Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát triển và hoàn thiện phương pháp.
LỜI CẢM TẠ CHÚNG TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Công ty Bio – Rad đã tài trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt thời gian thực tập để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. CHÚNG TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận này. Thầy Trần Nhật Phương đã giúp đỡ chúng tôi rất nhiều về kinh phí và hóa chất để thực hiện đề tài này. Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh. Chị Phan Thị Thu Hiền đã tận tình chỉ dạy chúng tôi các thao tác, kĩ năng phòng thí nghiệm. Anh Nguyễn Đức Thành và anh Phương (Trung tâm Y Tế Quận 9) đã nhiệt tình chỉ dẫn chúng tôi trong kỹ thuật rửa phim X- quang. Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận. Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi trong thời gian thực tập. i TÓM TẮT LÊ MINH KHA, NGUYỄN VĂN LẪM, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. “THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT”. Giảng viên hướng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đề tài là một hướng nghiên cứu phát triển của phương pháp lai phân tử trong điều kiện phòng thí nghiệm, mà bước đầu là hoàn thiện phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được thực hiện theo qui trình của Kurt Weising và ctv (1995) và qui trình của kit Gene Image AlkPhos Direct Labelling and Detection System Amersham. Qui trình trải qua các giai đoạn từ bước chuẩn bị mẫu lai như tăng sinh vi khuẩn; ly trích genomic DNA; thực hiện phản ứng cắt; điện di chuyển lên màng và làm khô màng đến tạo được phân tử đánh dấu từ sản phẩm PCR của gen phlD sau khi đã được tinh sạch bằng phương pháp cắt gel, cuối cùng thực hiện phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X-ray. Với kết quả đạt được là: - Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn - Đánh dấu probe từ sản phẩm PCR trên cặp primer B2BF, BRR4 - Thiết lập được phản ứng lai và cho phát hiện kết quả lai trên phim X – ray. Tuy nhiên, đề tài vẫn chưa được hoàn thiện trên các mẫu là genomic DNA đã được cắt bằng enzyme giới hạn. Tóm lại, chúng tôi đã thiết lập được qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens nhưng vẫn chưa hoàn thiện được qui trình ở mức genomic DNA. Kết quả này là cơ sở ban đầu trong việc hoàn thiện phương pháp lai phân tử để phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật. MỤC LỤC ii Trang Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt .ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt .vi Danh mục các hình vii Danh mục các bảng .ix Phần 1. MỞ ĐẦU .1 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU – PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT 3 2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp Southern blot .3 2.2 Nguyên tắc của phương pháp Southern blot .4 2.3 Một số ứng dụng của phương pháp Southern blot 4 2.4 Sự khác nhau giữa Southern blot, Northern blot, và Western blot 5 2.5 Một số phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn .5 2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS 6 2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB .7 2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel TM (Jones và Bartlet, 1990) .8 2.6 Một số phương pháp định tính và định lượng DNA .9 2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế .9 2.6.2 Điện di (Electrophoresis) 10 2.6.3 Định lượng DNA bằng phân tử Mass .11 2.7 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme) 12 2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn .12 2.7.2 Các loại enzym giới hạn 13 2.7.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn 13 2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng .15 2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 15 2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA Polymerase 16 2.8.2 Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense định cư trong đất và trong vùng rễ cây trồng 16 2.9 Phương pháp tinh sạch DNA 17 iii 2.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol .17 2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX .17 2.10 Các phương pháp chuyển DNA lên màng .19 2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer) 19 2.10.2 Phương pháp mao dẫn hướng xuống (Downward Capillary Transfer) 21 2.10.3 Phương pháp mao dẫn hai chiều (Simultaneous Transfer to Two Membranes) 21 2.10.4 Phương pháp chuyển bằng điện (electrophoresis transfer) .22 2.10.5 Phương pháp chuyển bằng chân không .23 2.11 Đánh dấu probe .24 2.11.1 Tác nhân đánh dấu 24 2.11.1.1 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ 24 2.11.1.2 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ .25 2.11.2 Phương pháp đánh dấu 29 2.11.2.1 Phương pháp nick – translation .29 2.11.2.2 Phương pháp random priming (thiết lập mồi ngẫu nhiên) 30 2.11.2.3 Phương pháp đánh dấu End labelling (đánh dấu ở đuôi) 32 2.11.2.4 Phương pháp photobiotin .32 2.12 Các phương pháp lai phân tử .35 2.12.1 Cơ sở của sự lai phân tử 35 2.12.1.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA .35 2.12.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA 36 2.12.1.3 Khái niệm về lai phân tử 37 2.12.