Thiết lập qui trình southern blot 1

Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1ĐẶT VẤN ĐỀ

Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt cho thế kỷ 21 Trước hết là những đầu tư rất lớn để khai thác và ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu hại, cỏ dại và các loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp Đây là một hướng nghiên cứu mới có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nước ta nếu được đầu tư phát triển sản xuất

Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, theo đó các kĩ thuật về sinh học phân tử đã ra đời như phương pháp Southern blot, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RADP (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến mới trong các hướng nghiên cứu về acid nucleic Đặc biệt là các nghiên cứu sâu về gen và cấu trúc gen Trong đó, phương pháp Southern blot được xem là một kĩ thuật đem lại kết quả chính xác cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử Một trong những ứng dụng quan trọng của Southern blot là lập bản đồ giới hạn di truyền; phát hiện các khuyết tật về di truyền do gen; chẩn đoán phân tử; xác định số bản sao của gen

Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp Với những trang thiết bị hiện có của Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP HCM, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Thiết lập qui trình Southern blot ”

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU 1.2.1 Mục tiêu đề tài

Thiết lập qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens trong điều kiện phòng thí nghiệm

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Southern blot, một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được phát triển vào giữa thập niên 1970 do Ed Southern ở MRC một bộ phận của genome động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975) Đã gần 30 năm trôi qua, kĩ thuật lai Southern đã được cải tiến đi rất mhiều, chủ yếu bao gồm:

- Tăng độ nhạy

- Giảm một số bước trong quá trình lai - Giảm thời gian thực hiện

- Về kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn trước nhiều

Theo đó, một số phương pháp chuyển lên màng cũng đã được mô tả bởi các tác giả sau: Southern (1979); Maniatis và ctv (1982); Meinkoth và Wahl (1984); Vandenplas và ctv (1984); Jeffreys và ctv (1985) nhưng đều dựa trên một nền tảng chung:

- DNA được giữ trong một hệ thống gel thích hợp - DNA được vận chuyển lên một giá thể rắn

- Probe đánh dấu được lai với DNA được giữ trên một vật thể và probe có thể được loại bỏ sau quá trình lai

- Sản phẩm lai được phát hiện dựa trên một hệ thống phát hiện thích hợp Song song đó, nhiều phương pháp chuyển DNA từ gel lên màng cũng được thực hiện như: blot mao dẫn hướng xuống (Lichtenstein và ctv, 1990; Chomozynki, 1992), blot chân không (Medveczky và ctv,1987; Olszewska và Jone, 1988; Trnovsky, 1992), blot hai chiều (Sambrook và Russell, 1999), và blot với đệm alkaline (Reed và Mann, 1985)

Bên cạnh đó, vật liệu làm màng cũng đã được cải tiến đi rất nhiều Phương pháp Southern blot đầu tiên được mô tả bởi Southern sử dụng màng nitrocellulose để chuyển DNA Trong vài năm lại đây, vật liệu màng mới được phát triển và bao gồm giấy DBM, DPT và cả hai loại màng nylon tích điện và không tích điện, với mục đích tăng độ liên kết, có thể vận chuyển những phân tử nhỏ, và màng có thể sử dụng lại cho việc lai sau khi đã loại bỏ probe

Cùng với sự phát triển đó, các phương pháp đánh dấu probe không dùng phóng xạ đã ra đời và đang được thương mại hóa trên thị trường Bằng việc sử dụng các tiểu phần của biotin (Langer và ctv, 1981) và dùng enzyme gắn kết với DNA probe (Renz và Kurz, 1984) Năm 1990, Ishii thuộc Viện Lúa Quốc tế đề nghị cải tiến phương pháp Southern blot không dùng đồng vị phóng xạ, bằng cách sử dụng digoxigenin Các phân tử lai được phát hiện bằng kháng thể của digoxigenin có gắn với enzym photphatase kiềm Probe sử dụng có thể là DNA, RNA, cDNA

2.2 NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Đầu tiên cần tách chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt phân tử DNA thành các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo kích thước Gây biến tính DNA trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M), sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao dẫn (màng lai thường sử dụng là màng nitrocellulose) Vị trí của các đoạn DNA trên gel, được giữ yên khi chuyển lên màng lai

Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ lai với các đoạn DNA trên màng lai, tạo nên các phân tử DNA lai Tiến hành lai phân tử bằng cách cho vào hộp lai chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 65oC trong 3 – 8 giờ, sau đó thêm dịch lai với chế độ nhiệt 65oC, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng Rửa màng lai bằng dung dịch SSC (NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 65oC hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc hoặc sấy khô ở 65oC

Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 20oC, xử lý dưới ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai

2.3 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT

Việc khám phá ra sự tương đồng của các chuỗi DNA thông qua phương pháp Southern blot đã góp một vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử và tái tổ hợp DNA Southern blot là một phương pháp quan trọng để nghiên cứu những vấn đề cơ bản như sự hiểu biết về cấu trúc gen, biểu hiện của gen và các genome

Lai Southern blot được áp dụng để phát hiện số lượng bản sao của một gen trong genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn DNA, sự có mặt của các đoạn DNA

lạ, sự thay đổi vị trí của các transposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các intron, exon của một gen … Khi áp dụng các chỉ thị phân tử (marker DNA) khác nhau làm mồi, chúng ta có thể phân biệt được các loài, cá thể dưới loài Phương pháp Southern blot càng có vai trò trong chẩn đoán các bệnh do di truyền và những khám phá về vi khuẩn cũng như các chủng vi rút gây bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2001)

2.4 SỰ KHÁC NHAU GIỮA SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT VÀ WESTERN BLOT

Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot, Northern blot và Western blot

1) Chiết xuất DNA từ tế bào 2) Cắt với enzyme giới hạn 3) Chạy điện di trên gel agarose

4) Thường chuyển lên màng bằng phương pháp mao dẫn 5) Lượng sản phẩm thừa là DNA

6) Lai với probe DNA 7) Rửa bỏ probe thừa làm tăng độ chính xác ở bước phát hiện

8) Phóng xạ tự ghi (autoradiograph)

1) Chiết xuất RNA từ tế bào 2) Biến tính với formaldehyde 3) Chạy điện di trên gel agarose

4) Thường chuyển lên màng bằng phương pháp mao dẫn 5) Lượng sản phẩm thừa là RNA

6) Lai với probe DNA

7) Rửa bỏ probe thừa làm tăng độ chính xác ở bước phát hiện

8) Phóng xạ tự ghi (autoradiograph)

1) Chiết xuất protein từ tế bào 2) Biến tính với SDS

3) Chạy điện di trên gel polyacryamide - SDSPAGE 4) Thường chuyển lên màng bằng phương pháp điện di 5) Lượng sản phẩm thừa là protein

6) Lai với probe kháng thể 7) Rửa bỏ probe thừa

8) Phóng xạ tự ghi

(autoradiograph) hoặc phát triển với cơ chất chromogenic

2.5 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VI KHUẨN

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này

ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học Thông thường các phương pháp tách chiết đều phải qua các bước sau

- Bước 1: Phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA

- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein mà chúng thường được làm biến tính trong phenol và chloroform

- Bước 3: Tủa nucleic acid nhằm thu nhận chúng ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn

Mục đích của các phương pháp tách chiết nucleic acid là có thể thu được phần lớn các nucleic acid có trong mẫu ở dạng nguyên vẹn và đủ sạch để tiến hành các phân tích phân tử kế tiếp Trong nghiên cứu này, việc chuẩn bị genomic DNA có vai trò rất lớn trong quá trình tạo mẫu lai Đầu tiên, chúng được cắt với một hoặc nhiều enzyme để tạo ra những phân đoạn nhỏ và được phân biệt nhau theo kích thước khi chạy điện di Những đoạn DNA này được làm biến tính in situ và vận chuyển từ gel lên một vật thể rắn (thường là một màng nylon hoặc nitrocellulose) Vị trí của những đoạn DNA phân biệt theo kích thước được giữ trong suốt quá trình chuyến đến màng Sau đó, DNA sẽ được cố định trên màng và chuẩn bị cho việc lai

