đến virG trong đĩ virC và virE cĩ tác dụng làm tăng tần số biến nạp.
Để thiết kế vectơ dùng cho biến nạp, trớc hết là cắt bỏ các gen điều hồ sinh trởng cục bộ sau đĩ gắn thêm gen chỉ thị (kháng thuốc hoặc chất diệt cỏ) cùng với đoạn điều khiển (promote) phù hợp để chọn các thể biến nạp và cuối cùng là gắn gen cần biến nạp.
Chuyển gen bằng Agrobacterium đã thực hiện cĩ hiệu quả trên nhiều loại cây hai lá mầm nh: thuốc lá, cà chua, khoai tây (Cheng và cs, 1992), đậu tơng (Hinchee & cs, 1988; Dhir & cs, 1992), bơng (Perlak & cs, 1990), Arobidopsis, ngơ (Gould & cs, 1991; Citovsky & cs, 1994). Những thành cơng mới nhất trên lúa (Hiei & cs, 1994; Rashid & cs, 1996) đã làm cho phơng pháp chuyển gen bằng Agrobacterium trở nên hấp dẫn và củng cố vị trí của nĩ nh các nhà tiền bối hy vọng ngay từ đầu. Cho đến nay chuyển gen thơng qua Agrobacterium là phơng pháp cho tần số biến nạp cao hơn và cĩ thể xác định đợc sự xâm nhập ổn định hơn bất cứ phơng pháp chuyển gen nào (Chan & cs, 1993)
5.2.2. Phơng pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus.
Phơng pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus là phơng pháp gắn ADN virus vào T -ADN của Ti plasmid và chuyển vào tế bào thực vật. Khi vào tế bào thì ADN virus đợc giải phĩng để tạo virus hoạt động và xâm nhập vào genơm tế bào gần vùng u do
Agrobacterium gây nên. Bằng phơng pháp này Grimsley và cs (1987) lần đầu tiên cho (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thấy khả năng chuyển gen ở cây ngũ cốc bằng Agrobacterium.
5.2.3. Phơng pháp chuyển gen trực tiếp.
Phơng pháp chuyển gen trực tiếp (Paszkowski & cs, 1988) là phơng pháp chuyển ADN thơng qua xử lý polyethylen glycol (PEG). Đây là phơng pháp chuyển gen cho hiệu quả cao. Bằng phơng pháp này đã nhận đợc các cây mang gen biến nạp ổn định và di truyền qua các thế hệ (Potrykus & cs, 1985). Phơng pháp này cĩ các u điểm nh: tần số chuyển nạp đồng thời gen chỉ thị và gen cần biến nạp cao; cĩ thể chuyển gen vào protoplast bất kỳ lồi cây nào. Tuy nhiên vấn đề tái sinh cây từ protoplast cịn khĩ khăn ở một số lồi cây. Mặc dù đã cĩ nhiều thành tựu trong nuơi cấy protoplast nhất là protoplast của các giống cây cĩ giá trị kinh tế nh lúa, ngơ, luá mì, đại mạch ... nhng phần lớn việc tách nuơi tế bào đều phụ thuộc vào việc thiết lập hệ thống nuơi cấy phơi để làm nguyên liệu ban đầu mà điều này khơng phải dễ thực hiện đối với các giống cây trong sản xuất.
5.2.4. Phơng pháp chuyển gen bằng súng bắn gen.
Phơng pháp bắn gen là phơng pháp sử dụng các hạt kim loại (vàng hoặc vonfram) đợc bao bọc bởi ADN và bắn vào tế bào. Bằng phơng pháp này cĩ thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Ngời ta hy vọng phơng pháp này sẽ giải quyết tất cả các vấn đề chuyển gen, nhng cho đến nay tần số biến nạp bằng phơng pháp bắn gen cịn thấp và thờng xuyên nhận đợc cây biến nạp khảm (cây cĩ các tế bào biến nạp và tế bào khơng đợc biến nạp). Cĩ thể nĩi đến một số u điểm của phơng pháp bắn gen là:
- Thao tác dễ dàng.
- Bắn một lần đợc nhiều tế bào.
- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuơi cấy, các mơ).
Cây đậu tơng biến nạp đầu tiên đã nhận đợc bằng phơng pháp này (McCabe & cs, 1988). Nhiều phịng thí nghiệm đã nhận đợc cây ngơ biến nạp trong cùng thời gian (Fromm & cs, 1990; Gordom- Kamm & cs, 1990). Một vấn đề tồn tại quan trọng là tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus (1991) thì u điểm thực sự của phơng pháp bắn gen là ứng dụng trong nghiên cứu sự thể hiện tạm thời của gen. Nhng trong những năm gần đây đã cĩ hàng loạt các cơng bố về biến nạp thành cơng trên lúa (Zhang & cs, 1996), đu đủ, mía, bơng ... đã khẳng định những u việt của phơng pháp này.
5.2.5. Phơng pháp vi tiêm.
Phơng pháp vi tiêm P (microinjection) vào hợp tử và phơi từ hạt phấn. Phơng pháp vi tiêm là phơng pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đa ADN vào những tế bào nhất định (Neuhaus & Spangenberg, 1990). Phơng pháp này đã tạo đợc dịng biến nạp từ protoplast và cây biến nạp khảm từ phơi phát triển từ hạt phấn ở cây cải dầu. Giống phơng pháp bắn gen, vi tiêm cĩ thể đa ADN vào những tế bào xác định cĩ thành xellulơ. Vi tiêm hạn chế hơn bắn gen ở chổ một phát tiêm chỉ đợc một tế bào và thao tác cần khéo léo hơn. Vi tiêm cĩ một số u điểm sau:
- Cĩ thể tối u lợng ADN đa vào tế bào.
- Cĩ thể quyết định đa ADN vào loại tế bào nào.
- Cĩ thể đa một cách chính xác thậm chí vào tận nhân và cĩ thể quan sát đuợc. - Các tế bào cĩ cấu trúc nhỏ nh hạt phấn và tế bào tiền phơi mặc dù hạn chế về số lợng cũng cĩ thể tiêm một cách chính xác.
- Cĩ thể thực hiện nuơi cấy riêng rẽ các tế bào vi tiêm. - Cĩ thể biến nạp mọi giống cây .
Cho đến nay bằng các phơng pháp kể trên đều đã nhận đuợc cây biến nạp. Ngồi ra một số phơng pháp khác cũng đợc thực hiện nhng cha cĩ kết quả hoặc kết quả cha khẳng định, đĩ là các phơng pháp sau:
- Phơng pháp ủ hạt khơ hoặc phơi trong dung dịch ADN.
- Phơng pháp biến nạp thơng qua hạt phấn. Phơng pháp này dựa vào cơ sở là ADN cĩ thể đợc xâm nhập vào hạt phấn ở giai đoạn nảy mầm và cĩ thể di chuyển vào nhân của tế bào hạt phấn hoặc hợp tử qua ống phấn (Hess, 1987).
- Phơng pháp đờng dẫn ống phấn (Luo, 1988). Phơng pháp này cũng tơng tự nh ph- ơng pháp biến nạp thơng qua hạt phấn là đa ADN vào hợp tử bằng ống phấn.
- Phơng pháp vĩ tiêm (macroinjection). Phơng pháp này sử dụng kim tiêm cĩ đờng kính lớn hơn đờng kính tế bào để đa ADN vào tế bào, các tế bào này bị phá vỡ và ADN xâm nhập vào tế bào bị thơng rồi sau đĩ đợc chuyển vào các tế bào bên cạnh
- Phơng pháp xung điện (electropoation). trong phơng pháp này, dùng hiện tuợng phĩng điện để tạo lỗ trên màng tế bào làm cho việc đa ADN vào tế bào dễ dàng hơn, nhất là khi ADN đã tiếp giáp với màng tế bào. Đối với protoplast, phơng pháp xung điện đã cĩ một số kết quả khích lệ (Fromm, 1987), nhng cha cĩ những chứng minh chắc chắn cho sự biến nạp. Hơn nữa việc nuơi cấy protoplast ở một số lồi cây vẫn cịn gặp nhiều khĩ khăn.