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử 37 2.12.2 Các kiểu lai phân tử .37 2.12.2.1 Lai trong pha lỏng .37 2.12.2.2 Lai trên pha rắn 38 2.12.2.3 Lai tại chổ (in situ hybridization) .39 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .40 3.1 Thời gian và địa điểm 40 3.2 Nội dung nghiên cứu 40 3.3 Phương pháp nghiên cứu .40 iv 3.3.1 Vật liệu thí nghiệm 40 3.3.2 Phương pháp tiến hành .43 3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB .42 3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 42 3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass 45 3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng ezyme giới hạn .46 3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR trên hai cặp primer B2BF, BRR4 48 3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel .50 3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4 51 3.3.2.8 Tạo mẫu lai .52 3.3.2.9 Lai Southern .55 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 57 4.1 Kết quả tăng sinh, ly trích và định lượng DNA 57 4.1.1 Kết quả ly trích genomic DNA .57 4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ 58 4.1.3 Kết quả định lượng bằng phân tử Mass 59 4.2 Kết quả phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn 59 4.3 Kết quả phản ứng PCR với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b .61 4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel .62 4.5 Kết quả lai Southern 63 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .69 5.1 Kết luận .69 5.2 Đề nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Phụ lục 1 77 Phụ lục 2 79 Phụ lục 3 .82 DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT v bp: base pair B: Bam HI CTAB: Cethyltrimethylammonium bromide DNA: Deoxyribonucleic acid 2,4 – DAPG: 2,4 – Diacetylphloroglucinol DIG: Digoxigenin dNTP: 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxycytidine triphosphate dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate E: Eco RV ETDA: Ethylenediamine tetraacetic acid H: Hind III HRP: Horseradish peroxydase Kb: kilobase PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction Enzyme RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: Ribonucleic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate SSC: Saline sodium citrate TAE: Tris Acetate EDTA Taq: Thermus aquaticus UV: Ultraviolet (light) w/v: Weight for volume DANH SÁCH HÌNH vi Hình 2.1Thang chuẩn về nồng đô của phân tử Mass .10 Hình 2.2 Sự mao dẫn hướng lên 20 Hình 2.3 Sự mao dẫn hướng xuống 21 Hính 2.4 Sự mao dẫn hai chiều .22 Hình 2.5 Phương pháp chuyển bằng điện 23 Hình 2.6 Phương pháp chuyển bằng chân không .23 Hình 2.7 Phản ứng khởi động của chemiluminescence 26 Hình 2.8 Cấu trúc của digoxigenin- 11- dUTP .28 Hình 2.9 Cấu trúc của biotin và hai thể đồng phân của biotin nucleotide, biotin- 7- dATP và biotin- 14- dATP 28 Hình 2.10 Đánh dấu probe bằng phương pháp nick translation .29 Hình 2.11 Đánh dấu DNA bằng phương pháp random priming 30 Hình 2.12 Đánh dấu “end labelling” dùng enzym polynucleotide kinase (PNK) 32 Hình 2.13 Cấu trúc của photobiotin acetate .34 Hình 2.14 Sự tạo liên kết giữa nucleic acid và tác nhân đánh dấu (biotin) tại vị trí N-7 của purine .33 Hình 2.15 Cơ chất chemiluminogenic đối với alkaline phosphatase .35 Hình 3.1 Qui trình cho một thử nghiệm Southern blot .43 Hình 3.2 Tổ hợp 6 gen sinh tổng hợp chất 2,4 – DAPG 49 Hình 3.3 Hệ thống mao dẫn chuyển DNA lên màng Hybond N chưa hoàn chỉnh .53 Hình 3.4 Hệ thống chuyển DNA lên màng Hybond N hoàn chỉnh 53 Hình 3.5 Đánh dấu bề mặt chứa DNA của màng Hybond N .54 Hình 3.6 Làm khô màng Hybond N bằng tủ sấy ở 65 o C .54 Hình 3.7 Để màng Hybond N vào máy GS Gene Linker TM UV chuẩn bị xử lý UV .54 Hình 3.8 Phản ứng lai trong buồng lai HB – 1000 Hybridizer ở 55 o C .55 Hình 4. 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường LB ở nhiệt độ 27 o C .57 Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng Pseudomonas fluorescens khác nhau .58 Hình 4.3 Kết quả định lượng mẫu 130 bằng phân tử Mass 59 Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzym giới hạn 60 vii Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b .61 Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28, 9, 13120, 154 bằng phương pháp cắt gel 62 Hình 4.7 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55 o C, thời gian lai 12 giờ, thời gian ủ 30 phút 64 Hình 4.8 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55 o C, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút 64 Hình 4.9 Kết quả thí nghiệm 2 .66 Hình 4.10 Kết quả lai ở nhiệt độ 48 o C 67 DANH SÁCH BẢNG viii Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot, Northern blot và Western blot .5 Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass .10 Bảng 2.3 Một số enzyme thường sử dụng và các trình tự đặc hiệu 15 Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR .16 Bảng 2.5 Phương pháp đánh dấu không phóng xạ và hệ thống phát hiện dùng cho oligonucleotide 31 Bảng 3.1: Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 25 µl 47 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng cắt với tổng thể tích phản ứng là 50 µl 47 ix . chúng tôi đã thiết lập được qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas fluorescens nhưng vẫn chưa hoàn thiện được qui trình ở mức. phương pháp Southern blot áp dụng trên vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được thực hiện theo qui trình của Kurt Weising và ctv (1995) và qui trình của kit