khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất montanide isa 50v2

1 MỞ ĐẦU Ngày nay bệnh uốn ván vẫn còn là bệnh gây tử vong không ít đối với các nước kém phát triển, các n ước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Tr ên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh uốn ván dẫn đến tử vong c òn cao. Trong những năm gần đây nhờ những công trình nghiên cứu phòng và điều trị uốn ván, nhất l à chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ em và phụ nữ mang thai được tổ chức y tế thế giới phát động đã làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh uốn ván xuống 30 – 48% [3]. Tuy nhiên các đối tượng khác như người già, người trung niên chưa được tiêm phòng uốn ván, hay có tiêm phòng nhưng chưa tiêm nh ắc lại rất lớn, đã làm cho hiệu quả của việc miễn dịch chủ động bằng cách ti êm phòng vacxin u ốn ván còn hạn chế. Hơn nữa tình trạng tai nạn giao thông hiện nay tăng l ên rất nhiều so với các năm trước nên số lượng người có nguy cơ mắc uốn ván cũng tăng theo. V ì vậy tiêm huyết thanh kháng độc tố uốn ván (SAT) vẫn l à cách điều trị dự phòng hữu hiệu. Từ lâu huyết thanh điều trị l à biện pháp miễn dịch thụ động đ ược dùng để trung hoà lại độc tố của vi khuẩn uốn ván. Tuy nhi ên ngày nay nhu c ầu về huyết thanh uốn ván tăng lên do số người có nguy cơ mắc bệnh cao. Vì vậy nghiên cứu ra quy trình gây miễn dịch sản xuất huyết thanh có hiệu giá cao l à mục tiêu đặt ra hàng đầu. Viện Vacxin hiện đang từng bước áp dụng qui trình miễn dịch ngựa để cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng uốn ván tiến tới nâng cao chất l ượng và số lượng đồng thời giảm giá th ành, vì vậy chúng tôi thực hiện đề t ài: “Khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất Montanide ISA 50V2”. Mục tiêu của đề tài: 1. So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ngựa đối với hai loại tá chất d ùng để pha kháng nguyên: Nhôm phosphate (AlPO 4 ) và Montanide ISA 50V2. 2. Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguy ên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh uốn ván. 1.1.1. Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván [8], [10].  Bệnh uốn ván được mô tả lần đầu tiên từ thời Hypocrate. Năm 1854 Simpon đã mô tả được triệu chứng uốn ván giống nh ư bị ngộ độc Strychnin…  Năm 1884 Carle và Rottone đ ã chứng minh tính chất nhiễm khuẩn uốn ván và mô tả bệnh uốn ván điển h ình ở thỏ bằng cách ti êm dịch nghiền của vết thương tấy mủ của người mắc bệnh cho thỏ.  Năm 1885 Nicholaire đ ã tìm thấy loại trực khuẩn uốn ván nh ưng không phân lập được chủng thuần khiết. Ông cho rằng nguy ên nhân gây ra bệnh uốn ván là do chất độc từ trực khuẩn n ày tiết ra giống như Strychnin.  Năm 1886 Rosebach t ìm thấy nha bào của vi khuẩn uốn ván.  Năm 1989 Kitazazo đ ã phân lập được trực khuẩn uốn ván từ một vết thương tấy mủ, thuần khiết đ ược trực khuẩn này trong môi trường nuôi cấy nhân tạo và nhận thấy có chứa một độc tố ho à tan, độc tố này gây nên triệu chứng uốn ván. 1.1.2. Vi khuẩn uốn ván [8], [ 10]. Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng 0.3 – 0,5 µm, dài 2,0 – 2,5 µm di động, có khả năng h ình thành nha bào, mọc tốt trong môi trường yếm khí. Nha b ào uốn ván có sức chịu đựng rất tốt, tồn tại nhiều năm trong đất b ùn, môi trường không có ánh sáng, chịu đựng được nhiệt độ sôi từ 1 – 3 giờ, có thể tồn tại 10 giờ trong dung dịch phenol 5% và 24 giờ trong dung dịch phenol 3%. Nhiệt độ 100 0 C và các chất diệt khuẩn không diệt được nha bào, phải đun sôi kéo dài hay hấp ướt 120 0 C trong 30 phút thì mới có thể diệt trùng được nha bào uốn ván. Trực khuẩn uốn ván lên men đường glucose, sự hình thành nha bào sẽ tăng lên trong môi trường không có huyết thanh v à glucose. a. Khả năng gây bệnh [21]. Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm độc thần kinh trung ương bởi độc tố của trực khuẩn Clostridium tetani. Vi khuẩn gây bệnh uốn ván ở khắp mọi nơi: trong đất, 3 bụi, phân người và súc vật Bởi vậy, khả năng nhiễm bệnh đối với mọi ng ười đều rất lớn, nhất là ở thôn quê. Vết thương không cần sâu hay rộng, cũng vẫn có thể nhiễm trùng uốn ván. Phạm vi phân bố đã rộng mặt khác lại l à vi khuẩn sinh nha bào nên khả năng tồn tại trong thiên nhiên rất lâu và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường vết thương ở chân tay nên tỷ lệ mắc bệnh và chết do trực khuẩn uốn ván rất cao. Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh , độc tố này xâm nhập vào các sợi thần kinh ngoại vi của hệ thần kinh trung ương. Tại đây, nó ức chế sự giải phóng các chất ức chế thần kinh nh ư glycin gây nên các triệu chứng co cơ, co giật do tăng trương lực cơ, liệt cứng và bệnh nhân có thể chết do suy hô hấp. Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, trực khuẩn bị phá hủy bởi acid dạ d ày do đó không gây bệnh theo đường tiêu hóa [26]. b. Tính chất sinh hóa của độc tố uốn ván. Tác nhân dẫn đến tử vong chính l à độc tố uốn ván. Độc tố n ày có tính độc rất mạnh, liều gây chết ở ng ười là 2,5 ng/kg cân nặng. Độc tố uốn ván đ ược tổng hợp trong tế bào vi khuẩn uốn ván, trong các điều kiện nuôi cấy thí nghiệm độc tố được tách từ nước nổi của canh khuẩn. Độc tố n ày tan trong nước, bị phá hủy khi đun nóng ở nhiệt độ 70 0 C [21]. Thành phần hoá học của độc tố uốn ván gồm ba phần: một phần có tác dụng gây tan máu, có tính đ ộc với tim, dễ bị ôxy hoá gọi l à tetanolysin; một phần gọi là tetanospasmin gây co gi ật các cơ, là triệu chứng cơ bản của bệnh uốn ván; phần c òn lại là neurotoxin không gây co th ắt, không có vai trò trong cơ chế gây bệnh uốn ván. Độc tố này tan trong nước, bắt đầu kết tủa trong dung dịch v à mất hoạt tính khi pH = 6 nhưng bền ở pH = 5 khi có mặt glycerin, c ơ chế việc sản sinh độc tố của trực khuẩn uốn ván đến nay còn nhiều điều chưa rõ. Độc tố có độc lực rất mạnh, có ái tính cao với tế bào thần kinh. Bản chất của độc tố uốn ván l à một protein chứa 15,7% nitơ; 0,062% phospho; 1,04% sulfur, không có cacbonhydrat e và lipide, điểm đẳng điện là 5 – 5,2 pI [8], [23]. Độc tố uốn ván có trọng l ượng phân tử 150.000 dalton, l à một chuỗi polypeptide đơn, gồm một chuỗi nhẹ có trọng l ượng phân tử 53.000 dalton v à một chuỗi nặng có trọng lượng phân tử 107.000 dalton nối với nhau bởi cầu nối disulfur. 4 Độc tố uốn ván và độc tố ngộ độc thịt ( butolinum) thường gây bệnh nhiều nhất trong các loại độc tố do vi khuẩn tiết ra [10]. Trực khuẩn phát triển tại vết th ương và tiết ra độc tố làm tổn thương các nơron thần kinh trung ương gây nên co cứng cơ vân. Triệu chứng điển hình của bệnh uốn ván là những cơn co cơ và kèm theo đau, kh ởi đầu ở cơ vân, đến cơ cổ tiếp theo là khối cơ lưng [8]. Phần lớn các trường hợp chỉ vì giẫm phải một cái đinh rỉ, mắc chân vào một sợi dây kẽm gai, bị một cái dằm đâm v ào dưới móng tay, bị xước tay vết đốt của côn trùng, vết răng của chó, mèo đều có thể là nơi xâm nhập của loại vi khuẩn uốn ván [24]. 