Thiết lập qui trình southern blot 3

Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ TĂNG SINH , LY TRÍCH, VÀ ĐỊNH LƯỢNG GENOMIC DNA 4.1.1 Kết quả tăng sinh và ly trích

Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được tăng sinh trên môi trường LB

48 giờ ở 27oC Sau 48 giờ nuôi cấy, các dòng đều cho sinh khối Chúng tôi đã ly trích được 34 dòng (phụ lục) trong tổng số 51 dòng từ bộ mẫu (phụ lục)

Hình 4 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ

nuôi cấy trên môi trường LB ở nhiệt độ 27o

C

Kết quả điện di (hình 4.1) cho thấy, hai mẫu 18, 128 không thu được DNA Các mẫu 23, 65, 149, 154, 121, 123,127, 150 cho sản phẩm DNA tổng số ít lẫn tạp chất Các mẫu 28, 129, 70 có sản phẩm DNA còn lẫn nhiều tạp chất Các vệt sáng kéo dài phía dưới DNA tổng số có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy Lỗi này có thể do thao tác, khi thu phần dịch nổi chứa DNA , chúng tôi đã hút lẫn phần cặn bên dưới, hoặc do thao tác quá mạnh nên làm đứt gãy DNA Mặt khác, trong qui trình này chúng tôi không sử dụng men RNAse và protein K để loại bỏ các phân tử RNA và protein còn lẫn tạp trong mẫu Tuy nhiên, do yêu cầu sử dụng mẫu DNA ly trích không cần đạt độ tinh khiết cao, vì thế với kết quả có được vẫn đảm bảo điều kiện để chúng tôi thiết lập qui trình Từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình ly trích:

70 121 123 127 128 150 154 23 28 65 67 18 129 149 154

- Dụng cụ ly trích cần khử trùng cẩn thận để phòng ngừa sự tạp nhiễm

- Mang bao tay, khử trùng tay cẩn thận bằng cồn 70 % trước khi tiến hành ly trích - Bước thu sinh khối vi khuẩn rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm giữa các mẫu với nhau, nên khử trùng tay cẩn thận khi thực hiện với những mẫu khác nhau

- Thao tác nhẹ nhàng trong khi ly trích, thao tác mạnh có thể làm đứt gãy DNA - Thu dung dịch DNA chỉ hút phần dịch nổi, không nên hút lẫn phần cặn phía dưới - DNA phải được làm khô hoàn toàn trước khi hòa tan với TE

- Eppendorf chứa mẫu DNA phải sạch

- Hóa chất ly trích như: phenol / chloroform / isoamyl alcohol; CTAB có khả năng gây độc cho người sử dụng, khi sử dụng và pha chế phải thực hiện trong buồng hút - Khi nhuộm gel và đọc kết quả ly trích, không được tiếp xúc trực tiếp ethidium bromide và tia UV

4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ

Từ kết quả ly trích, chúng tôi có được các mẫu DNA với nồng độ khác nhau Sau khi hiệu chỉnh nồng độ, chúng tôi có được độ tương đồng về nồng độ giữa các mẫu (hình 4.2)

Để có được kết quả này, chúng tôi đã thực hiện nhiều thí nghiệm pha loãng dựa trên một mẫu làm chuẩn Mẫu chuẩn cũng là mẫu gốc ly trích được có nồng độ loãng

Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng

Pseudomonas fluorescens khác nhau

hơn các mẫu còn lại Mẫu làm chuẩn phải có nồng độ thực nghiệm, nghĩa là có thể tiến hành các phân tích tiếp theo, không nên có nồng độ quá loãng

4.1.3 Kết quả định lƣợng bằng phân tử Mass

Chúng tôi sử dụng mẫu 130 làm mẫu đại diện để định lượng

Mẫu 130 sau khi được pha loãng 8 lần có độ sáng của band sau khi điện di tương đồng với band 200 bp của phân tử Mass (hình 4.3) Theo chuẩn của phân tử Mass, thì band 200 bp có nồng độ tương đương là 20 (ng / µl) Vậy mẫu 130 đạt được nồng độ tương đương 20 ng / µl sau khi đã thực hiện pha loãng 8 lần Từ đây tính được nồng độ mẫu 130 trước khi pha loãng là 160 (ng / µl) Như vậy, các mẫu genomic DNA sau khi hiệu chỉnh đạt nồng độ tương đương 160 (ng / µl)

4.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT DNA GENOMIC BẰNG ENZYME GIỚI HẠN

Trong 34 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ly trích được, chúng tôi chọn ra

các mẫu số 4, 16, 28, 67, 73, 123, 124, 127, 130, 152, 154 để thực hiện phản ứng cắt, nhằm chuẩn bị mẫu lai cho quá trình lai

M 130(1) 130(2) 130(3) 130(4) M M 130(5) 130(6) 130(7) 130(8) M

Hình 4.3 Kết quả định lƣợng mẫu 130 bằng phân tử Mass (M: phân tử Mass)

a)Mẫu 130(1); 130(2); 130(3); 130(4) được pha loãng 1 lần; 2 lần; 3 lần; 4 lần b) Mẫu 130(5); 130(7); 130(7); 130(8) được pha loãng5 lần; 6 lần; 7 lần; 8 lần

1000 bp 700 bp 500 bp 200 bp 100 bp

Kết quả ở hình 4.4a, mẫu số 4 cho phản ứng cắt hoàn toàn so với mẫu DNA tổng số chưa cắt (giếng 1 và 3 hình 4.4a), còn mẫu 130 chỉ cắt một phần, vẫn còn band genomic DNA rất đậm Đối với hình 4.4b, mẫu 123 và 124 được cắt với ba enzyme

BamH I, Eco RV và Hind III, cả hai mẫu đều bị cắt vụn, tạo nên những phân tử có

Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn

a) DNA mẫu số 4, 130 được cắt bằng BamH I và Eco RV; G: mẫu genomic DNA b) DNA mẫu số 123, 124 được cắt bằng 3 enzyme BamH I, Eco RV và Hind III c) DNA mẫu số 4, 154 được cắt bằng 3 enzyme BamH I, Eco RV và Hind III d)DNA mẫu số130, 28, 152 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV

G G

trọng lượng thấp gần tương đương nhau dồn xuống đáy, hình thành nên một band đậm sau khi chạy điện di Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai

Những mẫu sản phẩm cắt có thể được dùng chuyển lên màng tạo mẫu lai là các mẫu 4, 154, 130, 28, 152 ở hình 4.4c và hình 4.4d Tuy nhiên, những mẫu ở hình 4.4d có nồng độ mẫu quá thấp và không đều nhau, do đó cần phải tính toán lượng mẫu sao cho phù hợp trước khi chuyển lên màng

Khi sử dụng từng enzyme giới hạn, cần có các điều kiện nhiệt độ, độ pH và dung dịch đệm thích hợp Nếu mẫu được cắt với nhiều loại enzyme khác nhau và có cùng dung dịch đệm thì lần lượt thực hiện phản ứng cắt ở từng enzyme đơn ở nhiệt độ thích hợp, sau đó làm bất hoạt enzyme đó và thực hiện phản ứng cắt cho enzyme kế tiếp Nếu các enzyme sử dụng không cùng dung dịch đệm thì phản ứng cắt sẽ phức tạp hơn Nhiệt độ phản ứng cắt phải luôn luôn ổn định, tránh có sự dao động lớn, nên ủ phản ứng trong bồn ổn nhiệt có nắp đậy Bảo quản enzyme ở - 20oC

4.3 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VỚI HAI CẶP PRIMER B2BF, BRR4 VÀ Phl - 2a, Phl - 2b

Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 cặp primer B2BF, BRR4 và ph l- 2a, ph l- 2b

a) Sản phẩm PCR của các mẫu số 4, 28, 129, 130 với cặp primer B2BF, BRR4; L: Ladder (thang chuẩn 1000 bp)

b) Sản phẩm PCR của các mẫu 130, 129, 121, 4, 28 với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl - 2a, ph l- 2b

Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR trên các dòng số 4 (2P24), 28, 129, 130,121, 124 và 154 với cặp primer B2BF, BRR4 Kết quả là đã khuếch đại được trình tự đoạn

DNA có chiều dài 629 bp chuyên biệt trên gene phlD (hình 4.5a) Sản phẩm PCR xuất

hiện các band phụ phía dưới sản phẩm chính Điều này chứng tỏ các thành phần tham gia phản ứng như dNTP, primer chưa phản ứng hết

Với cặp primer phl - 2a và phl - 2b, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR trên hai dòng số 4 và 28 Kết quả đã khuếch đại được trình tự là 745 bp trên gene phlD (hình

4.5b), nhưng trong sản phẩm khuếch đại còn tồn tại nhiều band tạp Do đó trong quá trình khuếch đại chưa tạo ra được sản phẩm chuyên biệt Sản phẩm PCR cần được tinh sạch để thực hiện phản ứng đánh dấu, chuẩn bị probe cho quá trình lai

4.4 KẾT QUẢ TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẮT GEL

Sử dụng sản phẩm khuếch đại của cặp primer B2BF, BRR4 đem tinh sạch và làm probe đánh dấu

Kết quả tinh sạch trên các dòng 4, 28, 129, 130, 154 đạt độ tinh khiết cao (Hình 4.6) Chúng tôi chọn dòng số 4 để thực hiện phản ứng đánh dấu, kết quả đánh dấu sẽ được thể hiện trên kết quả lai

Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28, 130, 129, 154 bằng phương pháp cắt gel

sản phẩm PCR trước khi tinh sạch

M 4 28 129 130 154 M

sản phẩm PCR sau khi tinh sạch

629 bp

4.5 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG LAI

Mẫu DNA tổng số cắt bằng enzyme giới hạn được dùng làm mẫu lai Sản phẩm PCR được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai Chúng tôi đã thiết lập phản ứng lai ở nhiệt độ, thời gian lai và thời gian ủ phát hiện khác nhau Probe đánh dấu sử

dụng cho phản ứng lai có chiều dài 629 bp Thí nghiệm 1: Lai ở 55o

C, thời gian lai là 12 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút

Hai mẫu 4 và 154 được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai

Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương Kết quả lần phát hiện đầu tiên ở thí nghiệm này không có sản phẩm lai, nền phim bị đen hoàn toàn Chúng tôi thực hiện lại bước ủ phim (dùng tấm phim mới) với màng lai 1 giờ, sau đó rửa phim và phát hiện Kết quả vẫn không phát hiện sản phẩm lai, nền phim vẫn bị đen hoàn toàn Nguyên nhân nền phim bị đen có thể do buồng tối và dung dịch rửa phim chưa đạt yêu cầu Chúng tôi tiến hành thiết kế lại buồng tối, pha dung dịch rửa phim mới để thực hiện lại thí nghiệm này Màng lai có chứa DNA được bảo quản trong tối

Chúng tôi thực hiện lại bước phát hiện, tác nhân phát hiện được cho trực tiếp lên màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ màng lai với phim trong thời gian 30 phút Rửa phim với dung dịch rửa phim mới Kết quả phát hiện được thể hiện trong hình 4.7 b

Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa (hình 4.7 b) Đây là kết quả của sự bắt cặp giữa probe đánh dấu với sản phẩm PCR Các mẫu 4, 154 được cắt bằng 2

enzyme BamH I và Eco RV thì sự bắt cặp với probe không xảy ra Kết quả này chứng

minh được với nhiệt độ lai là 55oC, thời gian lai là 12 giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu Tuy nhiên, các mẫu 4, 154 sử dụng làm thí nghiệm thì không có hiện tượng bắt cặp Vì vậy trong thí nghiệm 1, chúng tôi tạo một mẫu lai mới để kiểm tra lại qui trình và hoạt động của probe đánh dấu Mẫu 16, 28 được cắt bằng 2 enzyme

BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương

Kết quả trên hình 4.8b cho thấy chỉ có sản phẩm PCR mới cho kết quả lai, các mẫu 16, 128 không cho sản phẩm lai Với kết quả này, có thể khẳng định rằng qui trình lai đã ổn định, probe hoạt động rất hiệu quả Tuy nhiên, các mẫu 4, 154, 16, 28 dùng làm thí nghiệm cho kết quả lai âm tính Điều này có thể do các nguyên nhân:

Hình 4.7 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút

a)Điện di trước khi chuyển lên màng Thang chuẩn M 1000 bp, sản phẩm PCR mẫu số 4 với cặp primer B2BF, BRR4 làm đối chứng dương Mẫu số 4, 154 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV làm mẫu lai

b) Kết quả lai với probe đánh dấu, sản phẩm PCR cho kết quả dương tính, các mẫu lai 4, 154 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV cho kết quả âm tính

Hình 4.8 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút

a) Điện di trước khi chuyển lên màng Thang chuẩn M 1000 bp, sản phẩm PCR mẩu số 4 với cặp primer B2BF, BRR4 làm đối chứng dương Mẫu số16, 128 được cắt bằng 2 enzym BamH I và Eco RV làm mẫu lai

b) Kết quả lai với probe đánh dấu, mẫu đối chứng dương cho kết quả dương tính, mẫu lai 16, 128 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV cho kết quả âm tính

- Phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn chưa hoàn chỉnh

M PCR 4(BamH I)

154(Eco RV) 154(BamH I) E4(Eco RV)

28(Eco RV)

M PCR 16(B) 16 (E) 28 (B) 28 (E)

sản phẩm lai

- Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn

- Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát hiện được - Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa

Thí nghiệm 2: Lai ở 55oC, thời gian lai 16 giờ, thời gian ủ 30 phút và 2 giờ

Chúng tôi đã tạo ba mẫu lai mới, các mẫu 4, 73, 127 được cắt bằng ba enzyme

BamH I, Eco RV và Hind III độc lập với nhau Sản phẩm PCR làm đối chứng dương,

hai đối chứng âm là sản phẩm ly trích từ một dòng vi khuẩn khác và một mẫu nấm,

hai mẫu này được cắt bằng enzyme BamH I

Kết quả thu được sau thời gian ủ phát hiện 30 phút (hình 4.9 b), sản phẩm lai thể hiện trên phim cũng chỉ là những mẫu PCR được sử dụng làm probe, còn những mẫu 4, 73, 127 vẫn không có tín hiệu lai So với thí nghiệm 1 nền phim xuất hiện những đốm đen nhiều hơn, lỗi này có thể do thời gian lai kéo dài, màng rửa chưa sạch hoặc màng lai bị tạp nhiễm Tuy nhiên, với thời gian ủ phát hiện 30 phút, sản phẩm lai có màu nhạt hơn sản phẩm lai ở thí nghiệm 1, rất có thể lượng probe đánh dấu cho vào phản ứng lai hoặc thời gian để tạo nên những phân tử phát sáng chưa đủ Do đó, để xác định rõ nguyên nhân không có sản phẩm lai trên mẫu genomic DNA dùng làm thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành ủ màng với phim trong 2 giờ, sau đó rửa phim và phát hiện kết quả hình 4.9c

Kết quả thu được sau thời gian ủ 2 giờ (hình 4.9 c), không có gì khác biệt so với thời gian ủ 30 phút Chỉ có sự khác biệt là những band thể hiện trên phim đậm hơn rất nhiều và các đốm tạp cũng xuất hiện nhiều hơn so với thời gian ủ 30 phút

Như vậy, có thể kết luận rằng, lượng probe đánh dấu cho vào phản ứng lai và thời gian ủ 30 phút là đủ để phát hiện sản phẩm lai Vấn đề đặt ra, với nhiệt độ lai là 55oC thì sự bắt cặp giữa probe và trình tự DNA mục tiêu đã ổn định chưa ? Chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3 với nhiệt độ lai là 48oC (thay vì là 55oC như ban đầu)

Thí nghiệm 3: lai ở 48oC, thời gian lai 16 giờ, thời gian ủ phát hiện 1 giờ

Để giảm bớt thời gian cho việc chuẩn bị mẫu lai mới, chúng tôi đã sử dụng lại màng lai ở thí nghiệm 2 Các phân tử probe đánh dấu được loại bỏ trước khi thực hiện