Thông thường để có được một qui trình ly trích DNA ổn định, đủ lượng và đủ tinh khiết để thực hiện các phân tích kế tiếp, cần phải trải qua các quá trình thử nghiệm; từ đó đưa ra qui trình thích hợp trên đối tượng nghiên cứu Sau đây là các phương pháp ly trích DNA từ vi khuẩn

2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS (Sambrook và ctv, 2001)

1 Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng qua đêm

2 Thu sinh khối bằng ly tâm và rửa trong 5 ml Tris 50 mM (pH 8,0), EDTA 50 mM

6 Đem ly trích với 6 ml Tris được cân bằng phenol và ly tâm 10000 vòng/15 phút Chuyển phần dịch nổi bên trên cho vào một tube mới (có thể thực hiện lại bước này khi cần thiết)

7 Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ Sau đó thêm vào 2 thể tích 95 % ethanol, lắc đều

8 Tủa DNA và cho vào 5 ml Tris 50mM (pH 7,5), EDTA 1mM, RNAse 200 mg / ml, để qua đêm ở 4oC

9 Ly trích cùng với thể tích chloroform, lắc đều và ly tâm 10000 vòng/5phút Chuyển phần dịch bên trên vào một tube mới

10 Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ; cho vào 2 thể tích ethanol 95 %, lắc đều

11 Làm tủa và hòa tan DNA trong 2 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM 12 Kiểm tra sản phẩm ly trích bằng điện di và phân tích

2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB (Sambrook và ctv, 2001)

1 Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng LB, thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4oC

2 Rửa sinh khối thu được với 1ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex

3 Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE 1X và đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ

4 Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5 M, hòa tan thật kỹ bằng voltex

5 Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1/10 thể tích) Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút

6 Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/10phút, ở 4oC

7 Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt bề mặt chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa ở tốc độ lớn hơn)

8 Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol(25:24:1) với sự ngang bằng về thể tích Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng/10phút/4oC

9 Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới Kết tủa DNA với 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở - 20oC / 30 phút Sau đó ly tâm 12000 vòng/10phút/4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm

10 Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng/10phút/4oC Thu kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng

11 Hòa tan hoàn toàn DNA kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X Cho thêm vào 1µl RNAse, ủ phản ứng ở 37oC, trong 2 giờ

12 Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/5 - 10 phút/4oC

13 Thu phần dung dịch bên trên và chiết xuất với chloroform / isoamyl alcohol (24:1) Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng / 5 - 10 phút / 4oC

14.Thu phần dung dịch DNA bên trên Thêm 2 µl dung dịch natri acetate 3 M

(pH 5,0), isopropanol Rửa kết tủa với 70% ethanol Thu kết tủa làm khô

15 Hòa tan kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X, đem mẫu giữ ở tủ 4oC

2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel TM

3 Thêm vào phenol / chloroform, lắc đều cho đến khi có sự hòa lẫn hoàn toàn

5 Thêm 1/10 thể tích natri acetate, trộn đều

6 Thêm 0,6 thể tích isopropanol, trộn nhẹ cho đến DNA tạo kết tủa, ly tâm, bỏ phần dịch

7 Rửa DNA trong 1 ml ethanol 70% trong 30 giây

8 Làm tan DNA trong 100 – 200 µl đệm TE 1X Có thể để vài ngày để DNA tan hoàn toàn

9 Nếu giữ trong thời gian ngắn thì trữ ở 4oC; còn nếu giữ trong thời gian dài thì nên giữ trong tủ -20oC hoặc -80o

2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế

Phương pháp này không thật chính xác nhưng cho phép ước lượng tương đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu, và thường điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên cứu

Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm- Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau đây

- Một đơn vị OD260nm tương ứng với một nồng độ là: + 50 µg / ml cho một dung dịch DNA sợi đôi

+ 40 µg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn - Ví dụ: một giá trị OD260nm = 0,9 sẽ tương đương với:

+ Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi = 0,9 x 50 = 4,5 µg / ml + Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA = 3,6 µg / ml

Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm) 280 nm là bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất Nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm / OD280nm nằm trong khoảng 1,8 - 2

2.6.2 Điện di (Electrophoresis)

Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thước

Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid

Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr) Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang

Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, tức là dưới 1000 cặp base Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose Do đó, gel này chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là:

- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA

- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base

Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng

Thực hiện nạp mẫu điện di

Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu nucleic acid đã được trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó Trạng thái đó được duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel Sau đó, bản gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dưới UV

2.6.3 Định lƣợng DNA bằng phân tử Mass

Phương pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lượng so với band của phân tử Mass Mẫu định lượng cần phải được pha loãng một lần, hai lần, ba lần, …, n lần Sau đó, các mẫu pha loãng được kiểm tra bằng điện di và được so sánh với phân tử Mass, cho đến khi đạt được sự tương đương về kích thước và độ sáng giữa band của mẫu pha loãng với band của Mass Từ đó, xác định được nồng độ của mẫu pha loãng, đồng thời ta có hệ số pha loãng so với mẫu gốc tính được nồng độ của mẫu gốc

Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass

Một số điểm chú ý khi sử dụng phân tử Mass

Mỗi tube phân tử Mass chuẩn chứa thể tích là 250 µl nên có thể được sử dụng cho

100 giếng khi sử dụng thể tích là 2,5 µl / giếng Nồng độ của dung dịch chuẩn là 100

µg / ml trong đệm TE

Hình 2.1 Thang chuẩn về nồng đô của phân tử

Mass (Bio- Rad)

2,5 µl mẫu chuẩn được pha loãng với 10 µl loading buffer và TE được bơm vào gel agarose 1,8 % Gel này được đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X Gel được ngâm trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg / ml EtBr) trong 15 phút và được giữ trong nước 30 phút

Phân tử Mass chuẩn có thể được giữ ở nhiệt độ phòng, nhưng nên giữ ở nhiệt độ 4oC là tốt nhất (ở nhiệt độ này nó có thể được dùng ổn định trong 1 năm) Tuy nhiên, nó có thể được giữ trong thời gian dài trong tủ - 20oC

Phân tử Mass được điện di với gel agarose có nồng độ 1,8 % và gel polyacryamide với nồng độ 8 % Nồng độ của Mass được xác định dựa vào sự hấp thu bước sóng 260 nm của phân tử Mass, với mức độ sai số là 1 %

2.7 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME)

Tế bào vi khuẩn bị nhiễm thực khuẩn thể (phage) thường bị phage phá huỷ Có một số chủng vi khuẩn bị nhiễm phage không bị phage tiêu diệt, do DNA của phage bị cắt thành từng đoạn nhỏ nhờ một số loại enzyme trong tế bào Những enzyme đó được gọi là enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA của phage ở những vị trí nhất định thành những đoạn ngắn (Khuất Hữu Thanh, 2001)

Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên

(1970) ở vi khuẩn Hemophilus influenzae Chủng Rd đặt tên là Hind II Enzyme giới

hạn (Restriction Enzyme - RE) thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết trong phân tử DNA

Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn

Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất

2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn

Qui ước quốc tế các enzyme giới hạn kí hiệu như sau: chữ đầu viết chữ in hoa chỉ tên chi hoặc loài vi khuẩn mà từ đó các enzyme giới hạn được tách chiết; hai chữ tiếp theo viết chữ in thường chỉ giống của vi khuẩn; tiếp đến là một chữ viết hoa chỉ chủng vi khuẩn, cuối cùng là chữ số la mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn có enzyme giới hạn được phát hiện

Ví dụ:

2.7.2 Các loại enzyme giới hạn

Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn Dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người ta chia enzyme giới hạn làm ba loại (Khuất Hữu Thanh, 2001)

Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn) di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide cắt tại đó và giải phóng độ vài chục nucleotide

Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó Loại này thường sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp

Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước

2.7.3 Các kiểu cắt của enzyme giới hạn

Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp xếp khác nhau) Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm bốn cặp nucleotide, cứ 44

= 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt Khi các enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 46 = 4096 cặp nucleotide có một chỗ bị cắt Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở những vị trí nhất định Có theo hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo đầu so le (Khuất Hữu Thanh, 2001)

Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt ends) Các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với nhau Để nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzym nối – DNA ligase, hoặc các adaptor chuyên dụng cho mỗi loại enzyme

Ví dụ: Enzyme SmaI cắt tạo đầu bằng giữa các đoạn 6 bp

5’ … CCCGGG … 3’ 3’ … GGGCCC … 5’

