BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - BỘ Y TẾ Viện Được liệu
3B Quang Trung - Hà nội
BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT
ĐỀ TÀI NHÁNH CỦA ĐỀ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU THUỐC DIHACHARIN ĐIỀU TRỊ
BỆNH VIÊM GAN TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐÁNG
(Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)
Chủ nhiệm dé tai: PGS TSKH D6 Trung Dam
Hà nội, 08 — 2004
Bản thảo viết xong tháng 9/2004
Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài nhánh của đẻ tài độc
lập cấp nhà nước, mã số ĐLNN - 02
Trang 2DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN
Danh sách những người thực hiện chính:
PGS.TSKH Đỗ Trung Đàm TS Phạm Văn Thanh
ThS Lê Việt Dũng DS Trinh Thi Diép DS Nguyén Ngoc Chi TS Nguyén Minh Khai DS Nguyén Kim Phuong BS Lé Minh Phuong DS Nguyén Thi Dung
TS Quách Mai Loan TS Phạm Thanh Trúc TS Lê Kim Loan
DS Nguyễn Minh Châu PGS.TS Bùi Thị Bằng TS Nguyễn Tập
CN Ngô Văn Trại
GS.TS Nguyễn Văn Mùi PGS.TS Nguyễn Hoàng Tuấn
TS Trinh Xuan Hoa TS Đỗ Bình
Viện Dược liệu Viên Dược liệu Viện Dược liệu Viện Dược liệu
Viện Dược liệu
Trang 3BÀI TÓM TAT CAC KET QUA CUA DE TÀI Mục tiêu của đề tài
Mục tiêu của để tài là nghiên cứu tác dụng, độ an toàn và kỹ thuật sản xuất của thuốc Dihacharin để chữa bệnh viêm gan từ cây Diệp hạ châu đắng Phyllanthus amarus Schum et Thonn., một nguồn nguyên liệu trong nước
Đóng góp mới của để tài
Đã phân biệt rõ hai cây Diệp hạ châu đắng và cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) dựa trên mô tả thực vật, vi phẫu, soi bột và thành phần hoá học để tránh
nhầm lẫn khi sử dụng
Đã nghiên cứu chiết xuất ra bột Dihacharin gồm phân đoạn taninoid và flavonoid từ cây Diệp hạ châu đắng có loại tạp để tạo ra được một bán thành phẩm ổn định có
tác dụng được lý và tác dụng điều trị
Đã chứng minh tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan của Dihacharin trên các nghiệm pháp dược lý:
o_ Gây tổn thương gan thực nghiệm bằng hoá chất, kết hợp dùng Dihacharin để đánh giá tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan
o_ Gây xơ gan thực nghiệm bằng hoá chất, kết hợp dùng Dihacharin để đánh
giá tác dụng ức chế xơ gan, tác dụng trên giải phẫu bệnh lý gan và tác dụng chống oxy hoá ở gan
o Tac dung trên khả năng tiết mật, vì khi gan bị bệnh sẽ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tiết mật
©_ Tác dụng chống viêm cấp tính cũng là một khía cạnh của viêm gan
o Tác dụng lợi tiểu cũng góp phần vào tác dụng giải độc gan khi gan bị tổn thương
Đã bào chế viên nang, xây dựng tiêu chuẩn và nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin
Đã chứng minh chế phẩm viên nang Dihacharin có hiệu quả điều trị bệnh nhân
Trang 4triệu chứng lâm sàng nhanh hơn, tỷ lệ hồi phục các xét nghiệm hoá sinh về gan tốt hơn, nồng độ HBsAg và tỷ lệ HBeAg(+) giảm nhanh hơn so với lô chứng
Kết quả cụ thể 1
2
Kết quả nghiên cứu về thực vật
Về mô tả thực vật: Thân cây Diệp hạ châu đắng màu xanh, cồn thân cây Chó đẻ
răng cưa màu nâu đỏ
Về vi phẫu: Thân của Diệp hạ châu đắng tròn đều, còn thân của cây Chó đẻ răng cưa có các mô lồi; Diệp hạ châu đắng có các hàng mạch gỗ to xếp cách nhau, còn Chó đẻ răng cưa có các mạch gỗ xếp thành hàng đều đặn
Kết quả nghiên cứu hoá hoc
Những kết quả nghiên cứu về hoá học cho thấy:
Cả hai cây Diệp hạ châu đắng và Chó đẻ răng cưa déu có taninoid, flavonoid,
đường khử, acid hữu cơ, caroten, cả hai cây đều không có coumar, anthraglycosid, glycosid tim, steroid và chất béo Chỉ có Diệp hạ châu đắng mới có alcaloid Hàm lượng flavonoid toàn phần của Diệp hạ châu đắng là 1,00 + 0,12%, xấp xỈ với Chó đẻ răng cưa là 1,15 + 0,06% Hàm lượng taninoid trong Diệp hạ châu đắng là 7,78 + 0,12% còn trong Chó đẻ răng cưa là 9,11 + 0,55%
Kết quả nghiên cứu chiết xuất
Nghiên cứu chiết xuất trong điều kiện phòng thí nghiệm với qui mô 100g hoặc 200g/mẻ, hàm lượng trung bình bột bán thành phẩm Dihacharin chiết được là 7,03
%
Nghiên cứu chiết xuất ở xưởng sản xuất thí điểm với qui mô 40kg/mẻ, hàm lượng
trung bình bột bán thành phẩm Dihacharin chiết được là 6,98 %
Bột bán thành phẩm Dihacharin có hàm lượng trung bình của taninoid là 20% Nghiên cứu độc tính
Trang 5nặng) chuột đều khoẻ mạnh không có con nào chết, chứng tỏ Dihacharin an toàn về mặt độc tính cấp
-_ Trong thử nghiệm về độc tính bán trường diễn bột Dihacharin cho thỏ uống hàng ngày với liều 0,7 g/kg, trong 30 ngày liên tục, không làm ảnh hưởng đến chức nãng gan thận và chức năng tạo máu, cũng như không gây những biến đổi khác thường về mô bệnh học ở các cơ quan gan, thận và thượng thận của thỏ sau khi uống thuốc dài ngày
5Š Kết quả nghiên cứu dược lý
Những kết quả nghiên cứu dược lý đã chứng minh:
- - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan thực nghiệm
bằng CCl, ở thỏ cho thấy:
o_ Về hàm lượng enzym transanminase AST và ALT, ở lô bình thường không ding CCl, va không dùng thuốc, hàm lượng AST là 50,0 UIA và ALT là
117,7 UA Ding CCl, gay ra tén thuong gan nặng, nên hàm lượng AST là 210,6 U/1 gấp 4,2 lần; còn hàm lượng ALT là 582,2 U/l tang gan 5 lần Ở lô
dùng CCl, có kết hợp dùng thuốc, hàm lượng AST là 83,7 Ư/ giảm 2,5 lần và ALT là 198,7 U/ giảm 2,9 lần so với lô chi ding CCl, va có khuynh
hướng trở về gần bình thường
o_ Vẻ giải phẫu mô bệnh học gan, ở lô gây tổn thương gan bằng CCl,, các bè
gan bị phá huỷ, tế bào gan sưng to, nhiều chỗ tế bào gan bị mất nhân Ở lô dùng CCI, có kết hợp với thuốc, các tổn thương gan giảm rõ rệt
o_ Về khối lượng cơ thể thỏ, ở lô dùng CCI,, cân nặng thỏ trung bình là 2,13 +
0,04 kg, sau 15 ngày, giảm còn 2,00 + 0,05 kg, trong khi ở lô dùng CCI, két hợp với thuốc, khối lượng thỏ trước thí nghiệm là 2,07 + 0,04 kg; sau 15
ngày, khối lượng thỏ vẫn giữ mức 2,07 + 0,05 kg Nhưng sự khác nhau giữa
hai lô không có ý nghĩa thống kê
Trang 6o_ Về hàm lượng protein toàn phần trong huyết thanh, ở cả hai lô trứợc, trong va sau CCl,, protein đều không thay đổi có ý nghĩa thống kê
- _ Nghiên cứu tắc dụng ức chế xơ gan và chống peroxy hoá ở tế bào gan chuột cống trắng, trên mô hình gây xơ gan thực nghiệm bằng CCI,, cho thấy:
o Hàm lượng colagen ở lô chuột bình thường là 147,5 + 3,6 mg/100 g gan
tươi; ở lô gây xơ là 206,9 + 11,5 mg/100 g tăng 40% với P<0,001 Ở lô gây
xơ kết hợp dùng thuốc, hàm lượng colagen gan là 166,8 + 4,0 mg/100g giảm 19,4%, và xấp xỉ với lô bình thường _
o Ham lượng MDA trong gan ở lô chuột gây xơ tăng so với lô chuột bình thường là 73,4%, trong khi ở lô gây xơ có dùng thuốc, hàm lượng MDA chỉ tăng là 23,6% Như vậy hoạt tính chống peroxy hod cuả thuốc là 28,7%
o_ Về giải phẫu mô bệnh học, ở lô gây xơ, có hai gan chuột bị xơ nặng, ba xơ
vừa và ba xơ nhẹ Trong khi ở lô gây xơ kết hợp dùng thuốc, chỉ có một gan
chuột bị xơ vừa, bốn xơ nhẹ và ba không xơ
- _ Kết quả nghiên cứu tác dụng lợi mật ở chuột lang
Kết quả nghiên cứu tác dụng tiết mật ở chuột lang cho thấy: Lưu lượng mật ở lô