1.1.3. Dịch tễ học uốn ván. a. Trên thế giới: Bệnh uốn ván là một trong những vấn đề quan trọng của việc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Tỷ lệ ng ười mắc bệnh cao, tỷ lệ tử vong đến 60 – 80%. Trong 30 năm gần đây nhiều công tr ình nghiên cứu về phòng và điều trị bệnh uốn ván nhất l à chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ sơ sinh do WHO đề xướng đã làm cho tỷ lệ tử vong vì bệnh uốn ván giảm xuống 30 – 48% [10]. Tổ chức Y tế Thế giới công bố, có đến 715.000 người tử vong do uốn ván (1993), trong đó chủ yếu là uốn ván sơ sinh (dưới 28 tháng tuổi) ở các n ước đang phát triển. Con số này có giảm xuống 2 năm sau (chỉ c òn 515.000 năm 1995) [27]. Phân bố bệnh theo địa lý không đồng đều. T ùy thuộc vào sự phát triển kinh tế, mạng lưới Y tế nông thôn v à sự đầu tư của chính phủ mà bệnh thay đổi tùy theo từng nước. Các nước càng ở gần xích đạo, kém phát triển kinh tế, mạng l ưới Y tế nông thôn và hộ sinh càng yếu kém thì tỷ lệ bệnh càng cao [27]. Ở Mỹ bệnh uốn ván l à bệnh của người già, trong những năm gần đây theo kết quả điều tra về kháng thể uốn ván cho thấy rất nhiều ng ười trưởng thành không có kháng thể đủ để bảo vệ bệnh uốn ván [8]. Ở Anh và Wales trong thời gian từ 1969 – 1972, mỗi năm có 140 trường hợp mắc bệnh uốn ván. Từ năm 1973 đến năm 1982 mỗi năm có 46 tr ường hợp mắc bệnh uốn ván, trong đó có 5 tr ường hợp tử vong. Tron g năm 1983 có 10 trư ờng hợp, trong đó có 1 tử vong. Năm 1984 có 20 tr ường hợp trong đó có 3 tử vong. Cũng như ở Mỹ bệnh uốn ván ở Anh l à bệnh của tuổi trưởng thành. 5 Ở các nước đang phát triển tỷ lệ mắc và chết do bệnh uốn ván cao [10]. b. Việt Nam: Ở nước ta, chưa có một tổng kết toàn quốc về uốn ván trong những năm gần đây. Tuy nhiên với sự phát triển của mạng l ưới y tế và hộ sinh và nhất là chương trình chủng ngừa phòng uốn ván cho sản phụ ở quý cuối, uốn ván rốn trở n ên hiếm gặp ở các phòng cấp cứu sơ sinh. Chương trình tiêm chủng mở rông cũng l àm giảm tỷ lệ uốn ván ở trẻ em. Tuy nhi ên, ở người lớn, vấn đề phòng ngừa uốn ván chưa được quan tâm nhiều, n ên uốn ván cũng thường gặp [27]. Ở Khoa Y học lâm s àng nhiệt đới Bệnh viện Trung ương Huế, tỷ lệ uốn ván người lớn chiếm chừng 0,3% bệnh nhân nhập viện (1996). Tỷ lệ tử vong chừng 50%. Hầu hết là uốn ván toàn thể. Chỉ một vài ca thể cục bộ và thể đầu. Đường vào chủ yếu là từ vết thương ngoài da. Một số không tìm thấy đường vào hay sau một phẫu thuật (0,03%) [27]. Bảng 1.1: Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván tại Việt Nam (1990 – 2007) [22] Năm Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván (%). Năm Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván (%). 1990 24,0 1999 83,0 1991 21,0 2000 86,0 1992 38,0 2001 86,0 1993 69,0 2002 86,0 1994 76,0 2003 87,0 1995 80,0 2004 88,0 1996 89,0 2005 89,0 1997 86,0 2006 88,0 1998 82,0 2007 86,0 6 Công tác loại trừ UVSS ở nước ta ngày càng được tăng cường: Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván ngày càng tăng, từ 38,0% năm 1992 tăng l ên đến 69,0% năm 1993, các năm sau đó có xu h ướng ổn định ở mức tr ên 80% [19]. Một vài số liệu cụ thể, năm 1992 có 338 tr ường hợp mắc UVSS, đến năm 2003 giảm chỉ còn 76 trường hợp, và đến năm 2008 tỷ lệ UVSS chỉ còn 0,14/100.000 dân. Tỷ lệ tiêm vacxin uốn ván cho phụ nữ có thai từ năm 1995 đến nay luôn đạt trên 80%, tỷ lệ tiêm vacxin uốn ván cho phụ nữ 15 – 35 tuổi tại các huyện có nguy cơ UVSS luôn đạt trên 90% (Chương trình TCMR quốc gia – Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương). Việt Nam đã loại trừ được bệnh uốn ván s ơ sinh trên toàn quốc vào năm 2005 [19]. 