5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’

Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa hai mạch đơn, tạo nên các đầu so le (hay đầu dính – cohesive ends) Các đầu so le tạo nên sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA ligase, nhờ đặc tính này enzyme giới hạn cắt đầu sole được sử dụng nhiều trong công nghệ DNA tái tổ hợp

Ví dụ: Vị trí phân cắt phân tử DNA của enzyme Eco RI

2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng

Thường trong nghiên cứu sinh học phân tử, cũng như trong một phòng thí nghiệm về sinh học phân tử luôn luôn phải có một bộ enzyme thông dụng Trong đó, enzyme giới hạn đặc biệt không thể thiếu trong các phân tích về genome như nghiên cứu sự đa dạng di truyền của quần thể, tạo dòng Sau đây, liệt kê một số enzyme thường hay sử dụng trong các thí nghiệm về phân tử (bảng 2.3)

EcoRI

Ở pB 322

Alu I Bam HI Bst I Eco RI Hae I Hind III Hpa I Pst I Sac I Sal I Sau 3A Sma I Taq I

AG  CT G  GATCC G  GATCC G  ATTC (TA) GG  CC (TA) A  AGCTT GTT  AAC CTGCA  G GAGCT  C G  TCGAC  GATC CCC  GGG T  CGA

> 50 5 5 5 7 7 13 18 2 2 >50

3 >50

16 1 1 1 7 1 0 1 0 1 22

0 7

Arthrobacter luteus

Bacillus Amuloliquefaciens H Bacillus Amyloliquefaciens Escherichia coli RY13 Haemophilus aegyptius

Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Providencia Stuartii 164 Streptomyces achromogenes Streptomyces Albus G

Staphylococcus aureus 3A Serratia marcescens Sb Thermus aquaticus YTI

2.8 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

PCR là kỹ thuật khuếch đại một trình tự DNA xác định trong điều kiện in vitro do Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985 Phản ứng PCR dựa vào đặc tính của enzyme DNA polymerase Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tiếp nhau Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước:

- Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA mạch đôi được tách thành hai mạch đơn ở

nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA đó Nhiệt độ để biến tính hoàn toàn DNA thường sử dụng là 94 – 95oC trong 30 – 60 giây

- Giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn: Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ

nóng chảy của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer Nhiệt độ này tùy thuộc vào mỗi loại primer được sử dụng

- Giai đoạn tổng hợp kéo dài: Nhiệt độ tăng lên 72oC, nhiệt độ hoạt động tối ưu

của Taq DNA polymerase, trong khoảng 30 giây đến nhiều phút tùy theo kích thước cần khuếch đại Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn Độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn Taq

DNA polymerase được sử dụng trong phản ứng PCR là một enzyme chịu nhiệt, không bị mất hoạt tính trong bước biến tính DNA mạch khuôn (Nguyễn Cát Túc, 2003)

Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR sẽ được điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát bằng mắt thường dưới tia UV có bước sóng 312 nm hoặc xem qua máy chụp gel bằng phần mềm Quantity One 2000 (Bio - Rad)

2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase

Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Nồng độ cuối Thể tích hút / 50 µl phản ứng

10X PCR buffer 1X 5 µl dNTP mix 2mM 0,2 mM/mỗi loại 5 µl

Taq DNA polymerase 1,25 UI / 50 µl tùy phản ứng

Công thức tính:

Nồng độ đầu x Thể tích cần hút = Nồng độ cuối x Thể tích phản ứng

2.8.2 Sử dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense

định cƣ trong đất và trong vùng rễ cây trồng

Để phát hiện Pseudomonas spp định cư trong đất và ở vùng rễ cây trồng bằng phương pháp PCR, trước tiên cần tìm một trình tự đặc hiệu của Pseudomonas spp Trình tự này phải hiện diện trên tất cả các Pseudomonas nhưng không có trên tất cả

các loài vi sinh vật khác Từ trình tự này sẽ thiết lập một cặp primer đặc trưng cho

