thiết lập qui trình Southern blot phần 2

thiết lập qui trình Southern blot phần 2

[...]... tiến hành lai) 3.3 .2. 9 Lai Southern * Thực hiện phản ứng lai Trước khi thực hiện phản ứng lai, xác lập nhiệt độ của buồng lai là 55oC, đồng thời làm nóng dung dịch đệm lai ở 55oC Song song đó, chúng tôi tính toán các thông số sau: Diện tích màng: 6 x 6 x 2 = 72 (cm2 ) Thể tích đệm lai: 0 .25 x 72 = 18 (ml) Nồng độ probe cần: 10 x 18 = 180 (ng) Thể tích probe: 180 / 10 =18 (µl) * Qui trình thực hiện phản... gian cho bước này là 15 phút Bước 2: Lai Trộn 8 ml dung dịch đệm lai với 18 µl probe, bơm hỗn hợp vào giữa ống lai (tránh nhỏ trực tiếp lên màng) Để phản ứng qua đêm ( 12 giờ) * Rửa màng sau khi lai Trước khi rửa màng cần làm nóng dung dịch rửa 1 (primary wash buffer) đến 55oC Thực hiện rửa màng theo các bước sau: 1 Loại bỏ dung dịch đệm lai, thêm vào ống lai khoảng 20 ml dung dịch rửa 1 Nhiệt độ và... như khi lai, thời gian rửa là 10 phút 2 Lặp lại bước trên cũng trong 10 phút 56 3 Loại bỏ dung dịch rửa 1, dùng kẹp gấp màng ra và cho vào hộp nhựa sạch với bề có DNA nằm trên Cho vào đó dung dịch rửa 2 (secondary wash buffer) khoảng 50 ml, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút 4 Lặp lại bước trên trong 10 phút Lúc này màng có thể được giữ trong dung dịch rửa 2 trong 30 phút để chuẩn bị cho bước phát... ray  Chuẩn bị màng với chất phát hiện CDP - Star Màng sau khi được rửa lần 2, sẽ được phủ lên trên một lớp dịch của chất phát hiện, chất này làm cho các phân tử probe phát sáng Các bước thực hiện như sau: 1 Dùng saran wrap trải trên một mặt phẳng nằm ngang, phẳng, có phủ một lớp khăn giấy 2 Lấy màng từ trong dung dịch rửa 2 ra, phải ráo và đặt lên trên miếng saran wrap với bề có DNA hướng lên trên... và đặt lên trên giấy lọc, giữa miếng gel và giấy lọc tránh có bọt khí 4 Đặt màng Hybond N có kích thước (6 cm x 6 cm) được làm ướt bằng SSC 2X lên trên miếng gel tránh để bọt khí 5 Đặt hai tấm giấy lọc có kích thước 6 cm x 6 cm được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X lên trên màng 6 Đặt một chồng giấy thấm có kích thước 6 Hình 3.5 Đánh dấu bề mặt chứa DNA của màng Hybond - N cm x 6 cm với độ cao vừa phải... thống được giữ qua đêm (16 giờ)  Làm khô màng Hình 3.6 Làm khô màng Hybond N bằng tủ sấy ở 65 oC Sau 16 giờ , chúng ta tiến hành làm khô màng theo cách sau: 1 Loại bỏ các thành phần ở trên cho đến khi tới màng thì dừng lại 2 Dùng kẹp giữ một góc màng và làm dấu bề mặt chứa DNA của màng (Hình 3.3) 3 Đặt màng vào trong tủ sấy, màng được ủ ở 65 oC trong khoảng 1 giờ cho đến khi các Hình 3.7 Để màng Hybond... wrap khác phủ bề mặt màng, trải đều chất phát hiện bằng que thủy tinh, tránh để lại bọt khí 5 Sau đó màng lai được lấy ra, và đặt ở giữa hai miếng saran wrap mới với kích thước phù hợp (chú ý trong quá trình thao tác với màng không để màng bị khô)  Ủ màng với phim trong cassette Màng được đặt giữa Cassette 30 x 40 Konica, sau đó đặt một tấm phim Konica 30 x 40 cm lên trên màng tránh sự dịch chuyển của 123doc.vn