Hình 4.9 Kết quả lai ở thí nghiệm 2

a) Sản phẩm điện di trước khi chuyển lên màng; b) Kết quả lai ở 55oC, khi ủ 30 phút; c) Kết quả lai ở 55oC, khi ủ 2 giờ; (M)DNA marker; (1,6,11) sản phẩm PCR; (2) sản phẩm PCR được cắt bởi BamH I; (3, 4, 5) mẫu được cắt lần lượt bởi các enzyme BamH I, Eco RV, Hind III; ( 7, 8, 9) mẫu 73 được cắt lần lượt bởi các enzyme BamH I, Eco RV, Hind III; (10) mẫu nấm được cắt bằng BamH I; (12, 13, 14) mẫu 127 được cắt lần lượt bởi các enzyme BamH I, Eco RV, Hind III; (15) mẫu vi khuẩn được cắt bằng BamH I

PCR(B)

4(BamH I) 4(Eco RV)

4(Hind III)

M PCR

73(BamH I) 73(Eco RV)

Nấm (BamH I) 73(Hind III)

M PCR

127(BamH I) 127(Eco RV)

127(Hind III) Vi Khuẩn(BamHI)

M PCR

73(BamH I) 73(Eco RV)

Nấm (BamH I) 73(Hind III)

M PCR

127(BamH I) 127(Eco RV)

127(Hind III) Vi Khuẩn(BamHI)

PCR M

PCR(B)

4(BamH I) 4(Eco RV)

4(Hind III)

phản ứng lai Các bước thực hiện loại bỏ probe như sau: ủ màng với dung dịch SDS 0,5 % (w/v) ở nhiệt độ 60oC trong 1 giờ; rửa màng bằng Tris 100 mM (pH 8,0) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng; đem màng đi làm khô và cross - linker để chuẩn bị cho việc lai

Kết quả lai ở 48o

C (Hình 4.10) sự bắt cặp giữa probe và trình tự DNA mục tiêu vẫn xảy ra, sản phẩm PCR vẫn cho kết quả dương tính, các mẫu 4, 73, 127 cho kết quả lai âm tính So với ủ 2 giờ, các đốm tạp trên nền phim giảm xuống khi ủ 1 giờ

Hình 4.10 Kết quả lai ở nhiệt độ 48oC * Những điều cần lưu ý khi thực hiện chuyển DNA đến màng lai

1 Mang bao tay không phấn, sử dụng kẹp không răng khi thao tác với màng lai 2 Kích thước màng lai, giấy thấm phải bằng với kích thước gel

3 Màng phải được làm ướt hoàn toàn trước khi đặt lên trên gel, giữa màng lai và gel không để có bọt khí

4 Chồng giấy thấm phía trên phải được đặt cân bằng 5 Cắt một góc màng để đánh dấu mặt có DNA

6 Làm khô màng hoàn toàn trước khi chiếu dưới tia UV, màng có thể được làm khô ở nhiệt độ 80oC hoặc có thể làm khô ở nhiệt độ phòng qua đêm

* Những lưu ý trong quá trình lai

1 Dung dịch lai phải được làm nóng đến nhiệt độ lai trước khi tiền lai

2 Khi đặt màng vào dung dịch lai, màng phải được thấm ướt hoàn toàn, giữa màng lai và thành ống lai không được có bọt khí

3 Không nên cho probe trực tiếp lên màng lai Không được biến tính probe trước khi sử dụng

Hình 4.11 Kết quả thí nghiệm 3, lai ở nhiệt độ 48oC, thời gian lai 16 giờ, ủ 1 giờ

73(BamH I) 73(Eco RV)

Nấm (BamH I) 73(Hind III)

127(BamH I) 127(Eco RV)

127(Hind III) Vi Khuẩn(BamHI)

PCR M

PCR(B)

4(BamH I) 4(Eco RV)

4(Hind III)

sản phẩm lai

sản phẩm

lai