Pseudomonas spp Qui trình phát hiện Pseudomonas spp sẽ được xây dựng với cặp

primer được thiết kế

Trong khoá luận này, hai cặp primer đặc hiệu được sử dụng để phát hiện

Pseudomonas fluorescens là phl - 2a, phl - 2b và B2BF, BRR4 được thiết kế dựa trên

trình tự của gen phlD có vai trò trong việc tổng hợp chất 2,4 – DAPG (2,4 -

Diacetylphloroglucinol) Đây là một chất kháng sinh sinh học, giúp cây trồng kháng với một số nấm bệnh

2.9 PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH DNA

Trong dung dịch DNA còn chứa nhiều thành phần khác như protein, RNA Vì vậy cần thiết phải loại bỏ chúng nhằm thu được lượng DNA thuần nhất Có nhiều phương pháp tinh sạch DNA Tùy vào mức độ tạp nhiễm của DNA mà chọn lựa phương pháp thích hợp để tiến hành tinh sạch

2.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol (Sambrook, 1999)

1 Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1,5ml

2 Dùng pipet hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1) cho vào eppendorf chứa mẫu DNA

3 Lắc nhẹ bằng tay 10 giây Ly tâm 12000 vòng /1phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng

4 Cẩn thận thu lấy dịch DNA nổi bên trên bằng pipet cho vào eppendorf sạch 5 Cho isopropanol vào eppendorf chứa DNA, ủ ở nhiệt độ - 20oC trong 20 phút 6 Ly tâm tốc độ 12000 vòng / 1 phút, loại bỏ isopropanol, thu DNA kết tủa 7 Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / 1phút trong 20 phút, loại bỏ ethanol, thu lấy DNA kết tủa

8 Làm khô và hòa tan DNA trong dung dịch TE

Phenol hay phenol / chloroform có thể làm kết tủa protein trong dung dịch Lượng kết tủa này có thể loại bỏ bằng cách ly tâm, thu nhận dung dịch không có protein Tuy nhiên có thể thực hiện phản ứng tủa nhiều lần nếu lượng protein quá lớn Khuyết điểm của phương pháp này là có thể làm đứt gãy DNA, lượng DNA thu lại sau khi tinh sạch khoảng 60% so với lượng DNA ban đầu

2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX (Amersham)

Phương pháp này cho phép tinh sạch trực tiếp từ dung dịch DNA hay tinh sạch DNA từ gel Lượng DNA thu lại khi tinh sạch từ dung dịch khoảng 80% và từ gel là

60% so với lượng DNA ban đầu Đối với sản phẩm PCR những thành phần còn dư như primer hay dNTP có thể được loại bỏ hoàn toàn sau khi tinh sạch Theo phương pháp này, các giai đoạn của quá trình tinh sạch như sau:

- Biến tính protein: “Capture buffer” có tác dụng biến tính protein và tăng cường khả năng liên kết chuỗi DNA với cột GFX

- Thu giữ DNA: DNA bám dính trên cột GFX

- Rửa: DNA được rửa bằng dung dịch rửa để loại bỏ muối và các thành phần khác - Hòa tan DNA: DNA tinh sạch được hòa tan trong TE

Qui trình tinh sạch từ dung dịch DNA (Amersham)

Qui trình tinh sạch DNA từ gel (Amersham)

1 Dùng dao cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào eppendorf 1,5 ml Sử dụng cân phân tích để xác định trọng lượng gel vừa cắt ở trên

2 Dùng micropipette hút capture buffer theo mg / v (10 mg gel ≈ 10 µl capture buffer), đậy nắp eppendorf, vortex nhẹ, ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết 3 Sau khi agarose tan hoàn toàn, ly tâm tốc độ 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây để tập trung mẫu ở đáy eppendorf

4 Hút mẫu cho vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

5 Ly tâm 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây, lấy cột ra và đặt vào eppendorf 1,5 ml mới

6 Hút 500 µl wash buffer cho vào cột, ly tâm 10000 vòng / 1 phút trong 30 giây 7 Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1,5 ml mới

8 Hút 50 µl elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

9 Ly tâm tốc độ 10000 vòng / 1 phút trong 1 phút, lấy cột GFX ra, thu lấy dung dịch DNA

2.10 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN DNA LÊN MÀNG

2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer)