1.2. Miễn dịch chống lại bệnh uốn ván. 1.2.1. Miễn dịch tự nhiên [14]. Kể từ lúc tìm ta nguyên nhân gây b ệnh uốn ván, một số tác giả đ ã quan tâm nghiên cứu miễn dịch tự nhiên có hay không đối với bệnh uốn ván. Song đến năm 1993 Tổ chức Y tế Thế giới đ ã đúc kết và chính thức nhận định loại miễn dịch n ày hầu như không có và nếu hạn hữu có thì cũng không đủ lượng kháng thể để ph òng bệnh uốn ván. Do đó việc gây miễn dịch chủ động bằng ph ương pháp tiêm vacxin uốn ván giữ một vai tr ò quan trọng trong việc phòng bệnh uốn ván. 1.2.2. Miễn dịch chủ động. Miễn dịch chủ động (active immunity) l à trạng thái miễn dịch của một c ơ thể do bộ máy miễn dịch của bản thân c ơ thể đó chủ động sinh ra khi đ ược kháng nguyên (được gọi là vacxin) kích thích. Đưa vacxin u ốn ván vào cơ thể kích thích tạo kháng thể kháng bệnh l à phương pháp phòng bệnh uốn ván có hiệu lực nhất. Vacxin uốn ván kích thích cơ thể con người tạo ra kháng thể trung hoà độc tố uốn ván, nhờ đó bảo vệ được cơ thể chống lại bệnh. Khả năng bảo vệ n ày tuỳ thuộc vào lượng độc tố uốn ván, h àm lượng của kháng thể uốn ván [10], [1]. Để gây miễn dịch chủ động có kết quả tốt, ng ày nay người ta nghiên cứu sản xuất những vacxin đơn giá như TT dùng cho người lớn; vacxin phối hợp hai thành phần như DT dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi, Td dùng cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên; vacxin phối hợp ba thành phần giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, xác vi khuẩn ho gà gọi là DTP dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi. Các giải độc tố th ường được 7 dùng kết hợp với tá chất để l àm tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch cho c ơ thể [13], [14]. Có thể phòng bệnh uốn ván suốt đời bằng cách ti êm vacxin như sau:  Tiêm vacxin DTP cho tr ẻ em dưới 6 tuổi.  Tiêm vacxin Td cho trẻ em từ 6 tuổi trở l ên.  Tiêm vacxin TT cho ph ụ nữ mang thai và lứa tuổi sinh đẻ (15 – 44 tuổi): Tiêm đủ 5 liều trong vòng 31 tháng, tiêm càng s ớm càng tốt khi có thai.  Tiêm vacxin TT cho nh ững người có nguy cơ mắc cao (người làm vườn, người làm việc ở các trang trại, công nhân xây dựng công tr ình…): Tiêm miễn dịch 3 liều trong vòng 6 tháng, cứ sau 5 – 10 năm tiêm nhắc lại một liều [14]. 1.2.3. Miễn dịch thụ động. Năm 1890, Berhing và Kitazato đ ã đặt nền móng cho kiểu miễn dịch thụ động. Về sau Roux đ ã đưa ra một quan điểm là có thể dùng huyết thanh miễn dịch để điều trị cho tất cả bệnh nhiễm tr ùng. Kiểu miễn dịch thụ động đ ược sử dụng trong những trường hợp phải tạo miễn dịch nhanh chóng khi có nguy c ơ mắc bệnh cao hoặc nghi ngờ bị nhiễm bệnh [8]. Nguyên tắc của miễn dịch thụ động l à đưa vào cơ thể bệnh nhân một l ượng kháng thể đặc hiệu được sản xuất từ súc vật hay ng ười đã được gây miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu. Kháng thể n ày sẽ trung hoà các độc tố hay virut trong máu của bệnh nhân. Một vấn đề q uan trọng trong miễn dịch thụ động l à thời gian miễn dịch rất ngắn, kháng thể đặc hiệu sẽ bị thải ra ngo ài. Vì vậy trong việc điều trị dự phòng bệnh uốn ván hay bệnh dại bao giờ ng ười ta cũng có sự phối hợp giữa miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động. Ng oài ra khi sử dụng huuyết thanh miễn dịch để phòng ngừa hay điều trị thường gây ra phản ứng dị ứng, bệnh huyết thanh. Để loại bỏ những phản ứng tr ên, người ta phải tinh chế huyết thanh miễn dịch để loại bỏ các phần tử không cần thiết đối với huyết thanh kh ác loài hay điều chế huyết thanh miễn dịch cùng loài (huyết thanh từ người) hoặc kháng thể đ ơn dòng [10]. 