chứng khi chưa dùng thuốc, trong 30 phút đầu là 0,33 + 0,02 ml/100 g cân nặng chuột, lưu lượng trong 30 phút tiếp theo là 0,32 + 0,01 m1/100 g, giảm 3% Trong khi đó, ở lô
dùng thuốc với liều 0,7 g/kg, trước khi dùng thuốc, lưu lượng mật trong 30 phút là 0,34 + 0,03 ml/100 g, và 30 phút sau khi dùng thuốc, lưu lượng mật là 0,52 + 0,05 mi/100 gø, tăng 52,9% Ty lệ cặn khô trong mật và hàm lượng bilirubin trong mật không khác
nhau giữa hai lô, chứng tỏ thuốc làm tăng lưu lượng mật nhưng vẫn giữ được chất
lượng của mật,
- _ Kết quá nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp ở chuột cống trắng
Ở lô chứng, độ phù chân chuột sau khi gây viêm so với trước khi gây viêm tăng 61,8%,
trong khi ở lô cho uống thuốc với liều 3,5 g/kg cân nặng, độ tăng phù chỉ là 42,6%,
Trang 7- Kết quả nghiên cứu tác dụng lợi tiểu
Kết quả nghiên cứu tác dụng lợi tiểu ở chuột cống trắng cho thấy, ở lô chứng, thể
tích nước tiểu bài xuất trong 6 giờ là 3,11 mi/100 g chuột; ở lô dùng thuốc tham chiếu
là hydrochlorothiazid với liễu 4 mg/kg, thể tích nước tiểu là 7,40 ml/100 g bang
237,9% so với lô chứng với P<0,001 Thuốc Dihacharin với liều 0,7 g/kg can nang, thé tích nước tiểu là 4,38 ml/100 g, bằng 140,8% so với lô chứng; với liều 1,4 g/kg, thé tích nước tiểu là 5,56 ml/100g bằng 178,8% so với lô chứng với P<0,01
6 Bào chế viên nang Dihacharin
Từ bột bán thành phẩm Dihacharin đã bào chế ra viên nang cứng Dihacharin với tá được là tỉnh bột sắn, bột talc và natri carboxymethylcellulose theo phương pháp thông thường (phụ lục 3)
7 Xây dựng tiêu chuẩn
Đã tiến hành xây dựng các tiêu chuẩn sau:
- _ Xây dựng tiêu chuẩn được liệu Diệp hạ châu đắng gồm một số chỉ tiêu theo quy
định được ghi trong Dược điển Việt nam III (phụ lục 5)
- _ Xây dựng tiêu chuẩn bột bán thành phẩm Dihacharin gồm một số chỉ tiêu, trong đó hàm lương taninoid trong chế phẩm khan không được thấp hơn 20% (phụ lục 6)
- _ Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cấp cơ sở viên nang Dihacharin Ngoài các chỉ tiêu thông thường như các loại viên nang khác, viên nang Dihacharin phải đạt tiêu chuẩn độ vô khuẩn, phải có khối lượng là 0,50 g, phải chứa ít nhất 0,10 g taninoid
trong mỗi viên tính theo khối lượng trung bình, được Viện kiểm nghiệm thẩm định
và duyệt (phụ lục 4)
8 Nghiên cứu độ ổn định viên nang Dihacharin
Đã nghiên cứu 3 lô Kết quả cho thấy, tuổi thọ của viên nang Dihacharin đạt 24
tháng
9 Kết quả thứ nghiệm hiệu quả điều trị trên lâm sàng
Trang 8Bệnh nhân viêm gan virut B mạn được điều trị bắng Dihacharin có thời gian hết các
triệu chứng lâm sàng nhanh hơn
Tỷ lệ hổi phục các xét nghiệm hoá sinh về gan tốt hơn placebo có ý nghĩa thống kê
Nông độ HBsAg và tỷ lệ HBeAg(+) giảm nhanh so với chứng Có 20% bệnh nhân
điều trị bằng Dihacharin có chuyển đảo huyết thanh, trong khi nhóm chứng chỉ có 3,8% Nông độ HBV-DNA ở lô điều trị bằng Dihacharin cũng giảm rõ so với lô
chứng với P<0,05
Các bệnh nhân điều trị bằng Dihacharin có thể gặp tác dụng không mong muốn
như đầy bụng ợ hơi (20%), táo bón (13,3%), ngủ kém và vã mồ hôi về đêm (10%)
Các triệu chứng trên không thật sự làm bệnh nhân khó chịu, không cần ngừng
thuốc và cũng không cần xử trí bằng thuốc Dihacharin không làm thay đổi các xét
nghiệm huyết học như hồng cầu, bạch cầu, các thơng số hố sinh như urê,
Trang 9MỤC LỤC
NGHIÊN CỨU THUỐC DIHACHARIN ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM GAN TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐÁNG
Lời mở đầu 1
Chương 1 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngoài nước và trong nước | 3
1.1 _ Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước 4
1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 8
Chương 2 Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 9
2.1 Đối tượng nghiên cứu 9
2.2 Vật liệu nghiên cứu 9
2.3 Phương pháp nghiên cứu 10
2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 10
2.3.2 Nghiên cứu về hoá học 10
_ 2.3.3 Nghiên cứu chiết xuất i
2.3.4 Nghiên cứu về độc tính 14
2.3.5 Nghiên cứu tác dụng dược lý 15
2.3.6 Nghiên cứu bào chế viên nang Dihacharin 19
2.3.7 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn 19
2.3.8 Nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin 19
2.3.9 Nghiên cứu lâm sàng 20
2.3.10 Xử lý kết quả nghiên cứu 23
Chương 3 Kết quả nghiên cứu 24
3.1 Về thực vật học 24
3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật 24
3.1.2 Dac điểm vi phẫu thân của hai loài 27 3.1.3 Đặc điểm bột được liệu ở hai loài 2
Trang 10
3.2.1 Định tính các nhóm chất chính trong được liệu 3.2.2 Định lượng flavonoid toàn phần
3.2.3 Định lượng taninoid
3.3 Kết quả nghiên cứu chiết xuất bột bán thành phẩm Dihacharin
3.3.1 Hiệu suất ở qui mô phòng thí nghiệm
3.3.2 Hiệu suất ở qui mô pilot
3.4 Kết quả nghiên cứu độc tính 3.4.1 Độc tính cấp
3.4.2 Độc tính bán trường diễn
3.5 Kết quả nghiên cứu tác dụng được lý
3.5.1 Tác dụng bảo vệ gan trên mô hình tổn thương gan bằng CCl, 3.5.2 Tác dụng ức chế xơ gan và chống peroxy hoá gan trên mô hình xơ gan
3.5.3 Tác dụng lợi mật của Dihacharin 3.5.4 Tác dụng chống viêm cấp tính
3.5.5 Tác dụng lợi tiểu 3.6 Bào chế viên nang Dihacharin
3.7 Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn 3.7.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu
3.7.2 Tiêu chuẩn bán thành phẩm và thành phẩm
3.8 Nghiên cứu độ ổn định của thuốc
3.9, Kết quả nghiên cứu lâm sàng
3.9.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B mạn trước điều trị
3.9.2 Kết quả điều trị ở hai nhóm bệnh nhân viêm gan B mạn 3.9.3 Tác dụng không mong muốn của Dihacharin
Trang 11Phụ lục Phụ lục 1 Cách định tính và kết quả định tính từng nhóm chất Phụ lục 2 Cách định tính và kết quả định tính flavonoid bằng SKLM Phụ lục 3 Qui trình sản xuất viên nang Dihacharin
Phụ lục 4 Phiếu kiểm nghiệm viên nang Dihacharin của Viện KN Phụ lục 5 Tiêu chuẩn nguyên liệu Diệp hạ châu đắng
Phụ lục 6 Tiêu chuẩn bán thành phẩm bột Dihacharin
Phụ lục 7 Tiêu chuẩn viên nang Dihacharin và phương pháp thử Phụ lục 8 Danh sách bệnh nhân nghiên cứu lâm sàng
Phụ lục 9 Biên bản họp hội đồng KHCN đánh giá kết quả nghiên cứu đề
Trang 12BANG CHU GIAI NHUNG CHU VIET TAT ALT Anti HBc Anti HBe AST ATP BN CDRC DHCD DT ELISA etal HBeAg HBsAg HBV HPLC SGOT SGPT SKLM TCYTTG VG VGV VGVM VGVMHĐ Alanin aminotransferase
Kháng thể kháng kháng nguyên lõi của HBV
(Antibody against Hepatitis B core antigen) Kháng thể kháng kháng nguyên e của HBV (Antibody against Hepatitis B e antigen) Aspartat aminotransferase Adenosin triphosphat Bệnh nhân Chó đẻ răng cưa Diệp hạ châu đắng Điều trị
Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym
(enzyme linked immunosorbent assay) và những người khác
Kháng nguyên e của HBV (Hepatitis B e Antigen)
Kháng nguyên bẻ mặt của HBV (Hepatitis B surface Antigen)
Virut viêm gan B (Hepatitis B virus)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High pressure liquid chromatography)