Sau quá trình điện di, những phân đoạn DNA được giữ trong gel Gel này được đặt trên một dòng lưu chất và dòng lưu chất này vận chuyển trên bề mặt của một vật thể rắn, phẳng (Southern, 1975) Dòng dịch lỏng này sẽ lưu chuyển qua miếng gel bằng lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm (Sambrook và ctv, 2001)

Tốc độ vận chuyển của DNA phụ thuộc vào kích thước của DNA và nồng độ gel agarose được sử dụng Đối với những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn 1 kb thì hầu hết nó được vận chuyển qua gel agarose 0,7 % sau 1 giờ Đối với những đoạn DNA có kích thước lớn thì sự vận chuyển của chúng chậm chạp hơn thường mất khoảng 18 giờ và ít có hiệu quả (Wahl và ctv, 1979; Meinkoth và Wahl, 1984)

Quá trình chuyển lên màng cần sử dụng các dung dịch sau (Kurt Weismg và ctv, 1995):

- Đệm biến tính: NaOH 0,5 M; NaCl 0,15 M

- Đệm trung tính: Tris- HCl 0,5 M; NaCl 0,15 M; pH 7,0 - Đệm chuyển: SSC 20X, SSC 6X, SSC 2X

giấy lọc; chồng giấy thấm; tấm kính phẳng; vật nặng Thời gian chuyển lên màng kéo dài qua đêm

Theo Roger (1999), quá trình chuyển lên màng được thực hiện như sau: gel được làm biến tính trong dung dịch đệm alkaline (NaOH 1N) trong 30 phút; sau đó gel được ngâm dung dịch đệm trung tính Tris (Tris buffer) Thực hiện việc chuyển lên màng theo thứ tự sau: một tấm kính phẳng đặt trên dung dịch SSC 10X; giấy wick; gel được làm biến tính; màng nylon; giấy thấm; tấm kính phẳng; vật có trọng lượng Thời gian chuyển kéo dài 12 giờ

Ngoài ra, theo Sambrook và Russell (2001), quá trình chuyển lên màng gồm các bước sau:

Biến tính gel bằng đệm biến tính (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M)

Ngâm gel trong HCl 0,2 N

Trung hòa gel bằng đệm trung tính I (Tris 1M (pH 7,4), NaCl 1,5M)

Trung hòa gel bằng đệm trung tính II (Tris-Cl 0,5M (pH 7,2), NaCl 1M) Thực hiện chuyển lên màng bằng

đệm chuyển SSC 10X

Hình 2.2 Hệ thống mao dẫn hướng lên

Do yêu cầu hóa chất phòng thí nghiệm và trang thiết bị sử dụng, chúng tôi đã chọn quá trình chuyển lên màng theo Kurt Weismg và ctv (1995)

2.10.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống (Downward Capillary Transfer)

Những đoạn phân tử DNA được giữ trong gel để trực tiếp bên dưới một dòng lưu chất alkaline buffer và sự tồn lưu của chúng trên bề mặt của màng Khi đó, dòng dung dịch đệm sẽ lưu chuyển qua gel nhờ lực hút thẩm thấu của chồng giấy thấm ở dưới (Koetsier và ctv, 1993) Sự vận chuyển những đoạn DNA nhanh và cường độ tín hiệu khoảng 30% khi được chuyển bằng hệ thống hướng lên Sự cải tiến này có hiệu quả khi thực hiện sự di chuyển những đoạn phân DNA thông qua gel (Sambrook và ctv, 2001)

2.10.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều (Simultaneous Transfer to Two Membranes)

Khi những đoạn trình tự đích hiện diện ở nồng độ cao thì phương pháp mao dẫn được sử dụng vận chuyển DNA đồng thời (hiện tượng mao dẫn hướng lên và hướng xuống) và nhanh từ một gel đơn đến hai màng nitrocellulose hoặc nylon (Hình trên) Đệm chuyển là dung dịch đệm có trong gel và hiệu quả vận chuyển kém Không dùng phương pháp này đối với những thử nghiệm đòi hỏi tính nhạy cao Tuy nhiên, phương

Hình 2.3 Hệ thống mao dẫn hướng xuống