thiết lập qui trình Southern blot phần 3

thiết lập qui trình Southern blot phần 3

[...]... khẳng định qui trình lai đã ổn định, phản ứng đánh dấu DNA sử dụng làm probe đã thành công 69 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Chúng tôi bước đầu đã thiết lập được qui trình Southern blot, với các kết quả đạt được là đã tạo được mẫu lai, tạo thành công phân tử probe đánh dấu từ sản phẩm PCR, đã thực hiện được phản ứng lai và phát hiện được sản phẩm lai trên phim Các bước chính trong qui trình là:... ethanol, ủ ở - 70oC trong 30 phút, quay tròn và rửa bằng ethanol 70% 9 Lấy kết tủa hòa tan với 20 µl TE 1X 74  Để giảm thời gian trong việc hoàn thành một qui trình lai, chúng tôi đề nghị nên thực hiện chuyển DNA lên màng bằng phương pháp chuyển bằng điện, bằng việc sử dụng máy Trans – blot R SD DNA/RNA blotting Kit (Bio - Rad) Qui trình thực hiện chuyển (Catalog number 170 - 39 40) như sau: 1 Chuẩn... trong điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm để qui trình hoàn thiện hơn Qui trình đề nghị thay thế  Nếu không đủ điều kiện ly trích DNA theo phương pháp CTAB, thì có thể ly trích theo qui trình sử dụng SDS, các bước thực hiện như sau: 1 Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng qua đêm 2 Ly tâm thu sinh khối và rửa trong 5 ml Tris 50 mM (pH 8,0), 50 mM EDTA 3 Đông huyền phù ở - 20oC 4 Thêm 0,5 ml Tris 250... trong 2 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM  73  Nếu không có đủ kinh phí để mua kit tinh sạch thì có thể sử dụng qui trình tinh sạch theo phương pháp dùng phenol Qui trình tinh sạch được thực hiện theo các bước sau 1 Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1,5 ml 2 Dùng pipette hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol cho vào eppendorf chứa mẫu DNA 3 Lắc nhẹ bằng tay 10 giây, ly tâm 12000 vòng... probe và trình tự DNA mục tiêu vẫn xảy ra, sản phẩm PCR vẫn cho kết quả dương tính, các mẫu 4, 73, 127 cho kết quả lai âm tính So với ủ 2 giờ, các đốm tạp trên nền phim giảm xuống khi ủ 1 giờ M PCR M M PCR PCR(B) 4(BamH I) PCR 73( BamH I) 127(BamH I) 127(Eco RV) Hình 4.11 Kết quả thí nghiệm 3, lai ở nhiệt độ 48oC, thời gian lai 16 giờ, ủ 1 giờ 73( Eco RV) 4(Eco RV) 4(Hind III) sản phẩm lai 73( Hind III)... tích là 34 µl Thêm vào 2 µl chất điều khiển phản ứng (unbiotinylated lambda) với 32 µl nước sạch 2 Biến tính trong nước đang sôi mạnh trong 5 phút 3 Đặt nhanh trên đá 5 phút 4 Ly tâm nhanh ở 4oC 5 Thêm các tác nhân đánh dấu theo tứ tự sau: - 10 µl hỗn hợp labeling 5X (chứa biotinylated random octamers) - 5 µl hỗn hợp dNTP (chứa dNTP và biotin - dATP) - 1 µl đoạn Klenow (3 – 5’ exo -) 6 Ủ ở 37 oC, tính... / 30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống 3 Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào DNA đã được làm lạnh Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá 4 Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều 5 Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross-linker Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng trong 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy 6 Ủ 30 phút ở 37 oC... chuyển phần dịch nổi bên trên cho vào một tip mới 7 Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ Sau đó thêm vào 2 thể tích 95% ethanol, lắc đều 8 Tủa DNA và cho vào 5 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, RNAse 200 mg / ml, để qua đêm ở 4oC 9 Ly trích cùng với thể tích chloroform, lắc đều và ly tâm 10000 vòng / 5 phút Chuyển phần dịch bên trên vào một tip mới 10 Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3. .. 10000 vòng / 5 phút / 4 oC Rửa sinh khối thu được với 1 ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (2 – 3 lần) 2 Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% , đánh tan bằng vortex Sau đó ủ ở 37 oC khoảng 1 - 2 giờ 3 Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl, hòa tan thật kỹ bằng vortex Bước 4: Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl... trong dung dịch đệm 5 – 10 phút 3 Chuẩn bị gel sandwich cẩn thận theo thứ tự sau: - Dưới cùng là bệ của anode (cực dương) - Tấm giấy lọc được làm ướt bằng dung dịch đệm - Gel đối trọng - Tấm giấy lọc được làm ướt bằng dung dịch đệm 4 Đặt tấm thép cathode (cực âm) ở trên một cách an toàn 5 Chạy blot - Gel nhỏ: 10 V trong 30 phút hoặc 15 V trong 15 phút - Gel lớn: 25 V trong 30 phút hoặc 15 V trong 60 phút 123doc.vn