Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) là một trong ba cây đậu đỗ chính

trong nhóm các cây đậu ăn hạt Đây cũng là cây trồng có vị trí quan trọngtrong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong đó có Việt Nam [7], [11]

Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm,đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi mà còn có tác dụngcải tạo và bồi dưỡng đất, do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật

LTP là gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì Khi gặp stress hạn,LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật có thể giảm mất nước nhờtăng độ dày của lớp vỏ ngoài [36] Tuy nhiên, các nghiên cứu về mối liên quangiữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen LTP với khả năngchịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP ở

đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector

chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo cây đậu xanh chịu hạn

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu thông quaphân tích một số chỉ tiêu hoá sinh

- Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của một sốgiống đậu xanh

- Phân lập và nghiên cứu cấu trúc của gen LTP liên quan đến tính chịu hạn

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân tích một số đặc điểm hình thái như: màu gốc thân mầm, màu vỏhạt, hình dạng hạt, khối lượng 1000 hạt, chiều dài thân và rễ của cácgiống đậu xanh thu thập được ở giai đoạn cây non

- Phân tích các chỉ tiêu hoá sinh sau: hàm lượng lipid, protein tan tổng sốcủa các giống đậu xanh thu thập được

- Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu xanh thu thập được ởgiai đoạn cây non

- Tách chiết DNA tổng số của 1 số giống đậu xanh

- Nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

- Tách dòng gen LTP của giống đậu xanh chịu hạn tốt và chịu hạn kém nhất

- Xác định trình tự gen LTP

- Phân tích cấu trúc gen LTP

4 Ý nghĩa khoa học

Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo cây đậu xanhmang gen LTP

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh

Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có bộ NST 2n = 22,

là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn

Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các

nước Đông và Nam Á Dạng dại của V radiata cũng được tìm thấy ở

Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [11]

Phân loại khoa học của cây đậu xanh:

- Giới (regnum): Plantae

- Ngành (division): Magnolyophita

- Lớp (class): Magnolyopsida

- Bộ (order): Fabales

- Họ (Familia): Fabaceae

- Chi (genus): Vigna

- Loài (species): V radiata

Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm khoảng

150 loài thuộc 7 chi phụ là Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron; Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, trong đó đậu xanh là một trong số

16 loài của phân chi Ceratotropis [5]

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh

Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và

hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt

 Đặc điểm của rễ

Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ Rễchính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ănsâu tới 70 - 100 cm Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm

Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biển đổi thành, có vai tròtăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây Tuy nhiên, bộ rễcủa cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năngchịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém Nếu bộ rễ phát triểntốt thì bộ lá xanh lâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy Ngược lại, bộ rễ pháttriển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ

bị lép [7], [11] Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cổ định

đạm Rhizobium Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật

và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tậptrung chủ yếu ở cổ rễ Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đườngkính dao động từ 4 - 5 mm, so với đậu tương và lạc thì nốt sần của cây đậuxanh ít và nhỏ hơn Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còncác lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn Người ta nhận thấy rằngnhững nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnhhơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng Trung bình mỗi vụ, 1

ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 107 kg nitơ làm cho đất tơixốp hơn [8], [9]

 Đặc điểm của thân và cành

Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng

40 - 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng Thân đậu xanh nhỏ, tròn, cómàu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâusáng bao bọc Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng Độ dài củacác lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác Các lóng dàikhoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm Từ các đốt mọc ra các cành,trung bình có 1 - 5 cành Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triểnmạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2 - 3 mắt, từ cácmắt này mọc ra các chùm hoa Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùmhoa Thời kỳ trước khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm,sau đó mới tăng nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc

đã có quả chắc Đường kính trung bình của thân chỉ từ 8 - 12 mm và tăngtrưởng tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [11].