1.3. Huyết thanh. Sử dụng huyết thanh l à phương pháp tạo miễn dich thụ động rất có hiệu quả. Có thể điều chế kháng huyết thanh chống độc tố v à vi khuẩn từ máu ngựa được gây miễn dịch với kháng nguy ên hoặc từ máu người đã tiêm vacxin và có kháng th ể 8 cao. Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ - globulin lấy từ máu nhau thai. γ - globulin được tinh chế có ưu điểm đáng kể là giảm hẳn các phản ứ ng phụ cho người tiêm, đặc biệt có nồng độ kháng thể cao điều trị bệnh rất hữu hiệu [10]. 1.3.1. Tính chất lý hoá chung củ a huyết thanh [8]. Máu là dịch lỏng, nhớt, màu đỏ. Máu toàn phần gồm hai phần: - Tế bào máu: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu. - Huyết tương: Huyết thanh (serum), các yếu tố đông máu (sợi huyết fibrinogen)… Khi máu để đông tự nhiên thì các tế bào máu và các yếu tố đông máu bị đông lại, phần còn lại tách ra khỏi cục máu l à chất dịch màu vàng rơm gọi là huyết thanh. Máu có độ nhớt cao hơn nước:  nước = 1;  máu = 5;  huyết tương = 1,7 – 2,2. Độ nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh lý. Độ pH: độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu v ào nồng độ H + , OH - và có ý nghĩa rất quan trọng. Khi pH của huyết thanh không phải l à hằng số thì pH của máu cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong c ơ thể không xảy ra. Bởi vậy pH của huyết thanh luôn ở khoảng giá trị cố định 7,2 – 7,5. 1.3.2. Thành phần hoá học của huyết thanh. Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 – 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu vàng nhạt. Trong huyết thanh nước chiếm 90 – 91%, chất khô chiếm 9 – 10% gồm protein, đường, lipit, muối khoáng. Các chất vô cơ chính trong huyết thanh gồm cation nh ư Na + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ , và các anion Cl – , HCO 3 - , SO 4 2- , PO 4 3- … Ngoài ra huyết thanh còn chứa các yếu tố như I, Cu, Fe, Zn…, chúng t ồn tại ở dạng ion hoặc kết hợp với protein [10]. Các thành phần hữu cơ trong máu rất phức tạp, gồm: a. Protein: Là thành phần hữu cơ quan trọng nhất của huyết thanh động vật. Có nhiều loại protein huyết th anh, khoảng 100 – 150 loại khác nhau tuỳ theo cấu tạo v à nhiệm vụ của nó: albumin, globulin, fibrinogen, các men… số l ượng và tính chất 9 của các protein thay đổi tuỳ theo lo ài. Nghiên cứu bằng phương pháp lưỡng chiết quang, nhiễu xạ tia X, kính hiển vi điệ n tử thì mọi protein (trừ fibrinogen) đều có dạng hình cầu như albumin, globulin… Protein huyết thanh gồm 5 thành phần: albumin,  1 – globulin,  2 – globulin và γ - globulin. Nếu điện di miễn dịch tr ên gel tinh bột hoặc gel polyacrilamide có thể tách được 18 – 21 thành phần protein khác nhau. Protein huyết thanh có ở dạ ng tự do hoặc phức hợp với lipide (lipoprotein), glucid (glucoprotein), kim loại (metaloprotein), nucleic acid (nucleoprotein). - Albumin: Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị kết tủa bởi dung dịch muối b ão hoà. Trong các protein c ủa huyết thanh albumin chiếm một lượng lớn tới 56,6% vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy tr ì áp suất thẩm thấu của huyết t ương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể, tham gia vận chuyển các chất không tan trong máu nh ư bilirubin tự do, axit béo, một số thuốc… [2]. - Globulin: Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần. Globulin hoà tan trong dung d ịch muối loãng, không tan trong n ước tinh khiết hoặc trong các dung dịch có nồng độ vừa phải, bị đông vón bởi nhiệt. Có nhiều loại globulin:   1,  2 – globulin chiếm khoảng 13% tổng số protein huyết thanh:  1 tham gia cấu tạo glucoprotein, lipoprotein c òn  2 có ceruloplasmin (protein v ận chuyển đồng).  - globulin chiếm khoảng 11,7% trong đó có siderophilin (protein ch ứa sắt).  γ - globulin chiếm khoảng 18,6% protein huyết thanh, bao gồm những kháng thể. b. Các enzyme: Có rất nhiều enzyme trong huyết thanh như Amylase, Phosphatase, Transaminase… [10]. 10 c. Những chất có nitơ phi protein: Là những sản phẩm thoái hoá của protein, trong đó đa số l à những sản phẩm thoái hoá cuối c ùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, uric acid, bilirubin… Ngoài ra huy ết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian của protein như polypeptide và các amino acid tự do [2], [10]. d. Glucose [2]: Glucose máu dao đ ộng trong khoảng cố định. Chỉ số n ày tăng giảm trong các trường hợp bệnh lý. e. Lipide [2]: Lipide trong huyết thanh bao gồm triglyceride, phospholipide, ster ide, cholesterol. 1.3.3. Kháng thể [1],[ 10]. Kháng thể chính là protein thường được phát hiện ở phần γ - globulin của huyết thanh, dịch bạch huyết v à các dịch khác của cơ thể. Về cấu trúc và hoá tính đó là những γ - globulin điển hình, vì vậy không thể phân biệt được chúng với các γ - globulin “bình thường” bằng phương pháp hoá học. Chỉ có thể phát hiện kháng thể bằng “thuốc thử” đặc hiệu l à kháng nguyên tương ứng. Kháng thể được phát hiện từ những năm đầu của lịch sử miễn dịch. Sự kết hợp đặc biệt giữa k háng nguyên và kháng thể với khả năng sản xuất đ ược kháng thể đặc hiệu đ ã làm cho kháng thể được dùng rộng rãi vào mục đích chẩn đoán và điều trị. Các kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (Ig). Có nhiều lớp globulin miễn dịch khác nhau nhưng tất cả các lớp đều có đặc điểm cấu trúc giống nhau:  Mỗi phân tử Ig có hai chuỗi polypeptide nặng (H) và hai chuỗi polypeptide nhẹ (L).  Các chuỗi H và L bao giờ cũng từng đôi và giống nhau hoàn toàn trong mỗi phân tử Ig.  Tất cả các chuỗi Ig đều có chuỗi L thuộc t ype kappa hoặc lamda còn chuỗi H thì khác nhau. Các lớp globulin miễn dịch: IgG, IgA, IgD, IgE, IgM. [...]... 978 Gây miễn dịch bằng giải độc tố uốn ván tinh chế + tá chất Montanide ISA 50 V2, pha với tỷ lệ 1:1 Nhóm B: Gồm 6 con ngựa số: 979, 981, 982, 983, 984, 987 Gây miễn dịch bằng giải độc tố uốn ván tinh chế + tá chất Al PO4, pha theo quy trình hiện hành của I VAC 2.2.2 Quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván SAT dùng cho cả hai lô ngựa A và B [11] Hai nhóm ngựa đều dùng một phác đồ tiêm miễn dịch. .. uốn ván Năm 1922 Ramon đ ã đưa ra phương pháp giải độc tố uốn ván và xác định hiệu giá huyết thanh uốn ván bằng phương pháp lên bông đã làm cho công tác sản xuất huyết thanh điều trị nói chung và huyết thanh kháng độc tố uốn ván nói ri êng tiến lên một bước mới Năm 1939, Pope đề xuất phương pháp tinh chế huyết thanh kháng độc tố uốn ván Từ đó đến nay việc sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có... 1.6.2.5 Miễn dịch: a Kháng nguyên [8]: Kháng nguyên để gây miễn dịch ngựa có thể l à giải độc tố, độc tố uốn ván thô hay độc tố, giải độc tố uốn ván tinh chế 28 Độc tố uốn ván thường sử dụng sau giai đoạn miễn dịch cao độ hay miễn dịch nhắc lại như qui trình của Viện Pasteur Paris (1962): độc tố uốn ván thô phải có MLD tối thiểu 100.000 MLD và người ta cho rằng độc tố có độc lực c àng cao đáp ứng miễn dịch. .. sạch kháng nguyên 1000 Lf/mg protein Nitơ Sau khi điều chế được kháng nguyên tinh