Tên khác của AST (Serum glutamate oxaloacetate transaminase)
Trang 13ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Tính cấp thiết của đề tài
Viêm gan được quan tâm đặc biệt của nền y tế nước ta và của thế giới, nhất là hiện
nay, tình trạng viêm gan do thuốc, do hoá chất, do thuốc trừ sâu diệt cỏ, do uống rượu, do
virut ngày càng tăng Chỉ tính riêng viêm gan do virut, tỷ lệ số người mắc rất cao; trong
đó, theo Tổ chức Y tế thế giới, hiện nay, trên thế giới có khoảng 2 tỷ người nhiễm virut
viêm gan B với trên 350 triệu là viêm gan B mạn tính, riêng châu Á là 200 triệu người Hàng năm, có khoảng 2 triệu người mang virut viêm gan B mạn tính bị chết do xơ gan, ung thư gan
Việt nam ta, cũng như các nước Đông Á, Nam Á, kể cả Trung Quốc, Ấn Độ, nằm
trong khu-vực virut viêm gan B lưu hành cao của thế giới Theo các điều tra dịch té học, tỷ lệ người mang virut viêm gan B ở nước ta là 8-15% Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các
thuốc phòng chống viêm gan là rất cấp bách
Các thuốc chống viêm gan, bảo vệ gan, tăng cường chức năng gan, Tây y cũng dùng thuốc từ cây cỏ như dùng cao từ quả cây Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn., hoặc chiết từ quả, chất flavon lignan, thường gọi là silymarin, một hỗn hợp gồm silybin, silydianin, silychristin Người Ấn Độ còn dùng cao hoặc hỗn hợp glycosid iridoid từ cây Picrorhiza kurroa
Thuốc có tác dụng trên virut viêm gan B hiện nay thường dùng, như interferon
alpha, lamivudin, có nhiều nhược điểm, như tác dụng có mức độ, có nhiều tác dụng không
mong muốn và rất đất Trong khi đó, cây diệp hạ châu đắng, trước đây còn gọi là cây chó đẻ răng cưa (và hiện nay, vẫn còn nhiều người gọi như vậy) đã được nhân dân ta từ lâu đời dùng làm thuốc trị viêm gan, vàng da Trong thời gian gần đây, nhiều công trình trên thế giới đã nghiên cứu và thấy cao chiết từ cây điệp hạ châu đắng, không những có tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan, làm phục hồi lại chức năng gan, mà còn có tác dụng ức chế DNA polymerase của virut viêm gan B nên ức chế sự phát triển của virut viêm gan B
Trang 14diệp hạ châu đắng là một vấn đề cấp thiết, mang lại lợi ích không những vẻ y tế, xã hội, mà cả về kinh tế, góp phần giảm ngoại tệ để nhập thuốc
1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu là chế tạo ra viên nang Dihacharin từ cây diệp hạ châu đắng để làm thuốc bảo vệ gan, chữa viêm gan, phục hồi chức năng gan đã bị tổn thương và ức chế sự phát triển của virut viêm gan B
Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu sẽ tiến hành các vấn để sau:
Nghiên cứu về thực vật để xác định rõ đối tượng nghiên cứu, vì hiện nay còn nhầm lần giữa tên cây điệp hạ châu đắng và cây chó đẻ răng cưa
Nghiên cứu về hoá học, xác định các nhóm chất và sơ bộ định lượng một số
nhóm chất trong cây
Nghiên cứu phương pháp chiết xuất tạo ra bán thành phẩm bột dihacharin có tiêu chuẩn để chế tạo ra dạng thuốc Đó là cao chiết có định hướng và loại tạp từ
cây Diệp hạ châu đắng /
Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của Dihacharin
Nghiên cứu được lý theo hướng tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan, chống xơ gan của bán thành phẩm Dihacharin
Nghiên cứu bào chế viên nang Dihacharin để thử lâm sàng
Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử của nguyên
liệu điệp hạ châu đắng, của bán thành phẩm Dihacharin và của viên nang Dihacharin
Nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin
Trang 15Chương Í
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGỒI NƯỚC VÀ TRONG NƯỚC
Khi gan bị tổn thương, đù là tổn thương gan đo thuốc (như thuốc chống ung thư, thuốc chống lao, kháng sinh và nhiều thuốc khác có thể gây tổn thương gan), do thuốc trừ sâu, thuốc điệt cỏ, do nhiễm hoá chất, đặc biệt là các hoá chất có nhân benzen, các chất halogen hoá, do uống nhiều rượu, hoặc do virut đều phải giải quyết hai mặt: Một mặt, phải cắt đứt nguyên nhân gây bệnh; mặt khác, phải dùng các thuốc bảo vệ gan, thuốc phục hồi lại chức năng gan `
Đối với các nguyên nhân do thuốc, do thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, do rượu hoặc
hoá chất, thì phải ngừng ngay việc dùng hoặc tiếp xúc với các nguyên nhân trên Riêng đối với nguyên nhân do virut, nếu là nguyên nhân do các virut thông thường, như virut viêm gan A, thì bệnh thường tự khỏi Ngay đối với nguyên nhân do các virut khác như virut viêm gan B, C, D, cũng có tới 85-90% bệnh nhân viêm gan cấp có thể tự khỏi Số còn
_lại, khoảng 10-15%, virut còn tổn tại lâu dai trong cơ thể, và tiếp tục gây tổn thương gan, dẫn đến viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan
Để điều trị viêm gan man hién nay, nhiéu thay thudc ding interferon alpha Brook
et al., 1989 [19] thấy, nhiều bệnh nhân bị nhiễm virut viêm gan B mạn đáp ứng được với
interferon alpha Thomas et al., 1994 [64] đã nghiên cứu so sánh 3 liều lớn nhỏ khác nhau
của interferon alpha trong điều trị viêm gan B mạn hoạt động; còn Wong, 1998 [73] đã
phân tích giữa giá cả và tính hiệu quả khi dùng interferon để điều trị nhiễm virut viêm gan
B hoặc C mạn tính Lamivudin cũng được nhiều thày thuốc ưa dùng Buti et al., 2001 [20] đã dùng lamivudin để điều trị viêm gan B mạn tính cho bệnh nhân có anti-HBe dương tính Dasilva et al., 2001 [23] đã nghiên cứu tính hiệu quả và sự dung nạp khi dùng liều cao lamivudin để điều trị bệnh nhân viêm gan B mạn tính Qua nghiên cứu, các tác giả -
thấy, tác dụng của interferon alpha và lamivudin chỉ có mức độ, lại có thể gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn, và đặc biệt là giá rất đất Trong y học cổ truyền của nhân
dân ta, vẫn dùng cây diệp hạ châu đắng để chữa viêm gan, vàng đa, suy giảm chức năng
Trang 161.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NGOÀI NƯỚC
Những năm gần đây, trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu cây diệp hạ châu
dang
1.1.1 Tác dụng chống tổn thương gan, phục hồi chức năng gan và tác dụng trên
virut viém gan in vitro
Vẻ tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan, Saraf et al., 1991 [59] đã nghiên
cứu chế phẩm thuốc “Hepatogard”, trong thành phần có diệp hạ châu đắng, và thấy, chế phẩm có tác dụng bảo vệ gan, làm phục hồi chức năng gan trên tổn thương gan thực
nghiệm do CC Mehrota et al., 1991 {42] cũng nghiên cứu tác dụng của diệp hạ châu
đắng trên virut viêm gan B in vitro, Huang et al., 2003 [27] đã chứng minh, một số hợp
chất phân lập được từ các loài thuộc chị Phyllanthus có tac dung in vitro trên virut viêm
gan Bở người
1.1.2 Tác dụng trên cơ chế của sự phát triển virut viêm gan B
Unander, 1991 [69] đã nghiên cứu tạo callus của diệp hạ châu đắng và nghiên cứu
tác dụng của cao chiết từ callus ức chế enzym DNA polymerase của virut và ức chế enzym sao chép ngược Yeh et al., 1993 [75] đã nghiên cứu tác dụng của cao chiết từ diệp hạ châu đắng trên kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg) ở tế bào u gan của
người Lee et al., 1996 [37] thấy điệp hạ châu đắng làm giảm sự phiên mã và sự sao chép RNA thông tin trong virut viêm gan B Theo Jayarams et al., 1996 [31], điệp hạ châu đắng ức chế sự phát triển của virut viêm gan B, nên ức chế sự tiết HBsAg của dòng tế bào Alexander Con Ott et al., 1997 [51] lại thấy điệp hạ châu đắng ức chế virut viêm gan B do cất đứt sự tương tác giữa yếu tố phát triển virut viêm gan và yếu tố sao chép tế bào Notka et al., 2003 [49] cũng đã nghiên cứu và thấy diệp hạ châu đắng ức chế được virut gây suy
giảm miễn dịch ở người, đồng thời cũng ức chế được chủng virut đã kháng lại các chất ức
Trang 171.1.3 Tác dụng in vivo trên virut viêm gan B ở vịt
Niu et al, 1990 [48] dad gay nhiém virut viêm gan B ở vịt, rồi cho dùng điệp hạ châu đáng, thấy thuốc có tác dụng ức chế sự nhân lên của virut viêm gan B ở vit Munshi et al., 1993 [44] đã đánh giá tác dụng của diệp hạ châu đắng, thấy thuốc có tác dụng phòng ngừa, sau khi cho vịt mới nở phơi nhiễm với virut viêm gan B Cũng Munshi et al., 1993 [45] thấy diệp hạ châu đắng có tác dụng kháng hepadnavirus ở vịt mang virut viêm gan B này
1.1.4 Tác dụng chống viêm
Mới đây, một số tác giả đã chứng minh diệp hạ châu đắng có tác dụng chống viêm Kassuya et al., 2003 [34] đã nghiên cứu và thấy cao chiết từ diệp hạ châu đắng và các dẫn chất lignan chiết từ điệp hạ châu đắng có tác dụng giảm đau và giảm phù trên mô hình đau do bệnh lý thần kinh và viêm kéo dai Kiemer et al., 2003 [35] thấy diệp hạ châu đắng có tác dụng chống viêm mạnh do ức chế iNOS (su téng hợp nitric oxyd vô cơ), COX2 và cytokin qua con đường NF-kappa B Cũng trong năm 2003, Raphael và Kuttan [58] thấy
cao diệp hạ châu đắng ức chế viêm và tổn thương dạ dày thực nghiệm Còn Kumar và
Kuttan, 2004 [36] thấy cao diệp hạ châu đắng có tác dụng phòng ngừa, chống lại tổn
thương do chiếu tia X ở chuột nhắt trắng
1.1.5 Tác dụng trên u, ung thư và đột biến _
Jeena et al., 1999 [32] đã nghiên cứu và thấy diệp hạ châu đắng có tác dụng ức chế ung thư gan trên mô hình gây ung thư gan bằng N-nitrosodiethylamin Gây ung thư tế bào gan cho chuột cống trắng, rồi dùng cao diệp hạ châu đắng, Rajeshkumar và Kuttan, 2000
[52] thấy ở lô dùng thuốc, chuột có thời gan sống kéo dài hơn nhiều so với lô chứng không dùng thuốc Cũng Rajeshkumar et al, 2002 [53] thấy cao chiết từ diệp hạ châu đắng có tác dụng chống u và tác dụng chống lại ung thư do tác nhân gây ung thư Cùng nghiên cứu
Trang 18diép ha chau dang có tác dung chống lại đột biến được sinh ra đo một số tác nhân khác
nhau
1.1.6 Một số tác dụng được lý khác
Từ 1995, Srividya và Periwall [61] đã nghiên cứu và thấy diệp hạ châu đắng có tác dụng lợi tiểu, làm hạ huyết áp và hạ glucose huyết Đến năm 2001, Moshi et al [43] thấy cao chiết nước của điệp hạ châu đắng có tác dụng hạ glucose huyết ở bệnh nhân đái tháo
đường không phụ thuộc insulin Còn Raphael et al, 2002 [56] da thir va thdy, cao chiét bằng methanol của diệp hạ châu đắng có tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình gây đái
tháo đường do alloxan ở chuột cống trắng Sự giảm glucose huyết có liên quan đến cường độ chống oxy hoá của cao
Rao va Alice, 2001 [55] da nghiên cứu và không thấy điệp hạ châu đắng có ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của chuột nhất trắng cái Còn Adedapo et al., 2003 [15] đã
thử một số phân đoạn chiết bằng sắc ký cột của điệp hạ châu đắng cũng không thấy có ảnh
hưởng trên hình thái và mô bệnh học của các cơ quan sinh sản chuột cống trắng đực
1.1.7 Nghiên cứu nuôi trông
Nhờ tác dụng tốt của điệp hạ châu đắng trên viêm gan, nên nhu cầu cần nhiều khiến
Unander et al., 1995 [70] đã nghiên cứu cách trồng trọt cây diệp hạ châu đắng, nghiên cứu
các yếu tố ảnh hưởng đến sự nảy mầm, cũng như sự hình thành và phát triển của cây diệp hạ châu đắng Ngay từ năm 1991, cũng tác giả Unander [69] đã nghiên cứu tạo callus ở một số loài thuộc chi Phyllanthus
1.1.8 Tác đụng điều trị bệnh gan và viêm gan B ở người
Trong thời gian gần đây, trên thế giới, đã có nhiều tác giả nghiên cứu tác dụng của
cây diệp hạ châu đắng trong điều trị tổn thương gan, viêm gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, kể cả viêm gan do virut A, B, C Thyagarajan et al., 1988 [65] đã nghiên cứu và thấy
Trang 19gan B Blumberg et al., 1989 {16] nghién ctu diéu tri virut viém gan B và ung thư tế bào
gan cho bệnh nhân mang virut viém gan B bang diép ha chau dang Thyagarajan et al.,
1990 [66] cũng công bố trên tạp chí The Lancet về tác dụng của diệp hạ châu đắng trên
viêm gan B Blumberg et al., 1990 [L7] đã điều trị những bệnh nhân mang virut viêm gan B mạn tính và cả bệnh nhân bị ung thư tế bào gan sơ phát bằng diệp hạ châu đắng
Thamlikitkul et al., 1991 [63] ding diệp hạ châu đắng để điều trị tiệt căn cho bệnh nhân bi viêm gan B mạn tính Doshi et al., 1994 [24] đã nghiên cứu thử lâm sàng 2 giai đoạn của diệp hạ châu đắng cho bệnh nhân mang virut viêm gan B Wang et al., 1995 [71] đã
nghiên cứu điều trị viêm gan B mạn tính bằng 3 chế phẩm thuốc lấy từ các cây thuộc chỉ
Phyllanthus mọc ở các nơi có điều kiện thổ nhưỡng khác nhau Narendranathan et al., 1999 [46] cũng thử nghiệm lâm sàng diệp hạ châu đắng trong điều trị viêm gan cấp do virut Năm 2001, Xinhua et al [74] đã nghiên cứu so sánh tác dụng của các chất chiết từ diép ha chau dang va interferon trong diéu tri viém gan B man tinh
Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) cũng được nhiều tác giả nghiên cứu Chan et al, 2003 [22] đã nghiên cứu thử lâm sàng cây chó đẻ răng cưa theo phương pháp 2
lần mù, có kiểm tra so sánh với placebo trong điều trị viêm gan B mạn tính; còn Huang et al., 2003 [28], thấy cây chó đẻ răng cưa có tác dụng làm khởi động cho quá trình chết tế
bào theo chương trình (apoptosis), cũng như điều hoà xuống Bcl-2 ở các tế bào ung thư
phéi Lewis
Calixto et al., 1998 [21] đã có tổng quan các cây thuốc thuộc chỉ Phyllanthus, trong
đó có cây điệp hạ châu đắng về thành phần hoá học, tác dụng dược lý và tác dụng điều trị
Trang 201.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Năm 1996, Nguyễn Phương Dung et al [6] đã nghiên cứu tác dụng của chế phẩm
Hepamarin được bào chế từ cây Diệp hạ châu đắng trên tổn thương gan thực nghiệm do
CCL, ở chuột nhất Kết quả cho thấy Hepamarin ở liều uống 4 g/kg trong 15 ngày có khả năng phục hồi tế bào gan bị thoái hoá và làm giảm hàm lượng AST sau khi dùng thuốc 7
ngày là 36,7%
Sau đó, cũng đã có một số công trình thử lâm sàng trên các bệnh nhân viêm gan,
vàng da và thấy có kết quả tốt Do đó, hiện nay trên thị trường, đã có một số mặt hàng thuốc từ cây Diệp hạ châu đắng và có xí nghiệp dùng cây Chó đẻ răng cưa Nhưng về dạng thuốc, có xí nghiệp dùng tồn dược liệu phơi khơ tán nhỏ, rây mịn rồi làm viên nén; có xí nghiệp chiết cao toàn phần rồi đóng vào ống tiêm; có xí nghiệp cũng chiết lấy cao toàn phần rồi trộn với một phần bột được liệu xay mịn hoặc trộn với tá dược trợ để sấy khô rồi làm viên nén hoặc viên nang
Do việc sử dụng cây Diệp ha chau ding va cay Chó đẻ răng cưa được quan tâm
nhiều, nên đã có nhiều tác giả [L1] [12] nghiên cứu về mặt thực vật học của hai cây này
Trang 21Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là cây diệp hạ châu đắng, tên khoa học là Phyllanthus
amarus Schum et Thonn., họ Thâu dầu Euphorbiaceae Nhưng do còn có sự nhầm lẫn về tên gọi với cây chó đẻ răng cưa, nên trong phần nghiên cứu về thực vật học và hoá học, có nghiên cứu cả cây chó đẻ răng cưa, tên khoa học là Phyllanthus urinaria L., cùng họ Thầu dầu Euphorbiaceae Mẫu được liệu được thu hái vào tháng 6-7 tại huyện Đông Anh, thành
phố Hà nội
Mục đích của đề tài là nghiên cứu ra viên nang Dihacharin để điều trị viêm gan từ cây diệp hạ châu đắng Vì vậy, các phần nghiên cứu về thực vật, về hoá học và về chiết
xuất là để chế tạo ra bột bán thành phẩm Dihacharin đạt tiêu chuẩn chất lượng cơ sở Việc
nghiên cứu độc tính và được lý được tiến hành trên bột bán thành phẩm Dihacharin là dạng sẽ được dùng trực tiếp để bào chế viên nang Dihacharin Việc nghiên cứu xây dựng
tiêu chuẩn và phương pháp thử, nghiên cứu độ ổn định cũng như nghiên cứu lâm sàng
được tiến hành trên viên nang Dihacharin, là dạng thuốc sẽ được sản xuất, lưu hành trên
thị trường sau này để điều trị viêm gan
2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Động vật nghiên cứu gồm thỏ, chuột cống trắng, chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh, đạt
yêu cầu của từng loại thí nghiệm
Các loại dung mơi, hố chất đạt yêu cầu về chất lượng và độ tính khiết do các hãng trong nước và ngoài nước cung cấp
Các dụng cụ và máy móc nghiên cứu thực vật như máy cắt tiêu bản, nhuộm tiêu
bản, kính hiển vi thường và kính hiển vi có độ phóng đại cao
Các dụng cụ, máy móc để chiết xuất và thu hồi dung môi trong phòng thí nghiệm
và ở xưởng pilot như bộ ngấm kiệt, máy cất quay Buchi, tủ sấy thường, tủ sấy chân không,
Trang 22Các dụng cụ, máy móc phân tích hoá học như máy đo điểm chảy, máy đo phổ các
loại gồm máy Varian 1, Cary IE, sắc ký lớp mỏng
Các máy móc để nghiên cứu độc tính và tác dụng được lý như máy phân tích sinh hoá bán tự động Scout, máy phổ quang kế UV-VIS UVMini 1240, các kit thuốc thử để định lượng, máy cắt tiêu bản, máy đúc tiêu bản, máy nhuộm tiêu bản gan, thận, thượng
thận, bộ dẫn lưu mật, máy đo biến đổi thể tích chân chuột, bộ thu nước tiểu
Các dụng cụ và máy nghiên cứu bào chế như rây, sàng, máy trộn, máy sấy, máy
làm nang, máy thử độ rã Các dụng cụ và máy xác định các chỉ số của tiêu chuẩn và
nghiên cứu độ ổn định của thuốc
Đối tượng bệnh nhân và các dụng cụ, máy nghiên cứu lâm sàng như các máy xét nghiệm huyết học, xét nghiệm nước tiểu, xét nghiệm chức năng gan, máy ELISA dùng kít của hãng Sanofi dé dinh lugng HBsAg, anti-HBc-IgM, anti-HBc-IgG; ding kit cha hang
GMC (General Biological Corp.) dé dinh lugng HBeAg, anti-HBe, anti-HBs, , anti-HBc-
IgM; xét nghiém HBV va HBV-DNA ding ky thuat PCR 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nghiên cứu về thực vật
Việc định tên khoa học, cũng như vi phẫu và soi bột dược liệu theo phương pháp thường quy vẫn được áp dụng [2], có đối chiếu với nhiều tài liệu [1], (51, f10], [L1], [12],
[14]
2.3.2 Nghiên cứu về hoá học
2.3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ
Việc định tính các nhóm chất hữu cơ được tiến hành theo sách “Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc” [9]
2.3.2.2 Định luong flavonoid
Flavonoid được định lượng theo phương pháp cân [1] Cụ thể như sau:
Cân chính xác khoảng 20 g bột dược liệu Xác định độ ẩm dược liệu trên máy
Grainer H Thấm ẩm dược liệu bang cén 90° rồi cho vào túi giấy lọc Cho túi vào bình Soxhlet và chiết bằng cồn 90° đến khi dich trong bình không cho phản ứng Cyanidin Cất
Trang 23thu hồi dung môi đến gần cạn Tiếp tục bay hơi trên nồi cách thuỷ đến hết cồn Thêm vào
cắn 50ml nước cất, tiếp tục đun cách thuỷ trong 30 phút Lọc lấy dịch nước Chiết bằng
nước 2-3 lần như vậy cho hết flavonoid Gộp dịch nước vào một bình gạn dung tích
500ml Chiết bằng ethylacetat 6 lần, mỗi lần 50ml Gộp dịch ethylacetat rồi bay hơi trên nổi cách thuỷ đến khô Sấy cắn ở 80 °C đến khối lượng không đổi Cân trên cân phân tích
rồi tính hàm lượng flavonoid 2.3.2.3 Định lượng taninoid
Việc định lượng taninoid được tiến hành theo phương pháp ghi trong Dược điển /
Việt nam 3 [3] Cụ thể như sau: TS
Can chính xác 2g được liệu đã tán nhỏ (ray số 36) cho vào một bình nón Đổ thêm
50ml nước sôi và đun cách thuỷ, vừa đun vừa khuấy trong 30 phút Để yên vài phút, lọc
qua bông cho vào bình định mức 250ml Tiếp tục chiết như trên nhiều lần cho tới khi dịch
chiết không cho phản ứng của tanin (thử với sắt III clorid hoặc phèn sắt amoni) Lam
nguội chất lỏng trong bình định mức và thêm nước vừa đủ tới vạch
Lấy 25ml dung dịch trên cho vào một bình nón dung tích 1000m1, thêm 750ml nước và 25ml dung dịch sunfo-indigo (CT) Định lượng bằng dung dich kali permanganat
0,1N cho tới khi chuyển sang mầu vàng
1ml KMnO; 0,1N tương đương 0,004157g taninoid
Song song tiến hành một mẫu trắng gồm 25ml dung dịch sunfo-indigo (CT) và 750ml nước Hàm lượng % taninoid trong dược liệu được tính theo công thức: (a-b) x 0,004157 x 250 x 100 25x2
Trong đó: a là số mỊ KMnO,O0,1N dùng cho mẫu thử b là số ml KMnO, 0,1N đùng cho mẫu trắng
2.3.2.4 Sac ky lớp mỏng với chất hấp phụ là silicagel G của Viện Kiểm nghiệm
2.3.3 Nghiên cứu chiết xuất
Trang 24Qua nghiên cứu vẻ thành phần hoá học của diệp hạ châu đắng thấy có nhiều
taninoid và flavonoid là những thành phần có tác dụng trên viêm gan Do đó, cách chiết ra bán thành phẩm bột Dihacharin theo hướng cách chiết để lấy phân đoạn flavonoid và
taninoid
2.3.3.1 Chiết xuất trong phòng thí nghiệm
al Xử lý nguyên liệu
Dược liệu thu mua vào thời gian có hoa qủa (tháng 6-7) Phơi khô Khi phơi lá rụng nhiều, chú ý thu lấy cả phần lá rụng vì hoạt chất nằm nhiều trong lá Cây, cành được chặt thành các đoạn ngắn 3-4 cm, sau đó cho vào máy xay cỡ nhỏ (loại máy xay cánh búa)
xay thành bột thô
bị Chiết xuất
Dược liệu đã xay và dung môi là cồn cho vào bình cầu có lấp sinh hàn ngược, đặt
trên bếp cách thuỷ, thực hiện chiết hồi lưu
Chiết 4 lần:
+ Về lượng dung môi:
Lần: 1 phần dược liệu/6 phần dung môi (Khối lượng/ thể tích) Lần 2,3,4: 1 phần dược liệu/Š phần dung môi
+ Về thời gian:
Lần 1,2,3: Mỗi lần Igiờ 30 phút tính từ khi sôi
Lần 4: Chiết 1 giờ
Mỗi lần chiết xong, lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp trên phêu thuỷ
tỉnh thường Bã dược liệu nạp thêm dung môi mới để chiết tiếp lần khác cÍ Thu hồi dung môi
Dịch chiết của các lần chiết được thu hồi dung môi bằng máy cất quay Buchi R- 200 Dung môi thu hồi được dùng để chiết mẻ khác Dịch chiết được cô đặc cho đạt ty lệ
1/1 (1 khối lượng dược liệu / 1 thể tích cao) (Nếu cao này để lâu chưa xử lý nên bảo quản
trong tủ lạnh)
Trang 25Cao lỏng được loại tạp và lọc qua giấy lọc trên phêu lọc Buchner ( Có hút chân không)
el Sdy, xay
Dịch chiết đã được loại tạp được cất thu hồi dung môi, rồi để bay hơi trên bếp cách
thuỷ cho hết dung môi và sấy trong tủ sấy chân không Heareus ở nhiệt độ 60- 70°C đến khô (Độ ẩm 3 - 4%) Sau đó nghiền trong cối sứ thành bột, đựng trong lọ thuỷ tỉnh nút
kín Bột này được gọi là Dihacharin
2.3.3.2 Chiết xuất ở quy mô Pilốt
al Xử lý nguyên liệu
Cho dược liệu vào máy xay thành bột thô
bị Chiết xuất -
~- Cân khoảng 40 kg dược liệu đã xay cho vào túi vải để sẵn trong bình chiết (bình chiết có dung tích 250 tít) Đậy lắp và văn chốt
- Bơm nạp 200 lít cồn vào bình chiết, điều chỉnh áp suất hơi nóng sao cho dụng môi
sôi và hồi lưu một cách điều hoà (nếu nóng quá dung môi sẽ sôi trào ra ngoài theo đường sinh hàn)
- Cứ 30 phút bơm đảo dung môi 3 phút
- Khi đạt thời gian chiết xuất (lần thứ nhất, thứ 2, thứ 3 mỗi lần chiết 1 giờ 30 phút
tính từ lúc dung môi trong bình chiết sôi đến khi mở van tháo dịch, lần thứ 4 chiết với thời gian | giờ) mở van tháo dịch chiết vào thùng chứa, rồi bơm dung môi mới vào bình chiết
tiếp (lần chiết thứ 2, thứ 3, thứ 4, mỗi lần bơm nạp 160 lít)
- Thu hồi cồn từ bã được liệu : Sau khi địch chiết lần thứ 4 chảy hết vào bình chứa Bã được liệu được xục hơi nóng trực tiếp đồng thời tăng nhiệt độ của bình đun, khi đó lượng cồn còn lại trong bã dược liệu sẽ bay hơi tiếp và ngưng tụ Ở ống sinh hàn rồi chảy về bình ngưng trung gian, khi hứng được khoảng 30 lít thì kết thúc phần thu hồi dung môi từ bã được liệu
cl Cé dich chiét
Dịch chiết được đưa vào máy cô màng mỏng để thu hồi dung môi bang bơm hút
chân không Điều chỉnh tốc độ dòng chảy của dịch chiết vào máy cô, điều chỉnh áp suất
Trang 26hơi nóng và độ chân không sao cho phù hợp để dung môi thu hồi chảy nhiều và đều vào
thùng chứa dung môi thu hồi của máy và phần dịch chiết đã được cô cũng chảy đều vào
bình chứa dịch cô của máy
Cô đến thành dang cao đặc 1/1 (1kg được liệu được 1 lít cao)
dl Xit ly cao
Cao lỏng được loại tạp và lọc qua vải trên thùng lọc có hút chân không (cho nhanh)
el Sdy, xay
Dịch chiết đã loại tạp được sấy khô trong tủ sấy chân không ở nhiệt độ 60-70° C
cho đến khô (độ ẩm còn khoảng 3%)
Sau đó xay thành bột và bảo quản trong túi PE Bột có màu nâu hoặc nâu hơi xanh,
vị đắng và có mùi thơm đặc biệt Bột này được gọi là Dihacharin
2.3.4 Nghiên cứu độc tính
2.3.4.1 Nghiên cứu độc tính cấp
Việc xác định độc tính cấp được tiến hành theo sách “Phương pháp nghiên cứu độc
tính cấp của thuốc” [7] Cụ thể như sau:
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhất trắng khoẻ mạnh, không phân biệt đực
cái có khối lượng 19-22 g do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp Cho chuột nhịn đói 16 giờ
trước khi dùng thuốc
Bột Dihacharin được nghiền trong cối chày sứ và hoà với nước đến đậm độ thích hợp, rồi cho chuột uống bằng cách dùng một bơm tiêm cho thuốc trực tiếp vào dạ dày qua một kim cong đầu tù Thuốc được dùng một lần Sau khi dùng thuốc, chuột được theo dõi
trong 3 ngày Liêu lượng thuốc được tính theo bột Dihacharin cho 1 kg cân nặng chuột
2.3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Ai Quá trình thí nghiệm
Trang 27liệu 7 ngày trước khi thí nghiệm để ổn định điểu kiện sống Khi bất đầu thí nghiệm, lấy
máu lần đầu để xác định các thông số bình thường của thỏ trước khi uống thuốc Sau đó, ở 16 thử thuốc, cho thỏ uống bột bán thành phẩm Dihacharin với liều mỗi ngày 0,7 g/kg hoà trong 3 mÌ nước, tính ra được liệu khô là 10 g/kg Lô chứng, cho thỏ uống nước cất với
cùng thể tích (3 ml/kg/ngày) Cả 2 lô đều cho uống liền 30 ngày
Sau 15 ngày uống thuốc và sau khi ngừng thuốc, lấy máu thỏ để.kiểm tra các thông số huyết học và hoá sinh Khi ngừng thuốc, sau khi lấy máu thỏ xong, lấy gan, thận, thượng thận để xét nghiệm đại thé va vi thé
BỊ Các thông số đánh giá:
- Các thông số huyết học, được đánh giá trên mdy phan tich mau Sysmex KX21, hod chat
do hang Sysmex cung cấp, gồm:
+ Số lượng bạch cầu
+ Số lượng hồng cầu + Tỷ lệ huyết sắc tố
- Các thơng số hố sinh để đánh giá chức năng gan và thận, được định lượng trên máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout, kit do hãng Human cung cấp, gồm:
+ Định lượng hoạt độ cdc enzym AST va ALT trong huyết thanh theo phương pháp của Reitman- Frankel sửa đổi bởi Sevela dùng 2 cơ chất là L-Alamin và L-Aspartat [29]
{30} :
+ Định lượng protein toàn phần trong huyết thanh bằng phương pháp Biurê [39] + Định lượng urea trong huyết thanh theo phơng pháp dùng enzym urease cua
Rappoport [67]
+ Định lượng creatinin trong huyết thanh bằng phản ứng Jaffé [40]
- Về giải phẫu bệnh lý, đã tiến hành xét nghiệm đại thể và vi thể của gan, thận, thượng thận để xem ảnh hưởng cuả thuốc đến các cơ quan này
2.3.5 Nghiên cứu tác dụng dược lý
Đúng ra, để nghiên cứu tác dụng được lý của Dihacharin, phải nghiên cứu cả 2 loại tác dụng:
Trang 28e _ Nghiên cứu tác dụng trên virut viêm gan B: Trong điều kiện hiện nay, chúng tôi chưa nghiên cứu được tác dụng trên virut viêm gan B thực nghiệm Phần này,
phải dành cho bệnh viện 103 nghiên cứu tác dụng của Dihacharin trên virut viêm
gan B ở người bị viêm gan B mạn hoạt động
e Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan, phục hồi lại chức năng gan: Để nghiên cứu loại tác dụng này, chúng tôi đã nghiên cứu các tác dụng sau:
- _ Gây tổn thương gan thực nghiệm bằng hoá chất, kết hợp đùng Dihacharin để đánh giá tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan
- Gây xơ gan thực nghiệm bằng hoá chất, kết hợp dùng Dihacharin để đánh giá tác dụng ức chế xơ gan, tác dụng trên giải phẫu bệnh lý gan và tác dụng
chống oxy hoá
-_ Tác dụng trên khả năng tiết mật, vì khi gan bị bệnh sẽ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tiết mật
- _ Tác dụng chống viêm cấp tính cũng là một khía cạnh của viêm gan
- Tác dụng lợi tiểu cũng góp phần váo tác dụng giải độc gan khi gan bị tổn
thương
2.3.5.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng CCI,
Thí nghiệm được tiến hành ở thỏ theo phương pháp của Turner có cải tiến [68]
CCI, được tiêm trong mang bụng với liều 1 ml/kg hoa trong dầu ô liu Dihacharin được nghiền trong cối chày sứ với nước cất đến đậm độ thích hợp và cho uống với liều hàng ngày là 0,5 g/kg từ 3 ngày trước và kéo dài cho đến 15 ngày sau CCI, Các thông số sau đây được xác định:
- _ Khối lượng cơ thể của thỏ
-_ Hàm lượng bilirrubin trong huyết thanh,
- Ham lugng cdc enzym transaminase AST va ALT
- Protein toan phan trong huyét thanh
Trang 292.3.5.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế xơ gan và chống peroxy hoá trên mô hình gáy xơ gan bằng CCI, [41]
Trên động vật thí nghiệm, nếu dùng CCI, liều thấp và ít lần sẽ gây tổn thương gan
Nhưng nếu dùng CCI, kéo dài thì tổn thương gan tiến triển, dẫn đến xơ gan Xơ là kết quả của quá trình tăng tổng hợp và tích tụ colagen ở gan
Thí nghiệm được tiến hành kéo dài 12 tuần trên chuột cống trắng khoẻ mạnh,
không phân biệt đực cái, cân nặng 85-100g Chuột được chia thành 3 lô: -_ Lô 1: Lô chứng, chuột không gây xơ để đối chứng
- Lô 2: Lô gây xơ Tiêm dưới da dung dịch CCI, trong đầu ô liu, 2 lần một tuần trong 12 tuần Néng do CCl, va liều dùng tuỳ theo thời gian:
4 tuần đầu: Tỷ lệ CCl,:dầu ô lu là 4:1, liều mỗi lần 0,20 ml/100g 4 tuần sau: Tỷ lệ CCI,:dầu 6 liu là 4:2, liều mỗi lần 0,30 m1/100g 4 tuần cuối: Tỷ lệ CCI,:dầu ô liu là 3:2, liều mỗi lần 0,40 ml/100g
- L6 3: LO gay xo + thuéc Cach gay xo nhu 16 2, nhung sau 4 tuần, cho chuột uống
thuốc Dihacharin hàng ngày với liều 0,7 g/kg
Sau 12 tuần, giết chuột bằng cách lấy một thanh gỗ, đập mạnh vào đầu chuột Mổ bụng chuột, bóc tách lấy gan để xác định các thông số sau:
- Ham lượng colagen gan là thông số biểu thị cho xơ gan
- _ Hàm lượng MDA trong gan là thông số biểu thị cho quá trình peroxy hoá gan - _ Xét nghiệm giải phẫu mô bệnh học gan
Hàm lượng colagen được định lượng theo phương pháp Newman Logan [47] Nguyên tắc của phương pháp là thuỷ phân gan để giải phóng ra hydroxyprolin (HP) Cho
HP phản ứng với paradimethylaminobenzaldehyd sẽ sinh ra một chất màu Đo quang ở
bước sóng 557 nm So sánh với đồ thị chuẩn HP, từ đó suy ra hàm lượng colagen gan (lmmol HP tương đương 1 mg colagen)
Xác định hàm lượng MDA trong gan bằng cách lấy gan, nghiền đồng thé, ly tam dé lấy dịch nổi, rồi cho phản ứng với acid thiobarbituric dé tao thành một phức hợp màu hồng {62] Đo cường độ màu để xác định hàm lượng MDA trong mẫu thử Thuốc có tác dụng
chống oxy hoá thì lượng MDA hình thành trong gan ít hơn so với lô chứng Hoạt tính chống oxy hoá được tính theo hàm lượng MDA giảm theo % so với lô chứng
Trang 30Xét nghiệm mô bệnh học đại thé va vi thé của gan bằng phương pháp quan sát trực
tiếp bằng mắt thường và bằng cách cất tiêu bản, nhuộm màu, rồi soi trên kính hiển vi có
độ phóng đại cao
2.3.5.3 Nghiên cứu tác dụng lợi mật /
Tác dụng lợi mật được tiến hành ở chuột lang [50] Đã xác định các thông số sau: - _ Lưu lượng mật {50]
- _ Cận khô của mật
- Dinh luong bilirubin trong dịch mật [54] 2.3.5.4 Tác dung chống viêm cấp tính
Tác dụng chống viêm cấp tính được tiến hành theo phương pháp gây phù thực
nghiệm bằng carragenin [72] Thí nghiệm được tiến hành ở chuột cống trắng, không phân biệt đực cái, cân nặng 100-130g Thể tích chân chuột được xác định bằng máy biến đổi
thể tích (Plethysmograph) trước (V,) và 3 giờ sau khi gây viêm (V;) Carragenin được pha trong nước thành dung dich 1% Tiêm 0,1 ml dung dich carragenin vao dưới đa gan bàn chân phải sau của chuột Để đánh giá cả tác dụng phòng ngừa, cả tác dụng điều trị, thuốc
Dihacharin được cho uống 3 lần: L giờ, rồi 30 phút trước carragenin, và 1 giờ sau carragenin Lô chứng được cho uống thay thuốc bằng nước cất với cùng thể tích Xác định
sự tăng phù của mỗi lô, rồi so sánh giữa lô thuốc với lô chứng
2.3.5.5 Tác dụng lợi tiểu
Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng cân nặng 150-200g [33] Chuột được chia làm 4 lô:
- _ Lô chứng : Cho uống dung dịch NaCl 0,9% với thể tích 4 m1/100g
-_ Lô tham chiếu: Cho uống hypothiazid với liều 4 mg/kg chuột Thuốc được pha trong
dung dich NaCl 0,9% với độ loãng vừa đủ để cho uống 4 mỊ1/100g
- _ Lô thuốc liều thấp: Cho uống Dihacharin với liều 0,7 g/kg (tính ra được liệu khô là
10 g/kg) Bột Dihacharin được hoà trong nước với độ loãng đủ để cho uống với thể
Trang 31- Lô thuốc liều cao: Cho uống Dihacharin với liều 1,4 g/kg (tính ra được liệu khô là 20 g/kg) Bột Dihacharin được hoà trong nước với độ loãng đủ để cho uống với thể
tích 4 m1/100g chuột
Cả 4 lô chuột đều cho uống 1 lần duy nhất vào sáng sớm Sau đó cho vào một dụng
cụ đặc biệt để thu nước tiểu bài tiết ra
Hàm lượng natri trong nước tiểu được định lượng bằng phương pháp so màu, dùng kit thuốc thử do hãng Human cung cấp và máy định lượng sinh hoá bán tự động Scout
(26]
Kali trong nước tiểu, ở môi trường kiểm, phản ứng với natri tetraphenylboron tạo ra
kali tetraphenylboron là một huyền phù Độ đục đo được ở 578 nm tỷ lệ với hàm lượng
kali trong nước tiểu Kit sử dụng do hãng Human cung cấp và thực hiện trên máy sinh hoá bán tự động Scout [25] :
2.3.6 Nghiên cứu bào chế viên nang Dihacharin
Việc bào chế viên nang Dihacharin được tiến hành theo phương pháp thông thường Trộn, tạo hạt, sấy khô, trộn với bột talc, rây, vào nang, đánh bóng nang, vào lọ theo cách
thức đơn giản
2.3.7 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm Xây dựng các chỉ tiêu nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm theo các yêu cầu chung đã được quy định trong Dược điển Việt nam 3
2.3.8 Nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin
Các mẫu thuốc được bảo quản ở nhiệt độ 30 °C + 2 °C; độ ẩm tương đối là 75% +
3%, tránh ánh sáng
Bao bì đóng gói: Viên nang được đóng trong lọ nhựa PVC, phía trên có một lớp
bông mỡ và một gói silicagel nhỏ, lọ có 2 nắp đậy kín
Thời gian theo dõi là 2 năm
Trang 32Phương pháp khảo sát: Theo tiêu chuẩn cơ sở, với các chỉ tiêu quy định trong Dược điển Việt nam 3 và cách xác định độ ổn định thuốc [4]
2.3.9 Nghiên cứu lâm sàng 2.3.9.1 Đối tượng nghiên cứu
AI Tiêu chuẩn lựa chọn các nhóm nghiên cứu
Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân VGB mạn: căn cứ theo tiêu chuẩn Dienstag 1998
và tiêu chuẩn Shaw-Stiffel-2000:
- Lâm sàng: BN có biểu hiện bệnh gan 2 6 tháng, không tự hồi phục
- AST, ALT tăng trên mức bình thường ít nhất 2 lần
- HBsAg (+), Anti-HBe-IgM (-), Anti-HBc-IgG (+) B Tiêu chuẩn loại trừ:
Những BN sau không lấy vào nhóm nghiên cứu là: - BN khong tu nguyén nghiên cứu
-_ Trẻ em < l6 tuổi và người già > 60 tuổi hoặc phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú - BN bị viêm gan do các nguyên nhân khác: do thuốc, do hoá chất, do rượu
- BN bi VGB két hợp các virus khác (có Anti HCV (+), Anti HIV (+) hoặc kết hợp
với các bệnh khác (như sốt rét, viêm đường mật, đái đường, bệnh tìm mạch ) - _ BN xơ gan, ung thư gan hoặc các bệnh gan khác có HBsAg (+)
2.3.9.2 Phương pháp nghiên cứu AI Phản chia các nhóm nghiên cứu:
60 BN đủ tiêu chuẩn lựa chọn, phân chia ngẫu nhiên thành 2 nhóm tương đương nhau:
- _ Nhóm điều trị (viết tắt: Nhóm ĐT): điều trị Dihacharin + điều trị cơ sở
~_ Nhóm đối chứng: điều trị cơ sở, không dùng Dihacharin BỊ Phác đồ điều trị:
Dihacharin (viên nhộng) 0,5gam: liều dùng 6 viên/ ngày, uống, chia làm 2 lần
Trang 33Tất cả các BN điều trị cơ sở hàng ngày bằng: Glucose bot : 50g Vitamin B, : 5 vién .VitaminC 0,10 =: 5 viên Vitamin B,0,05 : 2 viên Fortec 15mg : 4 viên C¡ Theo dõi:
Các BN đều được điều trị tại khoa Truyền nhiễm Bệnh viện 103, các BN được đăng ký theo một mẫu thống nhất các nội dung như sau:
Khám lâm sàng hàng ngày, theo dõi diễn biến các triệu chứng lâm sàng và phát hiện các dấu hiệu bất thường (các triệu chứng không mong muốn)
Xét nghiệm thường qui: bao gồm
Công thức máu, tốc độ lắng máu Xét nghiệm nước tiểu thường qui
Xét nghiệm hoá sinh: Bilirubin (toàn phần, gián tiếp, trực tiếp), AST, ALT, urê, creatinin
Các xét nghiệm trên được làm ít nhất 5 lần vào các thời điểm: trước điều trị, sau 2,
3, 4 tuần, sau 3 tháng điều trị
Các xét nghiệm trên làm tại khoa Huyết học và Hoá sinh Bệnh viện 103 Xét nghiệm các marker của HBV:
HBsAg: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dung Kit của hãng Sanofi trên nguyên lý “bánh kẹp” (Sandwich) Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm Huyết thanh BN
được coi là có HBsAg (+) khi có chỉ số OD > giá trị ngưỡng Tính nồng độ HBsAg
(ng/m)) trên máy theo sự thay đổi mật độ quang học Khi HBsAg < 5ng/ml coi như âm
tính
HBeAg: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit của hãng GBC
(General Biologicals Corp) trên nguyên lý “bánh kẹp” Kết quả được đọc ở bước sóng
492nm Huyết thanh BN được coi là có HBeAg (+) khi có chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Trang 34Anti-HBe: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit cba hang GBC trên
nguyên lý trung hoa (Neutralization Principle) Két qua được đọc ở bước sóng 492nm Huyết thanh BN được coi là có Anti-HBe (+) khi có chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Anti - HBs: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit của hãng GBC trên nguyên lý “bánh kẹp” Kết quả được đọc ở bước sóng 492nm Huyết thanh BN được coi là có Anti-HBs (+) khi có chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Anti-HBc-IgM: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit của hãng GBC
trên nguyên lý trung hoà (Neutralization Principle) Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm Huyết thanh BN được coi là có Anti-HBc-IgM (+) khi có chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Xét nghiệm HBV-DNA được thực hiện theo kỹ thuật Nested-PCR” cặp mồi của hãng Takara (Nhật Bản) sản xuất Nhận định kết quả bán định lượng theo các mức độ: < 5 copies/ml, 5 — 10 copies/mlva > 10 copies/ml
Các xét nghiệm Marker HBV và HBV-DNA được thực hiện tại Labo Vi sinh vật — Viện Vệ sinh phòng dịch Quân đội Các bệnh nhân đều được xét nghiệm hai lần: lần trước điều trị và sau điều trị (hết tháng thứ 3)
DJ Đánh giá kết quả:
- Lâm sàng: theo dõi diễn biến và thời gian hết các triệu chứng lâm sàng (như: mệt mỏi, chán ăn, rối loạn tiêu hoá, vàng da, nước tiểu sẵm màu, buồn nôn và nôn, đau tức hạ sườn phải, gan to )
- _ Cận lâm sàng: thời gian phục hồi các xét nghiệm hoá sinh về gan (Bilirubin huyết
thanh, Bilirubin niệu, AST, ALT) trở về Bình thường
- Đánh giá kết quả điều trị bằng so sánh thời gian mất các triệu chứng lâm sàng và phục hồi các xét nghiệm cận lâm sàng giữa Nhóm điều trị và Nhóm đối chứng càng ngắn càng tốt
Xét nghiệm Marker HBV và HBV-DNA, tuỳ theo mức độ: Tot it: giam néng d6 HBsAg va HBV-DNA
Tốt nhiều: chuyển đảo huyết thanh (đối với BN có HBeAg (+)
Rất tốt: HBV-DNA (-) có thể xuất hiện Anti HBs (+)
Trang 35- - Đánh giá tác dụng không mong muốn (tác dụng phụ): xuất hiện các triệu chứng bất thường trong và sau khi dùng thuốc có như: sốt, nhức đầu, mất ngủ, ỉa lỏng, ban
2.3.10 Xử lý kết quả nghiên cứu
Các kết quả nghiên cứu được tính theo giá trị trung bình + sai số chuẩn (M + SE) Riêng trong nghiên cứu lâm sàng được biểu thị bằng giá trị trung bình + độ lệch chuẩn (M+ SD) Đánh giá xác suất thống kê so sánh giữa hai số trung bình được tính theo test “t”
của Student đùng Microsoft — Excel
Trang 36Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 VỀ THỰC VẬT HỌC
Cây Phyllanthus amarus Schum et Thonn và cây Phyllanthus urinaria L là 2 cây
khác nhau, nhưng nhân dân ta vẫn gọi lẫn lộn là cây diệp hạ châu đắng hoặc chó đẻ răng
cưa Để dễ phân biệt, chúng tôi tạm gọi cây Phyllanthus amarus Schum et Thomn là cây điệp hạ châu đắng, còn cây Phyllanthus urinaria L là cây chó đẻ răng cưa hoặc gọi tắt là
cây chó đẻ Để phân biệt 2 cây này, nhằm tránh nhầm lẫn khi sử dụng, chúng tôi đã nghiên cứu về nhiều mặt
3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật
Quan sát trên thực địa, chúng tôi thấy:
3.1.1.1 Cây diệp hạ châu dang (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.)
Cay thảo, sống hàng năm, cao 40-80 cm, thân tròn, bóng, màu xanh, ít khi chia nhánh Lá nguyên, phiến lá hình bầu dục, dài 5-10 mm, rộng 3-6 mm, màu xanh sẫm ở trên, màu xanh nhạt ở dưới, xếp thành 2 dãy, có mũi nhọn, nhấn Mỗi cành nom như một
lá kép lông chim gồm nhiều lá chét Hoa đơn tính, ở nách lá màu lục nhạt, không có cánh
hoa Hoa đực có cuống ngắn 1-2 mm, đài 5, có tuyến mật; nhị 3, chỉ nhị dính nhau Hoa cái có cuống dài hơn hoa đực Quả nang nhấn, hình cầu, dẹp, nhắn, đường kính 1,8-2 mm, có đài tồn tại Hạt 6, hình tam giác, đường kính 1 mm, có sọc đọc ở lưng và lần ngang
Cây mọc hoang ở nhiều nơi (Hình 2a)
3.1.1.2 Cây chó để răng cua (Phyllanthus urinaria L.)
Trang 37Hình 1a: Cay cho dé rang cua (P amarus Schum.) Cay Diệp hạ châu ding i Hinh 1b: Sơ đồ tổng quát vi phẫu thân IP urinaria L Hinh 2b: Sơ đồ tổng quát vi phẫu
Trang 38nhạt, mặt dưới hơi mốc, cuống ngắn khoảng 2 mm Hoa đơn tính, mọc ở nách lá, không có cánh hoa; hoa đực ở ngọn cành, hoa cái ở gốc cành, tất cả hầu như không có cuống, hoặc
có cuống ngắn; đài 6, màu trắng; nhị 3, chỉ nhị dính nhau Hoa cái có 6 tuyến mật Quả
nang hơi đỏ, không cuống, hình cầu đường kính 2 - 2,5 mm, đính ở mặt dưới lá, có gai nhỏ, chứa 6 hạt hình tam giác, cao khoảng 1 mm, màu sôcôla nhạt Hạt có những vân `
ngang vuông góc với chiều dài hạt (Hình la)
Nhận xét: Những đặc điểm thực vật khác nhau quan trọng nhất là:
Đặc điểm P urinaria L P amarus Schum et Thonn Than Có màu nâu đỏ Than màu xanh
Thân hơi có cạnh Thân tròn bóng
Phân cành nhiều Ít phân cành
Lá Mật trên màu xanh Mặt trên màu xanh thãm Mặt dưới hơi mốc Mặt dưới màu xanh nhạt
Đài 6 5
Quả Có gai nhỏ Nhấn
Hạt Có vân ngang vuông góc Có sọc dọc ở lưng và lần ngang với chiều dài hạt
Trang 393.1.2 Đặc điểm vĩ phẫu thân của hai loài
Sau khi cất, tẩy, nhuộm kép, rồi quan sát dưới kính hiển vi, thấy các đặc điểm:
P urinaria (Hinh 1b, 1c) P amarus (Hinh 2b, 2c)
1 | Thân có các mô lồi Thân tròn đều
2 | Biểu bì gồm I hàng tế bào đều đặn | Biểu bì gồm 1 hàng tế bào đều đặn
3 Ì Sát biểu bì là mô dày gồm 2-3 hàng | Sát biểu bì là 2-3 hàng tế bào mô dày
tế bào
4 |Mô mêm vỏ gồm những tế bào tròn | Mọ mềm vỏ gồm những tế bào tròn
thành mỏng thành mỏng
5 Các bó sợi đều đạn Các bó sợi đều đặn
6 Vòng libe liên tục Vòng libe liên tục 2 Vòng gỗ liên tục, các mạch gỗ xếp Vòng gỗ liên tục, các mạch gỗ xếp thành hàng đều đặn, sát nhau thành hàng, hàng mạch gỗ to xếp cách nhau Mô mềm ruột gồm những tế bào to | Mô mềm ruột gồm những tế bào to 8 _ | hình tròn thành mỏng hình tròn thành mỏng
Nhận xét: Đặc điểm vi phẫu thân của 2 lồi khơng khác nhau nhiều, ngoại trừ ở
P.urinaria L có các mấu lồi và vòng gỗ gồm các mạch gỗ kích thước đều nhau, xếp thành
hàng sát nhau
Trang 40
Hình 3: Một số đặc điểm bột được liệu
Chó đẻ răng cưa ( P urinaria L.)
Hình 4: Một số đặc điểm bột dược liệu
Diệp hạ châu đắng (P amarus Schum.)