thiết lập qui trình Southern blot phần 1

thiết lập qui trình Southern blot phần 1

[...]... bước sóng 312 nm hoặc xem qua máy chụp gel bằng phần mềm Quantity One 2000 (Bio - Rad) 2.8 .1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR Thành phần phản ứng DNA khuôn Nồng độ cuối Thể tích hút / 50 µl phản ứng 10 pg - 1 g tùy phản ứng 10 X PCR buffer 1X 5 µl dNTP mix 2mM 0,2 mM/mỗi loại 5 µl MgCl2 25mM 1 – 4 mM tùy phản ứng Primer 1 0 .1 – 1 µM tùy... độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng) 10 µg 10 00 bp 10 0 ng 10 00 bp 7 µg 700 bp 70 ng 700 bp 5 µg 500 bp 50 ng 500 bp 2 µg 200 bp 20 ng 200 bp 1 µg 10 0 bp 10 ng 10 0 bp Hình 2 .1 Thang chuẩn về nồng đô của phân tử Mass (Bio- Rad) 2,5 µl mẫu chuẩn được pha loãng với 10 µl loading buffer và TE được bơm vào gel agarose 1, 8 % Gel này được đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X Gel được ngâm trong 300... buffer cho vào cột, ly tâm 10 000 vòng / 1 phút trong 30 giây 7 Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1, 5 ml mới 19 8 Hút 50 µl elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút 9 Ly tâm tốc độ 10 000 vòng / 1 phút trong 1 phút, lấy cột GFX ra, thu lấy dung dịch DNA 2 .10 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN DNA LÊN MÀNG 2 .10 .1 Phƣơng pháp mao dẫn hƣớng lên (Upward Capillary Transfer) Sau quá trình điện di, những phân... eppendorf 1, 5 ml sạch 5 Cho 500 μl dung dịch rửa vào cột, sau đó ly tâm 10 000 vòng / 1 phút trong 30 giây Chuyển cột GFX vào eppendorf sạch 6 Hút 50 μl elution buffer cho vào cột, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 7 Ly tâm ở tốc độ 10 000 vòng / 1 phút trong 1 phút, thu lấy dung dịch DNA Qui trình tinh sạch DNA từ gel (Amersham) 1 Dùng dao cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào eppendorf 1, 5 ml... (bảng 2.3) 15 Bảng 2.3 Một số enzyme thƣờng sử dụng và các trình tự đặc hiệu Alu I Số vị trí cắt Ở thực Trình tự đặc hiệu Ở khuẩn pB 322 thể 1 AG  CT > 50 16 Arthrobacter luteus Bam HI G  GATCC 5 1 Bacillus Amuloliquefaciens H Bst I G  GATCC 5 1 Bacillus Amyloliquefaciens Eco RI G  ATTC 5 1 Escherichia coli RY13 Hae I A A ( T ) GG  CC ( T ) 7 7 Haemophilus aegyptius Hind III A  AGCTT 7 1 Haemophilus... của gen (Nguyễn Đình Huyên, 19 98) 2 .11 .1 Tác nhân đánh dấu Có hai hệ thống được dùng để đánh dấu probe là : hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ và hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000) 2 .11 .1. 1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ Phương pháp này rất phổ biến trong phân tích genome với RFLP trong những năm 19 80 và các năm đầu của thập niên 19 90 Probe nucleic acid có thể... gian chuyển kéo dài 12 giờ Ngoài ra, theo Sambrook và Russell (20 01) , quá trình chuyển lên màng gồm các bước sau: Biến tính gel bằng đệm biến tính (NaCl 1, 5 M, NaOH 0,5 M) Ngâm gel trong HCl 0,2 N Trung hòa gel bằng đệm trung tính I (Tris 1M (pH 7,4), NaCl 1, 5M) Trung hòa gel bằng đệm trung tính II (Tris-Cl 0,5M (pH 7,2), NaCl 1M) Thực hiện chuyển lên màng bằng đệm chuyển SSC 10 X 21 Do yêu cầu hóa chất... trồng bằng phương pháp PCR, trước tiên cần tìm một trình tự đặc hiệu của Pseudomonas spp Trình tự này phải hiện diện trên tất cả các Pseudomonas nhưng không có trên tất cả các loài vi sinh vật khác Từ trình tự này sẽ thiết lập một cặp primer đặc trưng cho Pseudomonas spp Qui trình phát hiện Pseudomonas spp sẽ được xây dựng với cặp primer được thiết kế 17 Trong khoá luận này, hai cặp primer đặc hiệu được... capture buffer theo mg / v (10 mg gel ≈ 10 µl capture buffer), đậy nắp eppendorf, vortex nhẹ, ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết 3 Sau khi agarose tan hoàn toàn, ly tâm tốc độ 10 000 vòng / 1 phút trong 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf 4 Hút mẫu cho vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút 5 Ly tâm 10 000 vòng / 1 phút trong 30 giây, lấy cột ra và đặt vào eppendorf 1, 5 ml mới 6 Hút 500 µl wash... nhiễm của DNA mà chọn lựa phương pháp thích hợp để tiến hành tinh sạch 2.9 .1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng phenol (Sambrook, 19 99) 1 Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1, 5ml 2 Dùng pipet hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24 :1) cho vào eppendorf chứa mẫu DNA 3 Lắc nhẹ bằng tay 10 giây Ly tâm 12 000 vòng /1phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng 4 Cẩn thận thu lấy dịch DNA nổi bên 123doc.vn