khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất montanide isa 50v2

Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguy ên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao... Nguyên tắc của miễn dịch thụ động l à đưa vào cơ thể b

đã làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh uốn ván xuống 30 – 48% [3] Tuy nhiên các đối tượng khác như người già, người trung niên chưa được tiêm phòng uốn ván, hay có tiêm phòng nhưng chưa tiêm nhắc lại rất lớn, đã làm cho hiệu quả của việc miễn dịch chủ động bằng cách ti êm phòng vacxin uốn ván còn hạn chế Hơn nữa tình trạng tai nạn giao thông hiện nay tăng l ên rất nhiều so với các năm trước nên số lượng người có nguy cơ mắc uốn ván cũng tăng theo V ì vậy tiêm huyết thanh kháng độc tố uốn ván (SAT) vẫn l à cách điều trị dự phòng hữu hiệu.

Từ lâu huyết thanh điều trị l à biện pháp miễn dịch thụ động đ ược dùng để trung hoà lại độc tố của vi khuẩn uốn ván Tuy nhi ên ngày nay nhu cầu về huyết thanh uốn ván tăng lên do số người có nguy cơ mắc bệnh cao Vì vậy nghiên cứu ra quy trình gây miễn dịch sản xuất huyết thanh có hiệu giá cao l à mục tiêu đặt ra hàng đầu.

Viện Vacxin hiện đang từng bước áp dụng qui trình miễn dịch ngựa để cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng uốn ván tiến tới nâng cao chất l ượng

và số lượng đồng thời giảm giá th ành, vì vậy chúng tôi thực hiện đề t ài: “Khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất Montanide ISA 50V2”.

Mục tiêu của đề tài:

1 So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ngựa đối với hai loại tá chất d ùng để pha kháng nguyên: Nhôm phosphate (AlPO4) và Montanide ISA 50V2.

2 Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguy ên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh uốn ván.

1.1.1 Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván [8], [10].

 Bệnh uốn ván được mô tả lần đầu tiên từ thời Hypocrate Năm 1854 Simpon đã mô tả được triệu chứng uốn ván giống nh ư bị ngộ độc Strychnin…

 Năm 1884 Carle và Rottone đ ã chứng minh tính chất nhiễm khuẩn uốn ván và mô tả bệnh uốn ván điển h ình ở thỏ bằng cách tiêm dịch nghiền của vết thương tấy mủ của người mắc bệnh cho thỏ.

 Năm 1885 Nicholaire đ ã tìm thấy loại trực khuẩn uốn ván nh ưng không phân lập được chủng thuần khiết Ông cho rằng nguy ên nhân gây ra bệnh uốn ván là

do chất độc từ trực khuẩn n ày tiết ra giống như Strychnin.

 Năm 1886 Rosebach t ìm thấy nha bào của vi khuẩn uốn ván.

 Năm 1989 Kitazazo đ ã phân lập được trực khuẩn uốn ván từ một vết thương tấy mủ, thuần khiết được trực khuẩn này trong môi trường nuôi cấy nhân tạo

và nhận thấy có chứa một độc tố ho à tan, độc tố này gây nên triệu chứng uốn ván.

1.1.2 Vi khuẩn uốn ván [8], [ 10].

Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn Gram

(+), có kích thước rộng 0.3 – 0,5 µm, dài 2,0 – 2,5 µm di động, có khả năng hình thành nha bào, mọc tốt trong môi trường yếm khí Nha bào uốn ván có sức chịu đựng rất tốt, tồn tại nhiều năm trong đất b ùn, môi trường không có ánh sáng, chịu đựng được nhiệt độ sôi từ 1 – 3 giờ, có thể tồn tại 10 giờ trong dung dịch phenol 5%

và 24 giờ trong dung dịch phenol 3% Nhiệt độ 1000C và các chất diệt khuẩn không diệt được nha bào, phải đun sôi kéo dài hay hấp ướt 1200C trong 30 phút thì mới có thể diệt trùng được nha bào uốn ván.

Trực khuẩn uốn ván lên men đường glucose, sự hình thành nha bào sẽ tăng lên trong môi trường không có huyết thanh v à glucose.

a Khả năng gây bệnh [21].

Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm độc thần kinh trung ương bởi độc tố của trực

khuẩn Clostridium tetani Vi khuẩn gây bệnh uốn ván ở khắp mọi nơi: trong đất,

bụi, phân người và súc vật Bởi vậy, khả năng nhiễm bệnh đối với mọi ng ười đều rất lớn, nhất là ở thôn quê Vết thương không cần sâu hay rộng, cũng vẫn có thể nhiễm trùng uốn ván.

Phạm vi phân bố đã rộng mặt khác lại là vi khuẩn sinh nha bào nên khả năng tồn tại trong thiên nhiên rất lâu và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường vết thương ở chân tay nên tỷ lệ mắc bệnh và chết do trực khuẩn uốn ván rất cao.

Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh , độc tố này xâm nhập vào các sợi thần kinh ngoại vi của hệ thần kinh trung ương Tại đây, nó ức chế sự giải phóng các chất ức chế thần kinh nh ư glycin gây nên các triệu chứng co cơ, co giật do tăng trương lực cơ, liệt cứng và bệnh nhân có thể chết do suy hô hấp Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, trực khuẩn bị phá hủy bởi acid dạ d ày do đó không gây bệnh theo đường tiêu hóa [26].

b Tính chất sinh hóa của độc tố uốn ván.

Tác nhân dẫn đến tử vong chính l à độc tố uốn ván Độc tố n ày có tính độc rất mạnh, liều gây chết ở ng ười là 2,5 ng/kg cân nặng Độc tố uốn ván đ ược tổng hợp trong tế bào vi khuẩn uốn ván, trong các điều kiện nuôi cấy thí nghiệm độc tố được tách từ nước nổi của canh khuẩn Độc tố n ày tan trong nước, bị phá hủy khi đun nóng ở nhiệt độ 700C [21].

Thành phần hoá học của độc tố uốn ván gồm ba phần: một phần có tác dụng gây tan máu, có tính đ ộc với tim, dễ bị ôxy hoá gọi l à tetanolysin; một phần gọi là tetanospasmin gây co gi ật các cơ, là triệu chứng cơ bản của bệnh uốn ván; phần c òn lại là neurotoxin không gây co th ắt, không có vai trò trong cơ chế gây bệnh uốn ván Độc tố này tan trong nước, bắt đầu kết tủa trong dung dịch v à mất hoạt tính khi pH

= 6 nhưng bền ở pH = 5 khi có mặt glycerin, c ơ chế việc sản sinh độc tố của trực khuẩn uốn ván đến nay c òn nhiều điều chưa rõ Độc tố có độc lực rất mạnh, có ái tính cao với tế bào thần kinh Bản chất của độc tố uốn ván l à một protein chứa 15,7% nitơ; 0,062% phospho; 1,04% sulfur, không có cacbonhydrat e và lipide, điểm đẳng điện là 5 – 5,2 pI [8], [23].

Độc tố uốn ván có trọng l ượng phân tử 150.000 dalton, l à một chuỗi polypeptide đơn, gồm một chuỗi nhẹ có trọng l ượng phân tử 53.000 dalton v à một chuỗi nặng có trọng lượng phân tử 107.000 dalton nối với nhau bởi cầu nối disulfur.

Độc tố uốn ván và độc tố ngộ độc thịt (butolinum) thường gây bệnh nhiều nhất

trong các loại độc tố do vi khuẩn tiết ra [10].

Trực khuẩn phát triển tại vết th ương và tiết ra độc tố làm tổn thương các nơron thần kinh trung ương gây nên co cứng cơ vân Triệu chứng điển hình của bệnh uốn ván là những cơn co cơ và kèm theo đau, kh ởi đầu ở cơ vân, đến cơ cổ tiếp theo là khối cơ lưng [8].

Phần lớn các trường hợp chỉ vì giẫm phải một cái đinh rỉ, mắc chân vào một sợi dây kẽm gai, bị một cái dằm đâm v ào dưới móng tay, bị xước tay vết đốt của côn trùng, vết răng của chó, mèo đều có thể là nơi xâm nhập của loại vi khuẩn uốn ván [24].

1.1.3 Dịch tễ học uốn ván.

a Trên thế giới:

Bệnh uốn ván là một trong những vấn đề quan trọng của việc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng Tỷ lệ ng ười mắc bệnh cao, tỷ lệ tử vong đến 60 – 80% Trong 30 năm gần đây nhiều công trình nghiên cứu về phòng và điều trị bệnh uốn ván nhất l à chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ sơ sinh do WHO đề xướng đã làm cho tỷ

lệ tử vong vì bệnh uốn ván giảm xuống 30 – 48% [10].

Tổ chức Y tế Thế giới công bố, có đến 715.000 người tử vong do uốn ván (1993), trong đó chủ yếu là uốn ván sơ sinh (dưới 28 tháng tuổi) ở các n ước đang phát triển Con số này có giảm xuống 2 năm sau (chỉ c òn 515.000 năm 1995) [27].

Phân bố bệnh theo địa lý không đồng đều T ùy thuộc vào sự phát triển kinh

tế, mạng lưới Y tế nông thôn và sự đầu tư của chính phủ mà bệnh thay đổi tùy theo từng nước Các nước càng ở gần xích đạo, kém phát triển kinh tế, mạng l ưới Y tế nông thôn và hộ sinh càng yếu kém thì tỷ lệ bệnh càng cao [27].

Ở Mỹ bệnh uốn ván là bệnh của người già, trong những năm gần đây theo kết quả điều tra về kháng thể uốn ván cho thấy rất nhiều ng ười trưởng thành không

có kháng thể đủ để bảo vệ bệnh uốn ván [8].

Ở Anh và Wales trong thời gian từ 1969 – 1972, mỗi năm có 140 trường hợp mắc bệnh uốn ván Từ năm 1973 đến năm 1982 mỗi năm có 46 tr ường hợp mắc bệnh uốn ván, trong đó có 5 tr ường hợp tử vong Tron g năm 1983 có 10 trư ờng hợp, trong đó có 1 tử vong Năm 1984 có 20 tr ường hợp trong đó có 3 tử vong Cũng như ở Mỹ bệnh uốn ván ở Anh l à bệnh của tuổi trưởng thành.

Ở các nước đang phát triển tỷ lệ mắc và chết do bệnh uốn ván cao [10].

b Việt Nam:

Ở nước ta, chưa có một tổng kết toàn quốc về uốn ván trong những năm gần đây Tuy nhiên với sự phát triển của mạng l ưới y tế và hộ sinh và nhất là chương trình chủng ngừa phòng uốn ván cho sản phụ ở quý cuối, uốn ván rốn trở n ên hiếm gặp ở các phòng cấp cứu sơ sinh Chương trình tiêm chủng mở rông cũng làm giảm

tỷ lệ uốn ván ở trẻ em Tuy nhi ên, ở người lớn, vấn đề phòng ngừa uốn ván chưa được quan tâm nhiều, nên uốn ván cũng thường gặp [27].

Ở Khoa Y học lâm s àng nhiệt đới Bệnh viện Trung ương Huế, tỷ lệ uốn ván người lớn chiếm chừng 0,3% bệnh nhân nhập viện (1996) Tỷ lệ tử vong chừng 50% Hầu hết là uốn ván toàn thể Chỉ một vài ca thể cục bộ và thể đầu Đường vào chủ yếu là từ vết thương ngoài da Một số không tìm thấy đường vào hay sau một phẫu thuật (0,03%) [27].

Bảng 1.1: Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh

uốn ván tại Việt Nam (1990 – 2007) [22]

Năm Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh

được bệnh uốn ván (%) Năm

Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván (%).

Công tác loại trừ UVSS ở nước ta ngày càng được tăng cường: Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván ngày càng tăng, từ 38,0% năm 1992 tăng l ên đến 69,0% năm 1993, các năm sau đó có xu h ướng ổn định ở mức trên 80% [19] Một vài số liệu cụ thể, năm 1992 có 338 tr ường hợp mắc UVSS, đến năm 2003 giảm chỉ còn 76 trường hợp, và đến năm 2008 tỷ lệ UVSS chỉ còn 0,14/100.000 dân Tỷ lệ tiêm vacxin uốn ván cho phụ nữ có thai từ năm 1995 đến nay luôn đạt trên 80%, tỷ lệ tiêm vacxin uốn ván cho phụ nữ 15 – 35 tuổi tại các huyện có nguy

cơ UVSS luôn đạt trên 90% (Chương trình TCMR quốc gia – Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương) Việt Nam đã loại trừ được bệnh uốn ván sơ sinh trên toàn quốc vào năm 2005 [19].

1.2 Miễn dịch chống lại bệnh uốn ván.

1.2.2 Miễn dịch chủ động.

Miễn dịch chủ động (active immunity) l à trạng thái miễn dịch của một c ơ thể do bộ máy miễn dịch của bản thân c ơ thể đó chủ động sinh ra khi đ ược kháng nguyên (được gọi là vacxin) kích thích Đưa vacxin u ốn ván vào cơ thể kích thích tạo kháng thể kháng bệnh l à phương pháp phòng bệnh uốn ván có hiệu lực nhất Vacxin uốn ván kích thích cơ thể con người tạo ra kháng thể trung hoà độc tố uốn ván, nhờ đó bảo vệ được cơ thể chống lại bệnh Khả năng bảo vệ n ày tuỳ thuộc vào lượng độc tố uốn ván, hàm lượng của kháng thể uốn ván [10], [1].

Để gây miễn dịch chủ động có kết quả tốt, ng ày nay người ta nghiên cứu sản xuất những vacxin đơn giá như TT dùng cho người lớn; vacxin phối hợp hai thành phần như DT dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi, Td dùng cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên; vacxin phối hợp ba thành phần giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, xác vi khuẩn ho gà gọi là DTP dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi Các giải độc tố th ường được

dùng kết hợp với tá chất để l àm tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch cho c ơ thể [13], [14].

Có thể phòng bệnh uốn ván suốt đời bằng cách ti êm vacxin như sau:

 Tiêm vacxin DTP cho trẻ em dưới 6 tuổi.

 Tiêm vacxin Td cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên.

 Tiêm vacxin TT cho ph ụ nữ mang thai và lứa tuổi sinh đẻ (15 – 44 tuổi): Tiêm đủ 5 liều trong vòng 31 tháng, tiêm càng s ớm càng tốt khi có thai.

 Tiêm vacxin TT cho nh ững người có nguy cơ mắc cao (người làm vườn, người làm việc ở các trang trại, công nhân xây dựng công tr ình…): Tiêm miễn dịch

3 liều trong vòng 6 tháng, cứ sau 5 – 10 năm tiêm nhắc lại một liều [14].

Nguyên tắc của miễn dịch thụ động l à đưa vào cơ thể bệnh nhân một lượng kháng thể đặc hiệu được sản xuất từ súc vật hay ng ười đã được gây miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu Kháng thể này sẽ trung hoà các độc tố hay virut trong máu của bệnh nhân Một vấn đề q uan trọng trong miễn dịch thụ động l à thời gian miễn dịch rất ngắn, kháng thể đặc hiệu sẽ bị thải ra ngo ài Vì vậy trong việc điều trị dự phòng bệnh uốn ván hay bệnh dại bao giờ ng ười ta cũng có sự phối hợp giữa miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động Ngoài ra khi sử dụng huuyết thanh miễn dịch

để phòng ngừa hay điều trị thường gây ra phản ứng dị ứng, bệnh huyết thanh Để loại bỏ những phản ứng tr ên, người ta phải tinh chế huyết thanh miễn dịch để loại

bỏ các phần tử không cần thiết đối với huyết thanh kh ác loài hay điều chế huyết thanh miễn dịch cùng loài (huyết thanh từ người) hoặc kháng thể đơn dòng [10].

1.3 Huyết thanh.

Sử dụng huyết thanh l à phương pháp tạo miễn dich thụ động rất có hiệu quả Có thể điều chế kháng huyết thanh chống độc tố v à vi khuẩn từ máu ngựa được gây miễn dịch với kháng nguy ên hoặc từ máu người đã tiêm vacxin và có kháng th ể

cao Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ - globulin lấy từ máu nhau thai γ - globulin được tinh chế có ưu điểm đáng kể là giảm hẳn các phản ứng phụ cho người tiêm, đặc biệt có nồng độ kháng thể cao điều trị bệnh rất hữu hiệu [10].

1.3.1 Tính chất lý hoá chung của huyết thanh [8].

Máu là dịch lỏng, nhớt, màu đỏ Máu toàn phần gồm hai phần:

- Tế bào máu: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu.

- Huyết tương: Huyết thanh (serum), các yếu tố đông máu (sợi huyết fibrinogen)…

Khi máu để đông tự nhiên thì các tế bào máu và các yếu tố đông máu bị đông lại, phần còn lại tách ra khỏi cục máu l à chất dịch màu vàng rơm gọi là huyết thanh.

Máu có độ nhớt cao hơn nước: nước = 1; máu = 5; huyết tương = 1,7 – 2,2 Độ nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh lý.

Độ pH: độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu v ào nồng độ H+, OH- và

có ý nghĩa rất quan trọng Khi pH của huyết thanh không phải l à hằng số thì pH của máu cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong c ơ thể không xảy ra Bởi vậy pH của huyết thanh luôn ở khoảng giá trị cố định 7,2 – 7,5.

1.3.2 Thành phần hoá học của huyết thanh.

Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 – 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu vàng nhạt.

Trong huyết thanh nước chiếm 90 – 91%, chất khô chiếm 9 – 10% gồm protein, đường, lipit, muối khoáng.

Các chất vô cơ chính trong huyết thanh gồm cation nh ư Na+, K+, Ca2+,

Mg2+, và các anion Cl–, HCO3-, SO42-, PO43-… Ngoài ra huyết thanh còn chứa các yếu tố như I, Cu, Fe, Zn…, chúng t ồn tại ở dạng ion hoặc kết hợp với protein [10].

Các thành phần hữu cơ trong máu rất phức tạp, gồm:

a Protein:

Là thành phần hữu cơ quan trọng nhất của huyết thanh động vật Có nhiều loại protein huyết thanh, khoảng 100 – 150 loại khác nhau tuỳ theo cấu tạo v à nhiệm vụ của nó: albumin, globulin, fibrinogen, các men… số l ượng và tính chất

của các protein thay đổi tuỳ theo lo ài Nghiên cứu bằng phương pháp lưỡng chiết quang, nhiễu xạ tia X, kính hiển vi điệ n tử thì mọi protein (trừ fibrinogen) đều có dạng hình cầu như albumin, globulin…

Protein huyết thanh gồm 5 thành phần: albumin, 1– globulin, 2– globulin

và γ - globulin.

Nếu điện di miễn dịch tr ên gel tinh bột hoặc gel polyacrilamide có thể tách được 18 – 21 thành phần protein khác nhau Protein huyết thanh có ở dạ ng tự do hoặc phức hợp với lipide (lipoprotein), glucid (glucoprotein), kim loại (metaloprotein), nucleic acid (nucleoprotein).

- Albumin:

Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị kết tủa bởi dung dịch muối b ão hoà Trong các protein c ủa huyết thanh albumin chiếm một lượng lớn tới 56,6% vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì

áp suất thẩm thấu của huyết t ương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể, tham gia vận chuyển các chất không tan trong máu nh ư bilirubin tự do, axit béo, một số thuốc… [2].

- Globulin:

Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần Globulin hoà tan trong dung d ịch muối loãng, không tan trong nước tinh khiết hoặc trong các dung dịch có nồng độ vừa phải, bị đông vón bởi nhiệt Có nhiều loại globulin:

 1,2– globulin chiếm khoảng 13% tổng số protein huyết thanh: 1 tham gia cấu tạo glucoprotein, lipoprotein c òn 2 có ceruloplasmin (protein v ận chuyển đồng).

 - globulin chiếm khoảng 11,7% trong đó có siderophilin (protein ch ứa sắt).

 γ - globulin chiếm khoảng 18,6% protein huyết thanh, bao gồm những kháng thể.

b Các enzyme:

Có rất nhiều enzyme trong huyết thanh như Amylase, Phosphatase, Transaminase… [10].

c Những chất có nitơ phi protein:

Là những sản phẩm thoái hoá của protein, trong đó đa số l à những sản phẩm thoái hoá cuối c ùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, uric acid, bilirubin… Ngoài ra huy ết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian của protein như polypeptide và các amino acid tự do [2], [10].

-Các kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (Ig) Có nhiều lớp globulin miễn dịch khác nhau nhưng tất cả các lớp đều có đặc điểm cấu trúc giống nhau:

 Mỗi phân tử Ig có hai chuỗi polypeptide nặng (H) và hai chuỗi polypeptide nhẹ (L).

 Các chuỗi H và L bao giờ cũng từng đôi và giống nhau hoàn toàn trong mỗi phân tử Ig.

 Tất cả các chuỗi Ig đều có chuỗi L thuộc t ype kappa hoặc lamda còn chuỗi H thì khác nhau.

Các lớp globulin miễn dịch: IgG, IgA, IgD, IgE, IgM.

IgG: Là lớp kháng thể có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, có thể đạt 12

mg/ml (chủ yếu trong máu) Phân tử l ượng nhỏ cỡ 150.000 dalton Chính v ì nhỏ nên nó có mặt trong huyết thanh v à cả dịch kẽ tế bào Khi IgG bị thuỷ phân sẽ tạo thành 3 mảnh có khối lượng tương đối giống nhau khoảng 50.000 dalton Hai mảnh

có cấu trúc giống nhau gọi l à Fab (Angtigen binding fragment) có kh ả năng kết hợp kháng nguyên Một mảnh khác không có khả năng kết hợp kháng nguy ên nhưng có khả năng kết tinh gọi là Fc (Crystallisable fragment) giúp cho phân t ử kháng thể bám trên bề mặt tế bào thực bào.

Hình 1.1: Sơ đồ các mảnh của phân tử IgG khi xử lý bằng enzyme

Pepsin

nhau tương ứng với IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 là 75%, 8 – 10%, 7 – 8%, 4 – 8% IgG1

và IgG3 có khả năng bám tốt trên đại thực bào còn IgG2 và IgG4 không có khả năng này [1].

Có thể chiết IgG từ huyết thanh bằng ph ương pháp sắc ký trên Cellulose Dùng enzyme có thể cắt IgG ra nhiều mảnh khác nhau Với papain hoạt hoá sẽ tách được 3 mảnh gần bằng nhau; với pepsin chỉ tách đ ược một mảnh gần giống 2 Fab hợp lại nhưng không giống hoàn toàn nên có ký hiệu là F(ab)2 có hai vị trí kết hợp kháng nguyên Phần còn lại tương ứng với Fc bị chặt th ành nhiều mảnh peptide nhỏ, mỗi mảnh trên có hoat tính sinh học khác nhau [10].

DEA-1.3.4 Huyết thanh phòng và chữa bệnh:

Huyết thanh chữa bệnh là huyết thanh của động vật đ ã được gây miễn dịch bằng những phương pháp khác nhau hay là huy ết thanh của người mới lành bệnh Các huyết thanh này chứa rất nhiều kháng thể và gây được miễn dịch thụ động cho người dùng sau vài giờ nhưng thời gian được miễn dịch rất ngắn ( khoảng 8 –15 ngày sau khi tiêm) [10].

Huyết thanh động vật: Đ ược chế từ máu động vật (th ường là ngựa hoặc bò, cừu đã được miễn dịch với những bệnh nhiễ m trùng khác nhau) đem lo ại bỏ các protein không đặc hiệu, còn kháng thể giữ ở nồng độ cao Tuỳ theo tác nhân gây miễn dịch, người ta phân biệt:

 Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đ ã được tiêm độc tố vi khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD ), chống uốn ván (SAT).

 Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đ ã được miễn dịch đối với virus dại dùng để chống bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virut Vi êm gan B…

 Huyết thanh kháng nọc độc: huyết thanh của động vật đ ã được tiêm nọc độc đã làm giảm độc của những loài có nọc độc, chẳng hạn như nọc rắn (SAV).

 Huyết thanh của người mới lành bệnh: hiện nay ít dùng.

Ở Việt Nam huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế đ ược sản xuất duy nhất tại viện Vacxin Nha Trang theo ph ương pháp của Pope và quy trình của Lavergne - Pháp (Paris): quy trình IVAC2– 1995 [10].

Đây là một sinh phẩm có nguồn gốc động vật (từ ngựa) chứa các globulin miễn dịch đặc hiệu thu đ ược bằng phương pháp tinh chế huyết thanh kháng uốn ván

thô khi xử lý với enzym và kết tủa phân đoạn trong muối amonium sulphate Chế phẩm được bảo quản bằng merthiolate 1/10.000 Mỗi năm viện sản xuất h àng trăm ngàn ống (loại 1500 IU) để phục vụ công tác ph òng ngừa uốn ván ở Việt Nam [8].

Tác dụng phụ của protein có trong huyết thanh [10]:

Hàm lượng protein cao trong huyết thanh do quá trình tinh chế chưa loại hết albumin sẽ gây phản ứng.

 Phản ứng tức khắc: xảy ra sau khi ti êm vài phút hay vài giờ Thường tai biến xảy ra sau khi tiêm lần thứ hai, đặc biệt l à nếu tiêm hai huyết thanh của cùng một loại động vật trong vòng 10 ngày Chỗ tiêm bị phù nề, ban đỏ (thường biến mất sau 24 – 36 giờ) Triệu chứng toàn thân: Trạng thái lo âu, tức ngực khó thở, ho; run, sốt cao, nôn, tiêu chảy; tim đập nhanh, huyết áp giảm; có thể bị ngoại ban to àn thân Tuy nhiên tình trạng nguy kịch chỉ xảy ra trong v ài phút, trường hợp tử vong rất ít.

 Phản ứng chậm: xảy ra vào khoảng 9 – 15 ngày sau khi tiêm:

 Sốt nhẹ, nhức đầu, suy nh ược, biếng ăn, buồn nôn, tiêu chảy; nổi mề đay, ban đỏ, phù Quinck…

 Ngoài ra có thể gây đau khớp, lách to; các biểu hiện viêm đường hô hấp cấp; tiểu ít, albumin niệu, trụ niệu; Cá biệt gây vi êm dây thần kinh tiến triển làm teo cơ.

Các phản ứng nói chung có thể khỏi sau v ài ngày, tuy nhiên cũng có trường hợp kéo dài, cá biệt có thể gây viêm nút quanh động mạch.

1.4 Tá chất gây miễn dịch.

1.4.1 Khái niệm tá chất [7]:

Năm 1922, Ramon phát hiện và đưa ra khái niệm về tá chất (Adjuvant) trong lĩnh vực vacxin và các chế phẩm sinh học, đó l à những chất khi chộn lẫn với kháng nguyên có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch trên người hoặc động vật.

Người ta ứng dụng tá chất trong lĩnh vực sản xuất vacxin để tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh và kéo dài Tá chất được sử dụng cả ở người và động vật nhưng khác nhau về chủng loại và bản chất Trong quy trình sản xuất kháng huyết thanh SAT từ máu ngựa, tá chất có vai tr ò đặc biệt quan trọng vì vậy việc sử dụng nó nh ư một điều kiện bắt buộc.

1.4.2 Cơ chế hoạt động [5].

Một tá chất trong vacxin có thể ảnh h ưởng đến đáp ứng miễn dịch theo một chiều hoặc nhiều cơ chế sau:

 Đưa kháng nguyên vào vị trí thích hợp trong cơ thể.

 Lưu giữ và giải phóng kháng nguyên chậm từ vị trí mà nó lắng đọng.

 Tuyển mộ và hoạt hoá các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) và lympho bào.

 Hoạt hoá bổ thể, tăng cường tổng hợp tiết và gắn kết của các cytokin.

 Mang các epitope của tế bào T đến MHC lớp I và lớp II.

1.4.3 Vai trò [5], [7].

Nhờ các cơ chế hoạt động trên mà tá chất có những vai trò sau:

 Tăng cường hiệu lực của các peptide tổng hợp hoặc tái tổ hợp nhỏ, có tính kháng nguyên yếu.

 Tăng cường tốc độ, sức mạnh và sự tồn lưu đáp ứng miễn dịch cho những kháng nguyên lớn hơn.

 Điều hoà miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế b ào.

 Điều hoà sản xuất kháng thể, số l ượng kháng thể, tính đặc hiệu của kháng thể, loại kháng thể ứng với các epitop e trên các phức hợp sinh miễn dịch.

 Làm giảm lượng kháng nguyên trong vacxin, nhờ vậy có thể giảm sự cạnh tranh kháng nguy ên và sự chèn ép epitope đặc hiệu, giảm lượng kháng nguyên trong một liều vacxin nhờ đó tăng số l ượng vacxin và giảm giá thành sản xuất.

1.4.4 Tính an toàn của tá chất [7].

Ưu điểm lớn nhất của tá chất trong vacxin hấp phụ l à khả năng tăng cường miễn dịch Tuy nhiên, sử dụng tá chất vẫn tiềm ẩn những quy c ơ đối với sức khoẻ con người Các nguy cơ theo thực tế và lý thuyết của tá chất là:

 Gây nhiễm trùng cấp tính hoặc mãn tính, hình thành các ổ mủ gây đau, các u nhọt lâu khỏi.

 Gây ra các triệu chứng như cúm, sốt, nhức đầu, nhức mỏi c ơ, khớp.

 Gây dị ứng, độc lâm sàng cho các mô và cơ quan.

 Phản ứng chéo với các kháng nguy ên của bể cầu thận hay bao th ần kinh, gây ra viêm thận hay viêm màng não.

 Nhạy cảm với tuberculin hoặc các kháng nguy ên thử nghiệm trong da khác.

 Gây ung thư, đẻ non và quái thai.

 Gieo rắc và phát tán các vector vào v ật chủ và môi trường.

1.4.5 Các loại tá chất thông dụng [7].

Tá chất được xếp nhóm theo nguồn gốc h ơn là theo cơ chế hoạt động bởi vì

cơ chế hoạt động của hầu hết các tá chất ch ưa được hiểu đầy đủ.

a.Hợp chất nhôm (Al3+).

Hợp chất nhôm (bao gồm hydroxyde nhôm Al(OH)3, phosphate nhôm AlPO4 hoặc kết hợp cả hai) được sử dụng trong sản xuất nhiều loại vacxin nh ư vacxin uốn ván hấp phụ, vacxin bạch hầu - ho gà - uốn ván, vacxin viêm gan A, B

và vacxin dại…

Tá chất nhôm đã trở thành căn cứ để đánh giá các tá chất mới trong vacxin dùng cho người Tá chất nhôm khó đ ược tạo ra theo cách tổng hợp hoá lý, điều n ày ảnh hưởng đến đặc tính lý hoá của kháng nguy ên, loại tá chất nhôm, điều kiện hấp phụ và nồng độ tá chất Không phải tất cả các hợp chất nhôm đều có hiệu quả như nhau, chẳng hạn hydroxyde nhôm có hiệu quả hơn phosphate nhôm Do đó, một dạng pha chế đặc biệt của hydroxyde nhôm (Alhydrogen ) đã được khuyến cáo dùng như một tá chất chuẩn.

 Ưu điểm của tá chất nhôm:

 Ưu điểm chính của việc sử dụng tá chất nhôm l à tính an toàn đã được ghi nhận qua hàng tỷ liều vacxin và sự hình thành kháng thể sớm hơn, cao hơn và kéo dài hơn sau khi mi ễn dịch sơ cấp so với các dạng vacxin không sử dụng tá chất tương ứng đặc biệt đối với các giải độc tố.

 Hình thành kho lưu giữ tại vị trí tiêm nên cho phép giải phóng kháng nguyên chậm, kích thích các tế bào miễn dịch qua con đường hoạt hóa bổ thể, hoạt hóa đại thực bào.

 Kháng nguyên hấp phụ được nhận diện nhờ bản chất v à kích thước hạt tối ưu (<10µg).

 Nhôm kích thích miễn dịch qua trung gian tế b ào.

 Là các thành phần trong vacxin đã được cho phép sử dụng.

 Nhược điểm của tá chất nhôm:

 Gây phản ứng tại chỗ như sưng phồng và ban đỏ tại vết tiêm.

 Thời gian tồn tại ở chỗ ti êm có thể lên tới một năm ở chuột.

 Có một số hạn chế về miễn dịch bao gồm: không có khả năng tăng cường miễn dịch dịch thể cho một số vacxi n dùng cho người và hầu như không có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế b ào đặc biệt đáp ứng qua tế b ào T độc đối với các sinh vật nội b ào Không tạo ra miễn dịch qua trung gian tế b ào là một hạn chế của vacxin chống lại các sinh vật ký sinh nội bào như sốt rét và HIV Thậm chí tá chất nhôm k ìm hãm một cách có chọn lọc sự phát triển của các tế b ào hoạt động CD8+ bởi một số kháng nguyên.

 Các dung dịch tá chất nhôm không phải lúc n ào cũng tạo được gel, không thể tiệt trùng bằng phương pháp lọc, không được để đông đá, không đông khô được.

b.Chitosan.

Chitosan là một amino polycsharide, có cấu trúc tứ các đ ơn vị glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucoside Chitosan là ch ất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột màu trắng ngà, không mùi, không vị Tính chất của chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh khiết, độ deacetyl hóa, phân tử l ượng và độ rắn Phân tử lượng của chitosan quyết định khả năng kết dính, tạo m àng, tạo gel Chitosan và các dẫn xuất được sử dụng làm tá chất phải có độ deacetyl í t nhất là 75% Chitosan hay các dẫn xuất có thể sử dụng l àm tá chất dưới các dạng vật lý khác nhau: dung dịch, bột hay các dạng đặc biệt Các dạng đặc biệt hay d ùng là dạng hạt nhỏ, có liên kết chéo hay không liên kết chéo và có thể tạo thành dạng xịt rất thuận tiện cho việc sử dụng Chính v ì vậy chitosan đã được dùng như một tá chất đặc biệt cho vacxin miễn dịch qua đ ường niêm mạc (niêm mạc mũi) Ngoài ra, vacxin hấp phụ chitosan có thể đ ược đưa vào cơ thể qua đường tiêm phúc mạc, tiêm tĩnh mạch, tiêm dưới da, tiêm bắp.

β-D-c.Tá chất Freund.

Tá chất Freund là hỗn dịch nước trong dầu, bao gồm hai loại là tá chất hoàn

toàn (FCA) và không hoàn toàn (FIA) FCA có thêm vi khu ẩn Mycobacteria tuberculosis hàm lượng khoảng 0,5 mg/ml Đây l à tá chất chuẩn, hiệu quả tác dụng

mạnh, đã từng được sử dụng rộng rãi trong các vacxin thử nghiệm trên súc vật Dầu khoáng kết hợp với xác vi khuẩn lao c ùng với chất tạo nhũ (mannide mono oleate) tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể v à trung gian tế bào Tuy nhiên FCA cũng có thể tạo các khối u biểu mô, các vết loét khi ti êm dưới da, gây sốt và bệnh tự miễn như thấp khớp Do đó, loại tá chất n ày thường chỉ được dùng trên súc vật thí nghiệm.

Để giảm các phản ứng có hại của tá chất Freund, một số nghi ên cứu cải tiến

về loại dầu khoáng trong tá chất Freund được phát triển như Montanide 80, Montanide ISA 51, ISA 720 và ISA 724…

1.5 Tá chất Montanide ISA 50 V2.

1.5.1 Định nghĩa [17]:

Montanide ISA là loại tá chất dạng nước trong dầu (W/O – 50 thể tích nước/50 thể tích dầu) Thành phần của nó bao gồm dầu khoáng, mannitol v à oleic acid tinh chế có nguồn gốc từ thực vật.

Dạng nhũ dịch W/O của Montanide ISA 50V2 đ ược thể hiện qua hình vẽ sau:

Hình 1.2: Thành phần và dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50V2

1.5.2 Những tính chất của MONTANIDE ISA 50V2 [17].

Bảng 12:Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2

Độ nhớt (Brookfield LVF, S2,) Xấp xỉ 18 mPa,s (tại 250C)

Trọng lượng riêng (tại 250C) Xấp xỉ 0,86

Chỉ số khúc xạ (tại 250C) Xấp xỉ 1,459

Bảng 1.3:Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2

Chỉ số acid (mg KOH/g) Cao nhất 0,5 NFT 60 204

Chỉ số xà phòng hoá (mg KOH/g) 16 – 19 S 52 008

1.5.3 Tính chất tạo nhũ dịch [17].

Bảng 1.4: Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50V2

Độ nhớt (Brookfield LVF, S2) Xấp xỉ 200 mPa,s tại 250C

Độ ổn định

Sau khi ủ ở 40C Hơn 12 tháng

Sau khi ủ ở 250C Khoảng 6 tháng

Sau khi ủ ở 370C Khoảng 15 ngày

1.5.4 Các thử nghiệm về độc tính [17].

Tá chất MONTANIDE ISA đạt ti êu chuẩn an toàn của Hội đồng chung Châu

Âu trên súc vật thí nghiệm, 2377/90/EC Phụ bản II.

Bảng 1.5: Các thử nghiệm độc tính của Montanide ISA

Liều LD50 theo đường uống (trên

Trạng thái kích động Bị kích động rất nhẹ.

An toàn không đặc hiệu (chuột

nhắt và chuột lang).

Không chết sau 7 ngày.

Không mổ phân tích các trường hợp bất thường.

Chất gây sốt (thỏ) Không có chất gây sốt.

1.5.5 Số liệu về công hiệu [17].

Montanide ISA 50V2 đã được sử dụng thành công trong một số công thức như

là vacxin FMD (Foot anh mouth desease), vacxin Pasteurella multocida, vacxin ký sinh trùng Tick, vacxin cowdriosis,

 Đáp ứng trên chuột:

Các nhóm chuột gồm 10 con cho một nhóm được tiêm miễn dịch với BSA (ovalbumin formulated) (10µg) hỗn hợp với Montanide ISA 50V, Al(OH)3, hay không có tá chất Montanide ISA 50V 2 làm tăng đáp ứng kháng thể IgG1 cao và thời gian đáp ứng miễn dịch kéo d ài đồng thời cũng làm tăng đáp ứng sản sinh tế bào lympho Vì vậy loại tá chất này có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào.

 Đáp ứng trên cừu:

Montanide ISA 50V làm khơi d ậy hàm lượng cao kháng thể trung ho à kháng virus bluetongue Vào ngày 117, t ại thời điểm bảo vệ, hiệu giá kháng t hể trung hoà vẫn còn cao hơn nhiều khi so sánh với FIA.

 Đáp ứng trên bò:

Nghiên cứu so sánh trên gia súc về công hiệu của vacxin FMD hỗn hợp với

tá chất dầu hay nhôm hydroxyde, kết quả cho thấy r õ ràng rằng Montanide ISA 50V làm tăng tính miễn dịch mạnh và dài hơn nhôm hydroxyde.

1.5.6 Cơ chế và tính ưu việt của Montanide ISA 50V2 [16], [18], [25].

Hoạt tính của tá chất Montanide ISA 50V2 chưa thực sự được hiểu rõ ràng,

nó có những điểm khác biệt trong các tr ường hợp khác nhau.

Đầu tiên, tá chất là kho chứa và giải phóng chậm kháng nguy ên từ vị trí tiêm Tùy theo kiểu nhũ dịch của tá chất (l à W/O, W/O/W, O/W) mà đ ộng học của quá trình giải phóng kháng nguyên khác nhau Người ta đã thực hiện thí nghiệm sử dụng phương pháp thẩm tích nghịch đảo để đánh giá invitro động học quá trình giải phóng kháng nguyên t ừ nhũ dịch, kết quả cho thấy r õ ràng động học của quá trình

sẽ khác nhau tùy thuộc vào kiểu nhũ dịch.

Cụ thể là: Những protein không có tá chất sẽ bị giải phóng ngay tức thời Nhũ dịch O/W cho phép quá tr ình này chậm hơn chút ít nhưng protein v ẫn bị giải phóng nhanh Nhũ dịch W/O là có hiệu quả nhất, nó làm cho quá trình giải phóng kháng nguyên xảy ra rất chậm chạp; điều n ày liên quan đến độ ổn định của nhũ dịch, ngay khi trạng thái nhũ t ương bị phá vỡ kháng nguyên sẽ được giải phóng ồ

ạt Tuy nhiên, quá trình giải phóng của dạng nhũ dịch n ày vẫn chậm hơn dạng O/W Còn loại nhũ dịch W/O/W th ì có độ hoạt động nằm giữa hai loại nhũ dịch tr ên, nghĩa là nó sẽ giải phóng kháng nguy ên chậm hơn dạng O/W và nhanh hơn dạng W/O [16].

Hình 1.3: Quá trình giải phóng kháng nguyên của một số tá chất khác

nhau theo thời gian [25]

Hình 1.4: Quá trình giải phóng kháng nguyên của dạng tá chất W/O theo thời

gian (hình phóng đại) [25]

Ngoài ra, Montanide ISA sau khi được tiêm vào cơ thể sẽ khuếch tán đến hạch lympho dưới dạng các giọt dầu nhỏ, trong các giọt dầu n ày có chứa kháng nguyên Bằng cách này kháng nguyên sẽ được vận chuyển đi trong hệ tuần ho àn.

Do được bao bọc bởi các giọt dầu n ên kháng nguyên có thể tránh khỏi sự phân hủy nhanh chóng của các enzyme trong c ơ thể, kháng nguyên sẽ giữ được lâu hơn với số lượng lớn so với trường hợp không có tá ch ất Bên cạnh đó, tá chất có thể l àm tăng tính lạ cho kháng nguyên bằng cách thay đổi điện tích của c ác kháng nguyên này [17] Các tá chất còn kích thích quá trình viêm và tuy ển mộ các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) là đ ại thực bào, kể cả lympho bào Ngoài ra tá chất còn có tác dụng làm cho sự hấp phụ kháng nguy ên của các tế bào APC diễn ra được thuận lợi hơn Điều này có được là do tương tác giữa chất hoạt động bề mặt trong tá chất với màng của các tế bào APC [25].

Cơ chế bẫy các tế bào lympho lại là một cơ chế hoạt động khác của các tá chất dầu Chúng kích thích sự tích lũy các tế b ào lympho tại hạch bạch huyết Ngoài

ra tá chất còn ảnh hưởng đến sự hoạt hóa các cytokin, các cytokin đặc biệt sẽ đ ược hoạt hóa tùy theo kiểu nhũ dịch của tá chất đ ược sử dụng [25].

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động của Montanide ISA 50V2 [25]

Như vậy hoạt động của tá chất Montanide ISA 50V2 có những ưu việt sau:

 Tạo ra kho dự trữ kháng nguy ên.

 Giải phóng kháng nguyên chậm và kéo dài.

 Bảo vệ được kháng nguyên khỏi sự phân hủy của enzyme v à quá trình đào thải của cơ thể.

 Làm biến đổi điện thế bề mặt kháng nguy ên, thu hút các tế bào trình diện kháng nguyên.

 Tạo thuận lợi cho quá tr ình tóm bắt kháng nguyên và trình diện kháng nguyên với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.

 Kích thích sinh kháng th ể và hoạt hóa các cytokin.

1.6 Sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật [8], [10].

SAT (Serum Anti Tetanus) là m ột chế phẩm lấy từ huyết thanh ngựa Ng ười

ta tiêm cho ngựa kháng nguyên uốn ván, một thời gian sau trong huyết thanh ngựa xuất hiện kháng thể chống uốn ván, ng ười ta khai thác huyết thanh n ày và tiến hành tinh chế, chế tạo thành SAT Vì là sản phẩm lấy từ động vật khác lo ài nên SAT có thể gây sốc phản vệ với tỷ lệ nguy c ơ là dưới 1/1000 và có thể xảy ra tử vong nếu

không được xử trí kịp thời V ì thế phải tiêm SAT ở cơ quan y tế có đủ phương tiện hồi sức Thời gian bảo vệ của SAT l à 7 – 10 ngày Cần lưu ý là không nên tiêm SAT cho phụ nữ có thai [8] SAT phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 -8oC, tuyệt đối không được để đông lạnh Mọi nhiệt độ ngo ài khoảng nhiệt độ an toàn trên đều làm giảm chất lượng và hiệu lực của thuốc [24].

Việc sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật đ ã được nghiên cứu từ năm 1889 khi Von Berhing v à Kitazato phát hiện ra độc tố uốn ván hoà tan trong môi trư ờng nuôi cấy vi khuẩn Độc tố n ày gây ra bệnh uốn ván Đến năm 1890 họ đã thành công trong việc gây miễn dịch cho súc vật bằng độc tố này để lấy huyết thanh ở dạng thô điều trị bệnh uốn ván Năm 1922 Ramon đ ã đưa

ra phương pháp giải độc tố uốn ván và xác định hiệu giá huyết thanh uốn ván bằng phương pháp lên bông đã làm cho công tác sản xuất huyết thanh điều trị nói chung

và huyết thanh kháng độc tố uốn ván nói ri êng tiến lên một bước mới Năm 1939, Pope đề xuất phương pháp tinh chế huyết thanh kháng độc tố uốn ván Từ đó đến nay việc sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật đ ã phát triển với nhiều công tr ình nghiên cứu về miễn dịch, kháng nguy ên, tá chất và tinh chế đã làm cho việc sản xuất huyết thanh đạt tr ình độ cao, có hiệu quả tốt, ít gây phản ứng cho bệnh nhân.

1.6.1 Sản xuất kháng nguyên để gây miễn dịch [10], [21].

Kháng nguyên dùng đ ể gây miễn dịch cho súc vật có thể d ùng độc tố uốn

ván hay giải độc tố uốn ván Việc sản xuất độc tố uốn ván từ các chủng Clostridium tetani khác nhau tuỳ theo mỗi nước, thường người ta dùng chủng Havard Việc nuôi

cấy có thể thực hiện theo ph ương pháp nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy trên nồi lên men Các điều kiện nuôi cấy như loại môi trường, pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy ảnh h ưởng rất lớn đến MLD/ml v à Lf/ml của độc tố Việc giải độc độc tố th ành giải độc tố được thực hiện bằng cách d ùng formalin Các độc tố, giải độc tố uốn ván d ùng để gây miễn dịch ngựa có thể được tinh chế bằng ammonium sulphate.

Năm 1890, Behring và Kitazato ch ứng minh được độc tố uốn ván có tính kháng nguyên tốt và sử dụng để điều chế huyết thanh kháng độc tố uốn ván.

Từ năm 1944 việc sản xuất độc tố uốn ván chủ yếu sử dụng ph ương pháp lên men chìm (static cultrure) Ng ười ta nuôi cấy vi khuẩn uốn ván trong các b ình thủy tinh miệng rộng với môi tr ường kỵ khí thích hợp Các chai nuôi cấy được đặt trong tủ ấm hoặc phòng ấm 36 – 370C Sau thời một gian nhất định đến lúc tế b ào

ly giải, độc tố giải phóng vào nước nổi môi trường nuôi cấy, thu nhận độc tố bằng các phương pháp lọc Sau này người ta thu nhận độc tố bằng cách c ưỡng bức ly giải canh khuẩn non (thu được vào sau 1 – 3 ngày nuôi cấy).

Đến năm 1970, cùng với sự phát triển của công nghệ sin h học, người ta đã nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi phương pháp sản xuất giải độc tố uốn ván tr ên các nồi lên men với các điều kiện kiểm soát đ ược như dùng thiết bị rung tạo cho vi khuẩn phân tán đều trong môi tr ường lỏng, dùng khí nén thổi qua bề mặt canh cấy

để loại khí H2S sinh ra trong quá trình nuôi c ấy (phương pháp nuôi cấy đồng nhất – Homogeneous culture).

Môi trường nuôi cấy sản sinh độc tố thích hợp nhất đ ược sử dụng cho cả hai phương pháp trên là Mueller và Miller, môi trư ờng này đạt hiệu giá 50 – 90 Lf/ml.

Năm 1946, Pillemer là ngư ời đầu tiên và duy nhất kết tinh được độc tố uốn ván với mục đích đạt được độc tố có chất lượng tinh khiết.

Năm 1924, Descombey phát hi ện ra khả năng khử độc tố uốn ván của formaline, đặt nền móng cho việc sản xuất giải đ ộc tố làm vacxin phòng uốn ván Cho đến nay formaline vẫn l à một chất bất hoạt ổn định nhất với độc tố uốn ván.

Năm 1977, Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo tinh chế giải độc tố uốn ván thô qua các giai đoạn chính: Cô đặc, tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4, lọc vô trùng bằng thiết bị lọc thích hợp Y êu cầu độ sạch kháng nguy ên  1000 Lf/mg protein Nitơ.

Sau khi điều chế được kháng nguyên tinh sạch, người ta sử dụng để sản xuất vacxin phòng uốn ván cho người (có thể đơn giá, có thể kết hợp với các kháng nguyên khác tạo vacxin đa giá) và gây miễn dịch trên súc vật sản xuất huyết thanh kháng uốn ván (SAT) phục vụ ph òng và điều trị bệnh uốn ván.

1.6.2 Miễn dịch súc vật sản xuất h uyết thanh kháng độc tố uốn ván [6], [10], [15].

1.6.2.1 Cơ chế miễn dịch của cơ thể súc vật.

a Tiếp cận kháng nguyên.

Kháng nguyên là chất mà hệ thống miễn dịch nhận đ ược và đáp ứng bằng sản xuất ra một kháng thể đặc hiệu t ương ứng.

Khi kháng nguyên vào cơ th ể, chúng sẽ được đưa đến mọi nơi trong cơ thể nhờ hệ máu và bạch huyết Nơi kháng nguyên đến khu trú là hạch lympho, lách và gan Nếu ta tiêm kháng nguyên vào tĩnh mạch thì lách sẽ là nơi tạo nhiều kháng thể nhất, ngược lại nếu ta tiêm dưới da, trong da hay màng bụng thì kháng thể sẽ được tạo nhiều trong hạch lympho.

Sau khi có sự xâm nhập lần đầu tiên của kháng nguyên là thời kỳ tiềm ẩn, lúc này không thấy bất kỳ kháng thể n ào xuất hiện trong máu Sau đó nồng độ kháng thể tăng dần rồi lại giảm xuống, phản ứng với mũi ti êm lần một gọi là đáp ứng kháng thể nguyên phát Khi tiêm kháng nguyê n lần hai (tiếp cận kháng nguy ên lần hai) sau vài ngày hay vài tuần, nồng độ kháng thể sẽ tăng l ên nhanh chóng, gấp

10 – 100 lần nồng độ tiêm lần thứ nhất Nồng độ kháng thể sẽ giảm dần theo thời gian, nhưng ở các lần tiêm sau nữa nó sẽ lặp lại.

APC là đại thực bào cũng hoạt động như vậy nhưng chúng không có th ụ thể đặc hiệu kháng nguyên Chúng có thể bắt và nuốt kháng nguyên lạ một cách hữu hiệu, sau đó chế biến và trình diện ra bề mặt nhờ phức hệ KN – MHC lớp II, giống như trường hợp APC là các tế bào B.

Bước tiếp theo là APC trình diện phức hệ KN – MHC cho tế bào T thông qua thụ thể của nó là TCR Phân tử MHC lớp II trên bệ mặt của APC sẽ tương tác với phân tử CD4 trên bề mặt tế bào TH Do được tiếp xúc thông qua kháng nguy ên làm trung gian, tế bào TH kích thích tế bào B sản sinh ra interleukin, chất n ày lại kích thích tế bào B phân chia, kết quả là dòng tế bào B được tạo thành, dòng này chỉ sinh ra một loại kháng thể đặc hiệu Sau đó lại xảy ra sự biệt hóa tiếp theo của d òng

tế bào B đã hoạt hóa dẫn đến tạo thành một lượng lớn các tế bào sản xuất kháng thể gọi là tế bào plasma có đời sống ngắn nhưng lại tiết ra một lượng lớn kháng thể và dòng tế bào nhớ có đời sống dài và khi có dịp gặp lại kháng nguy ên đã kích thích

lần đầu, chúng sẽ nhanh chóng biến th ành tế bào plasma để sản xuất kháng thể Trí nhớ miễn dịch cũng là đáp ứng thứ phát dẫn tới việc sản xuất kháng thể một cách nhanh chóng, kịp thời và với số lượng lớn khi có sự kích thích lặp lại của kháng nguyên.

Một số kháng nguyên có thể kích thích tế bào B tạo kháng thể ở mức độ thấp mà không cần có mối tương tác với tế bào T gọi là kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức Đa số các kháng nguy ên này là các polymer ch ứa các quyết định kháng nguyên lặp lại Kháng thể chống kháng nguy ên không phụ thuộc tuyến ức có trí nhớ miễn dịch nên đáp ứng lần hai có quy mô v à tốc độ như lần một.

1.6.2.2 Súc vật để gây miễn dịch [10].

Việc sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc súc vật tuỳ thuộc rất nhiều vào súc vật dùng để gây miễn dịch Trên nguyên tắc người ta có thể dùng bất cứ loại súc vật nào cũng được, nhưng trong thực tế sản xuất người ta phải lựa chọn súc vật để gây miễn dịch v à súc vật phải được chăm sóc, phòng ngừa và điều trị thật chu đáo và cẩn thận.

Tổ chức y tế thế giới đ ã khuyến cáo nên sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván trên nhiều loại súc vật khác nhau để tránh phản ứng, bệnh huy ết thanh do

sử dụng huyết thanh của một lo ài súc vật nhiều lần Tuy nhi ên hiện nay người ta cũng chỉ sản xuất huyết thanh kháng độc tố uốn ván từ ngựa m à thôi.

Hầu hết các nước trên thế giới lựa chọn ngựa để gây miễn dịch sản xuất huyết thanh điều trị nói chung và huyết thanh kháng độc tố uốn ván nói ri êng vì lý do: Có trọng lượng lớn; Dễ chăm sóc; Dễ ti êm kháng nguyên và l ấy máu; Huyết thanh ngựa ít gây phản ứng cho bệnh nhân so với hu yết thanh của các loài vật khác; Đáp ứng miễn dịch cao; Hồng cầu ngựa khó bị phá huỷ cho nên có ít hemoglobulin trong huyết thanh; Cục máu tạo ra rắn chắc, hay hồng cầu lắng nhanh v à chặt vì vậy việc lấy huyết thanh và huyết tương dễ dàng, cho tỷ lệ cao.

1.6.2.3 Tiêu chuẩn ngựa sản xuất huyết thanh.

Theo khuyến cáo của Tổ chức y tế Thế giới và Dược điển của nhiều nước như Anh, Pháp, Mỹ, Ấn Độ ngựa dùng để sản xuất huyết thanh có các ti êu chuẩn sau:

 Khoẻ mạnh, không bị bệnh truyền nhiễm tr ước, trong thời gian sản xuất.

 Không được điều trị bằng penecilin v à strytomycin.

 Trong thời gian sản xuất, ngựa ốm hay nghi ngờ ốm m à chưa rõ nguyên nhân điều trị phải cho nghỉ, không sản xuất huyết t ương.

1.6.2.4 Chăm sóc ngựa [8].

a Trước khi đưa ngựa vào sản xuất:

Ngựa để sản xuất huyết thanh có thể mua b ên ngoài hay tự sản xuất, nhưng trước khi mua về cần:

 Cách ly ở khu vực riêng.

 Kiểm tra toàn diện sức khoẻ ngựa: kiểm tra ngựa có bị bệnh truyền nhiễm như Morve, nếu có phản ứng huyết thanh d ương tính phải loại bỏ ngay Kiểm tra nội và ngoại ký sinh trùng, theo dõi sự phát triển và trọng lượng ngựa hàng tháng, chăm sóc, điều trị ngựa bị nhiễm ký sinh tr ùng.

 Tiêm phòng uốn ván, bạch hầu.

 Thời gian cách ly và theo dõi từ 3 – 6 tháng trước khi đưa ngựa vào khu sản xuất.

b Trong quá trình sản xuất:

Sau thời gian cách ly và theo dõi, các ngựa khoẻ mạnh được đưa vào miễn dịch để sản xuất huyết thanh Trong quá tr ình sản xuất ngựa phải luôn luôn khoẻ mạnh, để đảm bảo yêu cầu này ngựa cần:

 Theo dõi thường xuyên sức khoẻ ngựa về các ph ương diện: trọng lượng hàng tháng, thân nhiệt ngựa, tình hình ăn uống, lông, da, độ nhanh nhạy của ngựa hàng ngày.

 Phòng ngừa: đưa các ngựa đang sản xuất bị ốm ra khu điều trị ri êng biệt, chủng ngừa định kỳ các bệnh truyền nhiễm của ngựa, cân đối thức ăn của ngựa, chăm sóc tắm rửa, chải lông, vạt móng, cắt b ờm hàng ngày hay định kỳ.

1.6.2.5 Miễn dịch:

a Kháng nguyên [8]:

Kháng nguyên để gây miễn dịch ngựa có thể l à giải độc tố, độc tố uốn ván thô hay độc tố, giải độc tố uốn ván tinh chế.