sạch, người ta sử dụng để sản xuất vacxin phòng uốn ván cho người (có thể đơn giá, có thể kết hợp với các kháng nguyên khác tạo vacxin đa giá) và gây miễn dịch trên súc vật sản xuất huyết thanh kháng uốn ván (SAT) phục vụ ph òng và điều trị bệnh uốn ván 1.6.2 Miễn dịch súc vật sản xuất h uyết thanh kháng độc tố uốn ván. .. diện kháng nguyên với các tế bào có thẩm quy n miễn dịch Kích thích sinh kháng thể và hoạt hóa các cytokin 1.6 Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật [8], [10] SAT (Serum Anti Tetanus) là m ột chế phẩm lấy từ huyết thanh ngựa Ng ười ta tiêm cho ngựa kháng nguyên uốn ván, một thời gian sau trong huyết thanh ngựa xuất hiện kháng thể chống uốn ván, ng ười ta khai thác huyết thanh. .. bò, cừu đã được miễn dịch với những bệnh nhiễ m trùng khác nhau) đem lo ại bỏ các protein không đặc hiệu, còn kháng thể giữ ở nồng độ cao Tuỳ theo tác nhân gây miễn dịch, người ta phân biệt: Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đ ã được tiêm độc tố vi khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD ), chống uốn ván (SAT) Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đ ã được miễn dịch đối với virus... gốc từ thực vật Dạng nhũ dịch W/O của Montanide ISA 50V2 đ ược thể hiện qua hình vẽ sau: Hình 1.2: Thành phần và dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50V2 18 1.5.2 Những tính chất của MONTANIDE ISA 50V2 [17] Bảng 12:Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 Hình thái Nhận dạng Độ nhớt (Brookfield LVF, S2,) Trọng lượng riêng (tại 250C) Chỉ số khúc xạ (tại 250C) Thời hạn sử dụng Dịch màu vàng sáng Tương... suốt quá tr ình miễn dịch Các lần miễn dịch cao độ thay đổi tuỳ theo qui tr ình Thời gian miễn dịch cao độ tối đa 2 tháng (qui trình Viện Pasteur Paris) Trong quá tr ình miễn dịch cao độ người ta phải kiểm tra đáp ứng miễn dịch của ngựa để t ìm ngựa có đáp ứng miễn dịch tốt v à loại bỏ ngựa không có đáp ứng miễn dịch Miễn dịch nhắc lại: sau giai đoạn miễn dịch cao độ, ngựa có đáp ứng miễn dịch tốt hàng... mạch 1.4 Tá chất gây miễn dịch 1.4.1 Khái niệm tá chất [7]: Năm 1922, Ramon phát hiện và đưa ra khái niệm về tá chất (Adjuvant) trong lĩnh vực vacxin và các chế phẩm sinh học, đó là những chất khi chộn lẫn với kháng nguyên có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch trên người hoặc động vật Người ta ứng dụng tá chất trong lĩnh vực sản xuất vacxin để tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh và kéo dài Tá chất được sử dụng cả... 58 03 65 66 70 Kháng nguyên & tá chất Đường tiêm GĐTUVTC (1 ml 100Lf) + 01 ml Dưới da Montanide ISA 50V2 (tỷ lệ 1:1, TT/TT) 200Lf GĐTUVTC + Montanide ISA Dưới da 50V2 (1:1, TT/TT) 300Lf GĐTUVTC + Montanide ISA Dưới da 50V2 (1:1, TT/TT) 400Lf GĐTUVTC + Montanide ISA Dưới da 50V2 (1:1, TT/TT) 800Lf GĐTUVTC + Montanide ISA Dưới da 50V2 (1:1, TT/TT) 1200LfGĐTUVTC + Montanide ISA Dưới da 50V2 (1:1, TT/TT) . t ài: Khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất Montanide ISA 50V2 . Mục tiêu của đề tài: 1. So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ngựa đối với hai loại tá chất d ùng. chống uốn ván (SAT).  Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đ ã được miễn dịch đối với virus dại dùng để chống bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virut Vi êm gan B…  Huyết thanh kháng. để pha kháng nguyên: Nhôm phosphate (AlPO 4 ) và Montanide ISA 50V2. 2. Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguy ên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng