Thiết lập qui trình southern blot

Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB

Bộ mẫu Pseudomonas fluorescens được giữ - 70oC, do các anh chị trước đã phân lập và giữ nguồn Các dòng được chọn từ bộ mẫu này được đem ra rã đông và tăng sinh trên môi trường LB Phần sinh khối thu được dùng cho việc ly trích và giữ làm bộ mẫu nguồn riêng phục vụ cho việc thiết lập qui trình

Sử dụng micropipette 10 – 100 µl, hút 10 µl dịch khuẩn cho vào ống nghiệm đựng 5 ml môi trường LB đã hấp vô trùng, đậy lại bằng nút bông Các ống nghiệm này được gói lại thành bó và cho vào tủ lắc định ôn, nhiệt độ nuôi là 27oC, tốc độ lắc là 150 vòng / phút Sau 48 giờ tăng sinh, dịch khuẩn thu được đem đi ly tâm để thu sinh khối

3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens * Qui trình ly trích

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp tách chiết DNA theo phương pháp sử dụng CTAB / NaCl đã có cải tiến, qui trình thực hiện như sau:

1 Sử dụng sinh khối vi khuẩn đã được tăng sinh ở trên để tiến hành ly trích genomic DNA

2 Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4oC Rửa sinh khối thu được với 1 ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (3 lần)

3 Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10 % và đánh tan bằng vortex Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ

4 Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex

5 Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1 / 10 thể tích) Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút

6 Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24 : 1 ; v/v) Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 10 phút ở 12000 vòng/ 4oC

7 Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa ở tốc độ lớn hơn)

8 Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1; v/v) Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng/10 phút /4oC

9 Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl) Kết tủa DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích cùa dung dịch (khoảng 300 µl) và

C, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng/10 phút/4oC Đổ

cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi

11 Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE 1X, đem mẩu giữ ở tủ 4oC trong suốt thời gian thử nghiệm

* Kiểm tra kết quả ly trích genomic DNA Chuẩn bị gel agarose 0,8%

Cân 0,1 g agarose cho vào 12,5 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đem đun trong lò viba ở 650 W, 2 phút Để nguội, đổ vào khuôn có gắn lược với số giếng mong muốn Chờ gel đông (thường 30 phút), rút lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu

Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả

Hút 2 µl genomic DNA đã ly trích ở trên, trộn đều với 2 µl đệm tải mẫu (loading buffer) 6X, sau đó hút hỗn hợp dung dịch bơm vào giếng tương ứng với số mẫu đã xác lập trước của gel agarose 0,8 % Gel được đặt trong đệm TAE 0,5 X, hiệu điện thế 100 V, 250 mA và thời gian chạy là 15 phút Sau đó, gel được lấy ra và nhuộm trong ethidium bromide 10 phút, rửa sạch và xem kết quả ly trích bằng máy Gel Doc 2000, sử dụng phần mềm Quatity One 2000 (Bio - Rad)

3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass * Hiệu chỉnh nồng độ

Từ các mẫu DNA đã được ly trích, chọn một mẫu DNA có nồng độ loãng nhất trong các mẫu còn lại dựa trên kết quả kiểm tra sản phẩm ly trích genomic DNA bằng điện di làm mẫu chuẩn Cũng từ đó, ta tính được số lần cần pha loãng của các mẫu có nồng độ cao so với mẫu chọn làm chuẩn

Mẫu được chọn làm chuẩn phải có nồng độ sử dụng được, không nên quá loãng, vì như thế sẽ gây khó khăn trong quá trình tiến hành các thử nghiệm đòi hỏi phải sử dụng nồng độ DNA tương đối lớn như thực hiện phản ứng cắt genomic DNA

* Định lượng DNA bằng phân tử Mass Chuẩn bị gel agarose 2%

Cân 0,2 g agarose cho thêm vào 10 ml TAE 0,5X, lắc cho agarose phân tán đều, đem đun trong lò viba ở 500 W, cứ mỗi phút đem ra xem agarose tan hoàn toàn chưa Khi agarose thật sự tan hết trong TAE, để nguội, đổ vào khuôn với lược 6 giếng Chờ gel đông khoảng 30 phút, sau đó tiến hành nạp mẫu

Thiết lập phương pháp định lượng bằng phân tử Mass

Giếng đầu tiên và giếng cuối cùng sử dụng Mass, các giếng còn lại theo thứ tự sử dụng một mẫu genomic DNA bất kì đã hiệu chỉnh nồng độ được pha loãng theo cách sau:

4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 4 µl nước cất hai lần vô trùng 4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 8 µl nước cất hai lần vô trùng 4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 12 µl nước cất hai lần vô trùng 4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 16 µl nước cất hai lần vô trùng 4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 20 µl nước cất hai lần vô trùng 4 µl DNA đã hiệu chỉnh nồng độ + 24 µl nước cất hai lần vô trùng