- Ahokas (1989) đã sử dụng điện di để vận chuyển ADN vào mơ phân sinh chồi từ hạt đại mạch để xem phơng pháp điện di ADN qua mơ cĩ thể vận chuyển gen vào tế bào hay khơng. Kết quả tác giả nhận đợc sự thể hiện tạm thời của gen chỉ thị (GUS) nhng khơng chứng minh đợc sự biến nạp ổn định.
- Liposom cĩ chứa ADN cũng đã đợc sử dụng nh một phơng tiện để đa gen ngoại lai vào tế bào thơng qua dung hợp (Caboche, 1990) hoặc vi tiêm vào khơng bào (Lucas, 1990). Cả hai phơng pháp này đều cha thu đựợc kết quả.
- Phơng pháp vi laser đợc ứng dụng để tạo lỗ hổng trên màng tế bào sau đĩ ủ tế bào với dung dịch ADN đợc Weber (1990) sử dụng nh một phơng pháp chuyển gen khơng cần vectơ, nhng sau một thời gian dài vẫn cha cĩ kết quả chắc chắn về sự xâm nhập của ADN vào tế bào (1995) Guo đã kết hợp việc xử lý tế bào với dung dịch đẳng tr- ơng để rút bớt nớc từ tế bào sau đĩ chuyển vào mơi trờng cĩ thế năng thẩm thấu yếu cĩ chứa ADN ngoại lai và dùng laser tạo lỗ trên màng tế bào để ADN xâm nhập vào tế bào. Bằng phơng pháp này các tác giả đã quan sát thấy sự thể hiện của gen biến nạp sau khi xử lý tế bào và ở cây tái sinh.
Trong nơng nghiệp, kĩ thuật chuyển gen đem lại rất nhiều lợi ích:
- Chuyển gen kháng sâu bệnh vào các giồng cây trồng nh chuyển gen Bt vào cây bơng để tạo ra giống bơng kháng sâu hại.
- Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ vào nhiều giống cây trồng nh ngơ, bơng, đậu t- ơng. Các giống này đã đợc Bộ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn Việt Nam cho trồng thử tại huyện Khối Châu – Hng Yên năm 2011 và cho kết quả rất khả quan.
- Chuyển gen S vào tế bào chất của lúa để tạo ra dịng lúa bất dục đực tế bào chất. Đây là bớc khơng thể thiếu đợc trong sản xuất lúa lai. Việt phát hiện ra và chuyển thành cơng gen S vào tế bào chất đã mở ra bớc ngợc lớn cho ngành sản xuất lúa lai, gĩp phần đảm bảo an ninh lơng thực trên tồn cầu.
- Chuyển gen sinh auxin và mẫn cảm auxin hoạt động đặc thù bầu nhụy vào các giống cam, quýt, cà chua đã tạo ra rất nhiều giống cây ăn quả khơng hạt, qua đĩ nâng cao chất lợng và giá thành hoa quả. Mỹ là một trong những nớc đi đầu trong lĩnh vực này.
- Nhờ kỹ thuật chuyển gen đã giúp tạo ra những giống mang nhiều đặc tình quý, nh gạo vàng chứa nhiều chất tiền vitamin A (β- caroten). Đây là kết quả hợp tác của nhiều nhà khoa học thuộc các nớc Mỹ, Đức, Thụy Sỹ trong vịng 20 năm và tiêu tốn hết 100 triệu đơla. Các nhà khoa học đã chuyển đợc 7 gen liên quan đến quá trình tổng hợp β- caroten vào giống lúa LD309 để tạo ra giống lúa gạo vàng. Giống lúa gạo vàng khơng ngừng đợc hồn thiện, năm 2000 tạo ra giống lúa gạo vàng thế hệ I cĩ hàm lợng β- caroten gấp 200 lần gạo trắng, đến năm 2005 tạo ra giống lúa gạo vàng thế hệ II cĩ hàm l- ợng β- caroten gấp 4600 lần gạo trắng, điều này mang lại nhiều hi vong cho các nớc nghèo trịng việc phịng và chữa bệnh thiếu vitamin A. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tĩm lại, thành tựu nổi bật của kĩ thuật chuyển gen là cho phép tái tổ hợp di truyền giữa các lồi đứng xa nhau trong bậc thang phân loại mà bằng phơng pháp lai khơng thế thực hiện đợc.