Nạp mẫu, xác lập các thông số điện di và đọc kết quả

Giếng 1: hút 2 µl phân tử Mass, trộn đều với 2 µl loading dye 6X, hút hỗn hợp

dung dịch bơm vào giếng 1

Giếng 2: hút 1 µl phân tử Mass, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, hút hỗn hợp

dung dịch bơm vào giếng cuối cùng

Các giếng còn lại theo thứ tự là mẫu DNA gốc trước khi pha loãng, kế đến là các mẫu pha loãng 1 lần, 2 lần, 3 lần, 4 lần , 5 lần , 6 lần, 7 lần, 8 lần với thể tích như sau: 2 µl mẫu + 2 µl loading buffer, trộn đều và bơm vào với giếng tương ứng

Điều kiện chạy trong đệm TAE 0,5X, ở hiệu điện thế 70 V trong 60 phút Sau đó, gel được nhuộm ethidium bromide trong 15 phút và đem ra rửa thật kỹ bằng nước sạch Đọc gel bằng máy Gel Doc 2000 và phân tích kết quả

3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn * Thiết lập phản ứng

Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamH I, Eco RV và Hind III để cắt genomic DNA,

chúng tôi đã thiết lập phản ứng cắt ở hai thể tích khác nhau 25 µl và 50 µl như sau:

Phản ứng được ủ ở 37oC trong 2 giờ

Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.1 được thực hiện theo khuyến cáo chỉ dẫn của nhà sản xuất

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl

10X đệm BamH I 10X đệm Eco RV 10X đệm Hind III 5 µl Enzyme BamH I Enzyme Eco RV Enzyme Hind III 1 µl

Phản ứng được ủ ở 37oC qua đêm

Thể tích các thành phần phản ứng cắt ở bảng 3.2 đã được thay đổi

Các thành phần trên đã được khảo sát và hiệu chỉnh cho phản ứng cắt tốt nhất

* Trộn phản ứng cắt

Đầu tiên cần xác định lượng sản phẩm cắt cần sử dụng, tính toán thể tích hút, số phản ứng và điều chỉnh nhiệt độ ủ ở bồn ủ water bath Thông thường, người ta hay trộn các thành phần chung trong một hỗn hợp rồi mới phân chia thành các phản ứng riêng lẻ Tiến hành trộn phản ứng cắt theo thứ tự sau:

- Hút nước

- Hút dung dịch đệm của enzyme - Hút enzyme

- Trộn các thành phần trên thật nhẹ và đều, phân chia ra các eppendorf dùng để thực hiện phản ứng cắt

- Bơm mẫu DNA vào các eppendorf đã trộn ở trên, đậy nắp kỹ và đem đi ủ ở nhiệt độ thích hợp

* Kiểm tra kết quả phản ứng cắt Bố trí mẫu

Bố trí giống như phương pháp định lượng DNA bằng phân tử Mass, giếng đầu tiên và giếng cuối cùng là genomic DNA lúc chưa thực hiện phản ứng cắt, các giếng còn lại là sản phẩm cắt của các mẫu Cũng có thể bố trí theo kiểu xen kẻ, liên tiếp nhau mẫu DNA chưa cắt, đến mẫu sản phẩm cắt

Nạp mẫu, chạy điện di, đọc kết quả

Hút 4 µl mẫu, trộn đều với 2 µl loading buffer 6X, bơm vào giếng tương ứng đã bố trí Thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế 50 V trong 90 phút Xem kết quả cắt bằng cách nhuộm gel trong ethidium bromide 10 phút, rửa sạch và đọc kết quả bằng phần mềm Quatity One của máy Gel Doc 2000 (Bio- Rad)

3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen phlD trên hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b

Trong vi khuẩn có lợi, gen mã hóa các đặc tính thường là một tổ hợp các gen có chức năng khác nhau, trong đó một số gen đóng vai trò quan trọng trong quá trình mã hóa các chất kháng sinh chính và một số gen có vai trò mã hóa các chất phụ như là các chất xúc tác phản ứng tổng hợp chất kháng sinh chính

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các kết quả nghiên cứu đã được công bố để thiết lập các primer chuyên biệt dùng để phát hiện các gen mã hóa các chất kháng

sinh và dùng dòng vi khuẩn P fluorescens 2P24 cung cấp bởi tiến sỹ Zhang, Liqui Đại

học Nông Nghiệp Bắc Kinh, Trung Quốc làm dòng vi khuẩn đối chứng

- Cặp primer ngoài: Khuếch đại trình tự 745 bp

Phl - 2a: GAGGACGTCGAAGACCACCA Phl - 2b: ACCGCAGCATCGTGTATGAG

- Cặp primer trong: Khuếch đại trình tự 629 bp

B2BF: ACCCACCGCAGCATCGTTTATGAGC BRR4: CGCCGGTATGGAAGATGAAAAAGTC

Trình tự primer được thiết kế trên gen phlD

H2O 16,15 µl Tổng thể tích 25 µl

Các thành phần trên đã được khảo sát và làm tối ưu các điều kiện để tạo ra kết quả ổn định và lượng sản phẩm khuếch đại thu được nhiều

Hình 3.2 Tổ hợp 6 gen sinh tổng hợp chất 2,4 – DAPG

Trong đó gen phlD tổng hợp monoacetylphloroglucinol (MAPG) và các gen phlA, phlC, phlB cần thiết cho quá trình chuyển đổi MAPG thành DAPG Sử dụng cặp primer Phl2a và Phl2b phát hiện 2,4 – DAPG

* Chương trình khuếch đại PCR

Thực hiện theo các bước sau: Biến tính hoàn toàn DNA khuôn ở 94oC trong 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ với các bước: biến tính ở 94oC trong 1 phút, bắt cặp giữa primer và khuôn ở 56oC trong 45 giây, kéo dài sợi DNA ở 72oC trong 1 phút Sau khi kết thúc các chu kỳ, mẫu được giữ ở 72oC trong 10 phút để Taq DNA polymerase tổng hợp

hoàn chỉnh các đoạn còn dang dở Giữ mẫu ở 4oC cho đến khi phân tích

* Điện di và phân tích kết quả

Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên gel agarose 0,8 % Quá trình thực hiện như sau: 4 µl sản phẩm khuếch đại được nhuộm với 2µl đệm tải mẫu (loading buffer), trộn thật đều và bơm hỗn hợp vào giếng trên gel Quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế 100 V, 250 mA trong 20 phút Nhuộm gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 – 10 phút, rửa thật kỹ bằng nước sạch, đem đọc kết quả trong hệ thống máy GELDOC 2000 (Bio - Rad)

Mẫu được coi là dương tính khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại với kích thước 745 bp với cặp primer phl – 2a, phl – 2b và 629 bp với cặp primer B2BF, BRR4; Mẫu được coi là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm không có kích thước tương ứng như trên

3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel * Qui trình thực hiện

1 Mẫu cần được tinh sạch (thường là sản phẩm PCR) được đem chạy điện di trên gel agarose 0,8 % tan ở nhiệt độ thấp Gel sau khi chạy điện di, được nhuộm ngắn (1 - 2 phút) trong ethidium bromide nồng độ thấp, sau đó rửa gel bằng nước sạch và rửa lại bằng nước cất vô trùng, gel được đặt trên máy chiếu UV đã được bọc kỹ bằng saran wrap và phủ lên trên bởi giấy bạc được cắt một lổ có kích thước bằng miếng gel

2 Bật UV, định vị band cần lấy, dùng dao lam cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào eppendorf 1,5 ml Sử dụng cân phân tích để xác định trọng lượng gel chứa band vừa cắt ở trên

3 Dùng micropipette hút capture buffer theo mg/v (10 mg gel ≈ 10 µl capture buffer), đậy nắp eppendorf đem ủ ở 60oC trong 5 phút, lấy ra vortex nhẹ và tiếp tục ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 - 15 phút)

4 Đem ly tâm 3000 vòng / 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf

5 Hút mẫu cho vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút 6 Đem ly tâm 10000 vòng / 30 giây

7 Cho thêm vào cột 500 µl wash buffer, ly tâm 10000 vòng / 30 giây 8 Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1,5 ml mới

9 Hút 20 µl elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

10 Ly tâm 10000 vòng / 1 phút, lấy cột GFX ra, đậy nắp eppendorf và đem mẫu giữ ở 4o

C

Những điều cần lưu ý khi tinh sạch sản phẩm từ gel

- Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một

- Khi rửa cột bằng wash buffer hoặc khi thêm capture buffer phải nhỏ từ từ trên thành của cột

- Cân eppendorf trước khi tiến hành cắt gel - Sử dụng low melting agar

- Sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết

- Máy điện di cần được rửa sạch trước khi sử dụng - Bảng gel cần được rửa sạch bằng nước cất vô trùng

- Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thường dùng (15 µl ethidium bromide + 300 ml TAE 0,5), phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẫu Thời gian nhuộm mẫu ngắn

- Thời gian mẫu tiếp xúc dưới tia UV trong quá trình cắt ngắn (< 40 giây)

3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4

Chúng tôi sử dụng sản phẩm PCR đã được tinh sạch có trình tự là 629 bp để tạo probe, trình tự này là sản phẩm khuếch đại của cặp primer trong B2BF và BRR4 Trước khi thực hiện phản ứng đánh dấu cần phải pha loãng dung dịch cross - linker thành dung dịch có nồng độ sử dụng, dung dịch này có thể bảo quản lạnh 2 – 8oC trong một tuần Bên cạnh đó, DNA cũng cần phải được pha loãng với nước tới nồng độ 10 ng / µl dùng để đánh dấu (nồng độ muối trong mẫu DNA nên được giữ ở mức thấp nhất, không quá 50 mM) Thực hiện phản ứng đánh dấu theo kit của Amersham gồm các bước như sau:

1 Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl và làm biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh

2 Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc độ 4000 vòng/30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống

3 Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào DNA đã được làm lạnh Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá

4 Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều 5 Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross - linker Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng / 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy

6 Ủ 30 phút ở 37oC cho phản ứng xảy ra

7 Probe có thể được dùng ngay hoặc giữ trên đá đến 2 giờ Trong trường hợp muốn bảo quản lâu hơn, probe đã đánh dấu được giữ trong 50 % glycerol ở - 15o

C đến - 30oC trong 6 tháng (không cần xử lý gì thêm dung dịch probe này sau khi bảo quản)

3.3.2.8 Tạo mẫu lai

* Điện di sản phẩm cắt DNA bằng enzyme giới hạn

Chúng tôi thực hiện điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 0,5X, với kích thước gel 6 cm x 6 cm, gel được gắn lược 6 giếng, thực hiện bố trí như sau:

Giếng 1: Hút 4 µl 100 bp PCR Molecular Ruler (Bio - Rad) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng

Giếng 2: Hút 4 µl sản phẩm PCR dùng tạo probe sử dụng như một đối chứng dương + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng

Giếng 3, 4, 5, 6: Hút 18 µl mẫu (sản phẩm của enzyme cắt) + 2 µl loading buffer, trộn đều trước khi bơm vào giếng

Tiến hành điện di ở hiệu điện thế là 50 V, trong 90 phút Sau đó, gel được đem nhuộm ngắn trong ethidium bromide trong 1 - 2 phút, rửa sạch và chụp gel lấy lại hình ảnh để biện luận kết quả Miếng gel đó sẽ được làm biến tính trước khi chuyển lên màng (chú ý miếng gel trước khi chuyển lên màng không nên để lâu trong không khí vì như thế sẽ làm cho bề mặt miếng gel bị khô và ảnh hưởng không tốt đến quá trình chuyển lên màng Thời gian giữ gel là 15 - 30 phút khi nó được ngâm trong dung dịch đệm)

* Chuyển DNA từ gel lên màng bằng hiện tượng mao dẫn hướng lên  Làm biến tính gel trước khi chuyển lên màng

Sau khi hoàn thành giai đoạn điện di, gel được giữ trong dung dịch đệm TAE 0,5X Chúng tôi thực hiện biến tính gel như sau:

1 Đổ bỏ đệm TAE 0,5X, rửa lại miếng gel bằng nước cất và đổ bỏ phần nước rửa 2 Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm biến tính (NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M), phải xem kỹ đảm bảo rằng miếng gel đã được phủ hoàn toàn bởi dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ

bỏ phần dung dịch đó đi 3 Lặp lại bước trên

4 Rửa lại gel bằng nước cất vô trùng, đổ bỏ phần nước rửa

5 Đổ vào khoảng 150 ml dung dịch đệm trung tính (Tris – HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0), miếng gel cũng phải được ngấm hoàn toàn trong dung dịch, đem lắc nhẹ 15 phút ở nhiệt độ phòng, đổ bỏ phần dung dịch đó đi

6 Lặp lại bước trên

Trong thời gian này chuẩn bị màng, dung dịch chuyển, giấy thấm, hệ thống mao dẫn và các dụng cụ cần thiết khác

 Thực hiện chuyển lên màng bằng phương pháp mao dẫn (thiết bị chuyển

lên màng đã được cải tiến)

Khi đã hoàn thành giai đoạn biến tính, tiến hành chuyển lên màng theo các bước sau:

1 Dùng hộp nhựa hình chủ nhật (20 cm x 10 cm) có chứa 250 ml đệm SSC 6X, phía trên có đặt một tấm mica (12 cm x 11,5 cm) làm bệ của hệ thống mao dẫn 2 Cắt một tấm giấy lọc có kích thước phù hợp (17 cm x 8 cm) được làm ướt bằng dung dịch SSC 2X, phủ đều trên tấm mica (tránh có bọt khí, nếu có bọt khí dùng

Hình 3.3 Hệ thống mao dẫn chuyển DNA lên màng Hybond N chưa hoàn chỉnh

Hình 3.4 Hệ thống chuyển DNA lên

màng Hybond N hoàn chỉnh