 Đặc điểm của lá

Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách Trên mỗithân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và láđơn Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá Cả hai mặt trên

và dưới của lá đều có lông bao phủ Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên,các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn Chỉ số diện tích lá (m2

lá/m2 đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch

Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộcvào giống, đất trồng và thời vụ [5], [11]

 Đặc điểm của hoa

Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,xếp xen kẽ nhau ở trên cuống Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ

ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắtđều có khả năng ra hoa Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoahình thành , sau 35 - 40 ngày thì nở hoa Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầutiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10

cm và có từ 10 - 125 hoa Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màuxanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt [11] Hoa đậu xanh thường nởrải rác, các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi cònchậm hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây Trên cùng một cành, các chùmhoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày Trong một chùm hoacũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh 10 - 15 ngày.Hoa nở được 24h là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là quảchín Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây Côngthức hoa là: K5C5A10G1 Thời gian nở hoa có thể chia thành 3 nhóm:

- Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài  16 ngày

- Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp  30 ngày

- Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày.

 Đặc điểm của quả

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặcdạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài 8 - 14 cm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2gân nổi rõ dọc hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi cònnon quả có màu xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen gặp nắng rễ bị tách vỏ Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có

từ 5 - 10 hạt Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn Mật độ lông phụthuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống chịu của cây Những giốngđậu xanh chống chịu bệnh khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lôngdày, vào thời kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến[4], [5] Các quả của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ralứa sau đó, nhưng quả to và hạt mẩy hơn Các quả của những đợt hoa ra sauthường ngắn, ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn Các quảsinh ra từ các chùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của cácchùm hoa ở cành Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày [8]

 Đặc điểm của hạt

Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chấtdinh dưỡng Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và 1 mầm non Mầm non lànơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên

Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi và có nhiều màu sắc khácnhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằmngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả Ruột hạt màu vàng, xanh,xanh nhạt Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêuquan trọng để đánh giá chất lượng của hạt Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt Hạt củanhững quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành Hạt của cácquả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau Số lượng hạt trung bìnhtrong một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu

xanh Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống,thời vụ và chế độ canh tác Trọng lượng 1000 hạt từ 50 - 70 gam [4].

1.1.3 Sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh

Sinh trưởng và phát triển của đậu xanh là kết quả thể hiện các đặc điểmcủa giống trong các mối quan hệ tương tác chặt chẽ với các điều kiện môitrường bên ngoài và với các yếu tố kỹ thuật canh tác Cần lưu ý, cây đậu xanh

có khả năng vừa sinh trưởng sinh dưỡng, vừa sinh trưởng sinh thực đồng thời

ở một số giai đoạn phát triển [11]

Có 2 giai đoạn sinh trưởng và phát triển chủ yếu ở đậu xanh:

- Các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (SD)

- Các giai đoạn sinh trưởng sinh thực (ST)

Bảng 1.1 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh Sinh trưởng sinh dưỡng Sinh trưởng sinh thực

Ký hiệu Thể hiện bên ngoài Ký hiệu Thể hiện bên ngoài

SDl Lá mầm xuất hiện ST2 Hoa phát triển đầy đủ

tự hình thành các đốt trên cây Kết thúc giai đoạn SDn tương ứng với số đốtcuối cùng trên cây Số đốt hình thành trên cây đậu xanh thay đổi tùy thuộcvào đặc điểm của giống

* Giai đoạn sinh trưởng sinh thực của đậu xanh (ST): Được chia thành

8 thời kì bắt đầu từ ST1 đến ST8, tương ứng với các thời kì hình thành hoa,quả, hạt đậu Cây đậu xanh có đặc điểm sinh trưởng vô hạn hoặc bán vô hạn,

nên việc xác định các thời kì sinh trưởng sinh thực thường gặp nhiều khókhăn, vì trên một cây đồng thời vừa có cả nụ, hoa, quả non và quả chín Vìvậy, thời kì sinh thực của đậu xanh chỉ mang tính chất tương đối.

Các thời kỳ sinh dưỡng, có thể gọi là các thời kỳ hình thành đốt trêncây đậu xanh (không kể thời kỳ SDm và SDl), các thời kỳ tiếp theo của sinhdưỡng được tính bằng số đốt đã mang lá hoàn chỉnh Một đốt được xem làhoàn chỉnh khi đốt phía trên nó có một lá kép đã xòe rộng (không còn cuốnnữa) Đốt lá đơn là đốt đầu tiên có hai lá đơn mọc đối diện hai bên thân và cócuống lá ngắn nhất Các lá thật trên thân đều có 3 lá chét, mọc cách trên thânchính với cuống lá dài [5], [11]

1.1.4 Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh

Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12%nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K … [11]

Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giáchất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinhtrong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàmlượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm Trong đó,hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sựphát triển của cây là protein và lipid

1.1.4.1 Protein

Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồncung cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi Trong hạt đậuxanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hainhóm: nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp Trong nhóm proteinđơn giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một sốloại khác Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơcho quá trình nảy mầm của hạt [11] Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tínhchất chung nhất của protein Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tínhchất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tan

trong nước Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu vàcông nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh

Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủcác amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng vớitiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO)

và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [20]

1.1.4.2 Lipid

Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tantrong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether,petroleum ether, benzen Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng củamàng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể.Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầmcủa hạt Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bìnhkhoảng 1,3%) [11], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩmchất và khả năng bảo quản hạt

Tóm lại, việc nghiên cứu và xác định hàm lượng protein và lipid có ýnghĩa rất quan trọng trong việc đánh giá chất lượng hạt đậu xanh

1.1.5 Tầm quan trọng của cây đậu xanh

Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Hạt đậu xanh lànguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P cùng nhiềuloại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C Protein hạt đậu xanhchứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine,methionine, phenylalanine, valine Hạt đậu xanh không chỉ phù hợp với nhucầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị Hạt đậuxanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn nhưcác loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đỗ và một số đồ uống Lánon và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa Thân,

lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [4], [5]

Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học, vỏ hạt đậu xanh có vịngọt, tính mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [13].

Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất Nhờ hệ

rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium

có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lạilượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch Vì vậy, đất sau khi trồng đậuxanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [11]

1.1.6 Tình hình nghiên cứu và sản xuất đậu xanh

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới

Hiện nay, công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến

hành theo một số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả

năng kháng sâu, bệnh hại [1], [10]

Để tạo các giống đậu xanh có khả năng chống chịu tốt với điều kiệnngoại cảnh bất lợi, các nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các đặcđiểm sinh lý, sinh hoá và các gen liên quan đến khả năng chống chịu của câyđậu xanh

Nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập genliên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh cũng được nhiều nhà khoa họctrên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năngchịu hạn tốt

Liu K.H và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen LTP ở đậu xanh,đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41]

Pandurangam V và cs (2006) đã nghiên cứu biểu hiện gen Rubisco ởđậu xanh [47]

Chen Y.J và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh

là VrHsc70 - 1, VrHsc70 - 2, VrHsc70 - 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọntạo giống đậu xanh có khả năng chịu hạn, chịu nóng [28]

Kim Y J và cs (2003) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3 với chiềudài của gen là 5213 nucleotide, vùng mã hoá gồm 1776 nucleotide mã hoácho 591 amino acid, có khối lượng phân tử 67,4 kDa [40].

Kang S J và cs (2002) đã phân lập gen cystatin ở đậu xanh với mã sốAF454396 trên Ngân hàng gen quốc tế [37]

Gần đây, nhiều nhà khoa học cũng bàn luận về mối liên quan giữacystatin với hạn, lạnh, muối, sự già và bảo vệ thực vật, chống côn trùng, visinh vật gây bệnh

Malgorzata G và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hoá cystatin ởđậu xanh nhằm nghiên cứu, chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chống chịutốt [42]

Trong tương lai, với sự phát triển ngày càng mạnh của khoa học kỹthuật, các loại cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng sẽ còn đượcnghiên cứu kĩ hơn, sâu hơn để có thể đáp ứng được nhu cầu sử dụng đậu xanhngày càng lớn của con người

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh ở Việt Nam

Từ sau cách mạng tháng tám năm 1945, chúng ta đã xây dựng đượcnhiều trạm nghiên cứu thí nghiệm về đậu đỗ nói chung và về đậu xanh nóiriêng ở nhiều nơi khác nhau như ở Định Tường (Thanh Hoá), Mai Nham(Vĩnh Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và đã tiến hành thuthập, chọn tạo ra nhiều giống mới với các đặc tính ưu việt hơn trước

Từ những năm 1980 đến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu

về đậu xanh như: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện câylương thực thực phẩm, các trường Đại học Nông nghiệp, Đại học Khoa học

Tự nhiên cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học khác Các Trung tâm này đãtập trung và đi sâu vào hai hướng nghiên cứu cơ bản trong sản xuất đậu đỗnói chung và đậu xanh nói riêng là:

- Chọn tạo giống thích hợp cho từng vùng sinh thái, từng mùa vụ khácnhau, giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu điềukiện ngoại cảnh bất lợi, đặc biệt là các giống có giá trị thương mại cao.

- Đưa cây đậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thốngtrồng độc canh hoá ở các vùng và cải tạo các vùng đất bị thoái hoá [4], [5].Với những định hướng trên, công tác chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta

đã được quan tâm phát triển và đã đạt được một số thành tựu nổi bật sau:

Lê Khả Tường và cs (2000), nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, khảnăng chống chịu sâu bệnh hại và thử nghiệm giống KP11 Kết quả đã đượcHội đồng khoa học công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật năm 2001 áp dụngcho vùng Bắc Trung Bộ [9]

Chu Hoàng Mậu (2001), bằng phương pháp gây đột biến thực nghiệm

đã tạo được 2 dòng đậu xanh MX1103 và TX16012 có năng suất cao, ổn định

và có khả năng chịu hạn tốt [15]

Chu Hoàng Mậu (2001) đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng protein,thành phần và hàm lượng các amino acid trong hạt các giống đậu xanh độtbiến và giống gốc để đánh giá chất lượng hạt của các giống đậu xanh Kết quảcho thấy hạt của giống đậu xanh đột biến MX103 có hàm lượng protein là20,58%, cao hơn so với các giống còn lại, hàm lượng amino acid của cácgiống đậu xanh đột biến cũng cao hơn các giống đối chứng [16]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) đã nghiên cứu một số chỉ tiêu hoásinh của 9 giống đậu xanh do Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cungcấp Kết quả cho thấy hàm lượng protein của các giống này dao động trongkhoảng 20,72% - 26,86% [17]

Cùng với việc áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào nghiên cứu đậuxanh của các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước đầu cũng có nhiều ứngdụng và đã thu được những kết quả khá quan trọng Các nhà khoa học đãthành công trong việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống chịu

như gen chịu hạn, chịu nóng, chịu muối và đánh giá quan hệ di truyền củamột số giống đậu xanh

Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng ditruyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006) đã phân lập và đọc trình tự gen PLC3(Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậuxanh KP11 và MN93 Gen có chiều dài 4215 nucleotide gồm 8 đoạn intron và

9 đoạn exon, vùng exon gồm 1776 nucleotide mã hoá 591 amino acid [18]

Nguyễn Thị Thu Trang (2008) đã phân lập gen cystatin có khả năngchịu hạn ở 2 giống đậu xanh là DX208 và PAEC3 [21]

1.1.6.3 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới

Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới ngày một tăng Đặc biệt, trongnhững năm gần đây do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vậttăng nhanh đã làm thúc đẩy việc sản xuất đậu xanh trên thế giới phát triển mạnh

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á đóng tại Đài Loan

đã có một bộ sưu tập giống đậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống, trong đó cónhững giống cho năng suất cao từ 18 - 25 tạ/ha Gần đây, một số nước lánggiềng của Việt Nam như Thái Lan, Philippin, Trung Quốc đã chọn ra đượcnhững giống đậu xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạtđẹp, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với cácđiều kiện cực đoan của môi trường [11]

Cho đến nay, trên thế giới cây đậu xanh được trồng với diện tíchkhoảng 928 ngàn ha, sản lượng đạt hơn 6445 triệu tấn (2002 - 2006) Ấn Độ

là nước trồng nhiều đậu xanh nhất với diện tích 15000 ha (năm 2008), chiếmtrên 70% diện tích đậu xanh toàn cầu, sản lượng đạt 420000 tấn (2008), năngsuất đạt 2800 kg/ha (2008) Thái Lan là nước sản xuất lớn thứ hai và là nướcđứng đầu về xuất khẩu đậu xanh với sản lượng đạt 92000 tấn (năm 2008),chiếm khoảng 40% sản lượng thế giới Nước nhập nhiều đậu xanh nhất làNhật 80 tấn/năm, Hoa Kỳ 50 tấn/năm [33]

Diện tích, năng suất, sản lượng của đậu xanh trên toàn thế giới trong 5năm gần đây được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 1.2 Diện tích, sản lượng, năng suất đậu xanh trên thế giới

trong 5 năm gần đây

Năm 2004

Năm 2005

Năm 2006

Năm 2007

Năm 2008 Diện tích (ha) 940188 938893 943149 938112 985679

Sản lượng (tấn) 6551886 6578870 6816377 6752646 6818948

Năng suất (kg/ha) 6968,6 7007 7227,2 7198,1 6918

Nguồn: FAOSTAT, 2008.

1.1.6.4 Tình hình sản xuất đậu xanh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây đậu xanh cũng được trồng từ lâu đời ở các vùng đồngbằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước Tuy nhiên, nó vẫn chỉ được xemnhư một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng đất đai, lao động dư thừa Vì thế,năng suất sản xuất đậu xanh còn chưa cao Từ năm 1991 - 1995 năng suất sảnxuất đậu xanh bình quân đạt khoảng 5,5 - 12 tạ/ha Từ 1996 - 2000 năng suấtdao động trong khoảng 15 - 20 tạ/ha Đến năm 2000, Việt Nam có diện tích vàsản lượng đậu xanh đứng thứ 6 trên thế giới [9]

Đậu xanh của nước ta sản xuất ra chủ yếu để đáp ứng nhu cầu tiêu dùngtrong nước như làm rau, làm bánh Các sản phẩm làm từ đậu xanh rất phongphú, nhưng hiện nay chỉ có một số ít sản phẩm có chất lượng ổn định và cóthương hiệu lâu năm trên thị trường [20]

Đậu xanh phân bố chủ yếu ở các vùng:

- Vùng núi phía Bắc: Tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hòa Bình.Năng suất trung bình đạt 600 kg/ha

- Vùng đồng bằng và trung du Bắc Bộ: Năng suất trung bình dao động

800 - 1000 kg/ha

- Vùng duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên: Là vùng sản suất đậu xanhlớn về diện tích và sản lượng Nhưng do ảnh hưởng của thời tiết nên cũng thấtthu nhiều về năng suất và sản lượng

- Vùng Đông Nam Bộ: Là vùng sản xuất đậu xanh quy mô lớn chiếm26% diện tích gieo trồng cả nước, năng suất bình quân còn thấp đạt khoảng

500 kg/ha do sử dụng giống đậu xanh cũ, khả năng chống chịu kém [5]

Ngày nay, đậu xanh có xu hướng tăng về diện tích và sản lượng do nhu cầu sửdụng Để đạt được kết quả tốt cần có các phương pháp lai tạo, chọn ra cácgiống mới có năng suất cao, chống chịu được với các điều kiện khắc nghiệtcủa môi trường ngoại cảnh

1.2 GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 1.2.1 Hạn và tác động của hạn đối với cây trồng

1.2.1.1 Hạn và các loại hạn đối với cây trồng

Hạn là hiện tượng thường xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quantrực tiếp đến vấn đề nước trong thực vật Khái niệm hạn dùng để chỉ tìnhtrạng thiếu nước của thực vật do môi trường gây nên, làm ảnh hưởng đến sựsinh trưởng và phát triển của thực vật, từ đó ảnh hưởng đến năng suất và sảnlượng cây trồng [10] Có 3 dạng hạn đối với thực vật là: hạn đất, hạn khôngkhí và hạn sinh lý

 Hạn sinh lý

Hạn sinh lý xảy ra khi trạng thái sinh lý của cây không cho phép câyhút được nước mặc dù trong môi trường không thiếu nước Rễ cây không lấy

được nước trong khi quá trình bay hơi nước vẫn diễn ra nên cây mất cân bằngnước Hạn sinh lý nếu nghiêm trọng và kéo dài cũng tác hại như hạn đất vàhạn không khí Nếu hạn đất kết hợp với hạn không khí thì mức độ tác hại đốivới cây còn tăng lên nhiều.

1.2.1.2 Tác hại của hạn đối với cơ thể thực vật

 Hệ thống keo nguyên sinh chất bị thay đổi mạnh:

- Thay đổi các tính chất lý hoá của chất nguyên sinh: tăng độ nhớt chấtnguyên sinh làm chậm các hoạt động sống, giảm mức độ phân tán, khả năngthuỷ hoá và tính đàn hồi của keo nguyên sinh chất…

- Thay đổi đặc tính hoá keo từ trạng thái sol rất linh động thuận lợi chocác hoạt động sống sang trạng thái coaxecva hoặc gel kém linh động, cản trởcác hoạt động sống

 Quá trình trao đổi chất lúc thiếu nước sẽ bị đảo lộn từ hoạt động tổng hợp là chủ yếu khi đủ nước chuyển sang hướng phân giải khi thiếu nước Quátrình phân giải quan trọng nhất là phân giải protein và axit nucleic, kết quả làgiải phóng và tích lũy NH3 gây độc cho cây và có thể làm cây chết

 Hoạt động sinh lý bị kìm hãm

- Thiếu nước sẽ ức chế hoạt động quang hợp Do khí khổng đóng nênthiếu CO2, lục lạp có thể bị phân huỷ, ức chế tổng hợp diệp lục, lá bị héo vàkhô chết, diện tích quang hợp giảm, sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp

ra khỏi lá và về cơ quan dự trữ bị tắc nghẽn

- Thiếu nước ban đầu sẽ làm tăng hô hấp, về sau giảm hô hấp nhanh, hiệuquả sử dụng năng lượng của hô hấp rất thấp vì hô hấp sản sinh nhiệt là chính

- Hạn làm mất cân bằng nước trong cây: lượng nước thoát ra lớn hơnlượng nước hấp thu vào cây làm cho cây bị héo

- Dòng vận chuyển vật chất trong cây bị ức chế rất mạnh: sự hút chấtkhoáng giảm do tốc độ dòng thoát hơi nước giảm Thiếu nước kìm hãm tốc độvận chuyển chất đồng hoá về các cơ quan dự trữ và có thể có hiện tượng

“chảy ngược dòng” các chất đồng hoá từ các cơ quan dự trữ về các cơ quan

dinh dưỡng Kết quả làm giảm năng suất kinh tế của cây trồng

 Quá trình sinh trưởng và phát triển bị kìm hãm

- Ức chế sinh trưởng: thiếu nước thì đỉnh sinh trưởng không tiến hànhphân chia được, quá trình dãn của tế bào bị ức chế làm cho cây sinh trưởngchậm nên nước được xem là yếu tố nhạy cảm trong sự sinh trưởng của tế bào

- Ức chế ra hoa, kết quả: thiếu nước ảnh hưởng đến quá trình phân hoá hoa vàđặc biệt là quá trình thụ tinh Khi gặp hạn, hạt phấn không nảy mầm, ốngphấn không sinh trưởng được, sự thụ tinh không xảy ra và hạt sẽ bị lép, dẫnđến giảm năng suất cây trồng

1.2.2 Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

Thực vật có khả năng ngăn ngừa thương tổn khi bị tổn thương gọi làtính chống chịu Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tốsinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, sương… Khi các nhân tố nàyvượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của câytrồng, dẫn đến giảm năng suất Phản ứng chủ yếu của cây đối với hạn là sựđóng khí khổng, giảm sự thoát hơi nước, giảm quang hợp, tăng tích lũy ABA,prolin, manitol, sorbitol… Nhờ vậy mà thực vật có thể thích nghi với các điềukiện khắc nghiệt của môi trường ngoại cảnh

Một trong những xu hướng để thực vật chống lại hạn là dựa vào khảnăng làm tăng áp lực nội tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào cũng nhưgiảm kích thước tế bào Trên phương diện hóa sinh, thực vật xảy ra nhiều biếnđổi nhằm chống lại hạn hán như giảm phức hợp CO2, giảm tổng hợp protein

và các axit nucleic, tăng hoạt tính RNase và hàm lượng prolin, tăng nồng độcác chất hòa tan Ngoài ra, thực vật còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữkhông để mất nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những

sự biến đổi về cấu trúc và hình thái như: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyênsâu; giảm diện tích lá; rút ngắn chu kỳ sống…[18]

Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của đậu xanh nói riêng và tínhchống chịu của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lýhoá sinh và do nhiều gen quy định Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đếntính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điềuchỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chếprotease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA,LTP, PLC ) [10].

Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nước của cây phụ thuộc vào bộ rễ.Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả nănghút nước ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấyđược nhiều nước Ở cây đậu xanh, hình thái rễ rất đa dạng Các giống đậuxanh địa phương thường có bộ rễ dài hơn các giống khác

Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính của tế bào khi bịmất nước do hạn, nóng, lạnh Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tănglên giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất Các chất

và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào đểcạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K+; các amino acidnhư prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol

và các chất khác như glycine betain, - alanin betain Các chất này có khảnăng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng hút nước và giữ nước vào tếbào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+ [19]

Abscisic acid (ABA) là hormone thực vật liên quan đến sự điều chỉnhsinh lý, sinh trưởng và phát triển đáp ứng với môi trường của thực vật bậccao ABA chủ yếu được tổng hợp ở rễ cây do phản ứng với stress nhờ gen cis-epoxycarotenoids với sự tham gia của enzyme 9-cis-epoxycarotenoiddioxygenase [46] ABA đóng vai trò then chốt trong nhiều quá trình của tếbào thực vật như: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nẩy mầm, sinh trưởng pháttriển và đáp ứng với stress của môi trường Đối với stress hạn, ABA có vai tròđiều chỉnh sự trao đổi nước trong cây, hạn chế sự mất nước làm cây thích

nghi với điều kiện khô hạn Về cơ chế tác động người ta cho rằng ABA làmbiến đổi điện thế hoá qua màng và do đó điều tiết sự tiết ion K+ [38]

Các nhân tố gây ức chế protease: khi stress hạn xảy ra, các protein bịbiến tính và bị tổn thương Cystein protease tham gia loại bỏ các protein biếntính Quá trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cystein protease gọi làcystatin [42]

Các gen điều khển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểuhiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển(cis acting element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tương tác vớiRNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các genchức năng Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn đãđược quan tâm nghiên cứu như: DREB, ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP,WRKY Mỗi nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chịuhạn có trật tự cis acting element riêng biệt và promotor trên mỗi gen chứcnăng chứa một hay nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã

Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn được biết đếnlà: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein - HSP), môi giới phân tử (Molecularchaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C(PLC), protein vận chuyển lipit (LTP)

HSP được tổng hợp trong quá trình sinh trưởng, các giai đoạn biệt hóacác mô, thời kì sinh sản, đặc biệt được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cựcđoan như hạn, nhiệt độ cao, muối cao Sự xuất hiện của HSP có chức năngngăn cản hoặc sửa chữa sự phá hủy của stress Dựa vào khối lượng phân tửngười ta chia HSP ở thực vật thành 6 nhóm khác nhau: HSP 8.5, 20, 60, 70,

90, 110kDa Trong nhóm HSP có rất nhiều đại diện của chất môi giới phân tử(MGPT) (HSP70, HSP60) nhưng cũng có những HSP không phải là môi giớiphân tử, ví dụ HSP 8,5 kDa (Ubiquitin)

Các MGPT là yếu tố chìa khóa tham gia nội cân bằng tế bào trong cácđiều kiện sinh trưởng cực thuận và đối lập Chức năng chính của MGPT là

tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới được tổng hợp,chuyển protein qua màng, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sựhủy hoại protein chưa tạo cấu trúc không gian, khởi đầu cho sự phân hủyprotein biến tính [10] MGPT có 5 họ chính là: HSP 70 (Dnak), HSP 60(Chaperonin), HSP 90, HSP 100 và sHSP (small HSP) trong đó có hai họ môigiới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70 HSP70 đãđược phân lập ở đậu xanh [28].

Protein LEA cũng được chú ý trong điều kiện thực vật bị stress do thiếunước [32], [50], [58], [59] Protein LEA được phân chia thành 5 nhóm chínhtrên cơ sở chuỗi trình tự amino acid của nó: nhóm 1-D19, nhóm 2-D11(dehydrin), nhóm 3-D7, nhóm 4-D113, nhóm 5-D29 [30] Protein LEA thựchiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủyprotein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu Nó không những chỉ đượcphát hiện trong hạt mà còn trong các mô tăng trưởng khi cây bị stress do thiếunước, do mặn, và do lạnh Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúcđại phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu

sự mất nước [57] Protein LEA được tạo ra hàng loạt trong giai đoạn muộncủa quá trình hình thành phôi

Gen PLC liên quan đến sự huy động canxi Canxi hoà tan được xemnhư chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào cóphản ứng bảo vệ Sự truyền tín hiệu canxi trong suốt stress hạn và muối đãđược nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao [40]

Gen LTP liên quan đến quá trình sinh tổng hợp biểu bì Khi bị stresshạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảmmất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [27] Ở đậu xanh, gen LTP cũng

đã được phân lập và công bố trên ngân hàng gen quốc tế [34]

1.2.3 Protein vận chuyển lipid (LTP) và gen LTP (Lipid Transfer Protein)

1.2.3.1 Protein LTP

LTP là tên thường gọi của một nhóm protein có khả năng vận chuyểnlipid, có liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật.

LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trìnhvận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước LTP được gắntại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như mộtreceptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào Phức hợp LTP - linoleic acid

đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạnnhân tạo [39]

Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của

tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stressmuối và stress hạn Nghiên cứu trên cây đậu xanh, Liu K.H và cs (2003)nhận thấy rằng hàm lượng mRNA của LTP sẽ tăng cao trong điều kiện stressmuối, stress hạn hay khi hàm lượng ABA ngoại bào tăng cao [41]

LTP còn tham gia vào hệ thống miễn dịch của thực vật Nghiên cứu trêncây lúa, Blilou I và cs (2005) nhận thấy tốc độ tổng hợp LTP tăng nhanh khi có

sự xâm nhập của loài nấm Glomus mosseae vào biểu bì rễ và giảm khi nấm tấn

công vào khoảng gian bào [24] Carvalho A.O và cs (2006) khi nghiên cứu trên

cây đậu đũa (Vigna unguiculata (L.) Walp) nhận thấy LTP là peptide kháng

khuẩn tham gia vào việc bảo vệ cây chống lại các mầm bệnh [26]

LTP được chia thành hai dạng khác nhau về khối lượng phân tử Dạngthứ nhất có khối lượng phân tử khoảng 9 kDa (LTP1) và dạng thứ hai có khốilượng phân tử khoảng 7 kDa (LTP2) Cả LTP1 và LTP2 đều có một vùng bảothủ gồm 8 amino acid loại cystatin và 4 amino acid loại prolin [36]

Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố nhưhormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điềukhiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứngnhằm giúp cho cây tăng khả năng chống chịu stress, chịu bệnh… Những phân

tử protein này thường bao gồm nhiều đặc điểm chung như: điểm đẳng điệncao, khối lượng phân tử khoảng 9,12 kDa và sự có mặt của 8 phân tử cysteinlàm nhiệm vụ tạo ra 4 cầu nối disulfide [36]

LTP đã được chứng minh trong việc ngăn chặn nguồn gây bệnh như:

Pseudomonas solanacearum, Clavibacter michiganasis, Fuarium solani, Rhizoctonia solani, Trichodelmar viride và Cercospora beticola [36], [45].

Trong những năm gần đây, gen LTP đã được nghiên cứu ở một số thực vật

như: Arabidopsis thaniana L [22], Paphanus sativus L [53], Zea mays L [49],

[51], Capsicum annuum [55], Vigna radiata L [41], Triticum L [44], Daucus carota L [52], Nicotiana tabacum L [43], [48], Oryza sativa L [56], Valencia orange [60], Lycopesium esculentum [54].

LTP có khả năng xúc tác tới sự vận chuyển phospholipid giữa các lớpmàng của tế bào LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bìgiúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường[23], [25]

Hiện nay, LTP ở thực vật được biết có 4 nhóm lớn:

- Nhóm I: Bao gồm các CsLTP chứa các bộ mã hoá protein

đã được cô lập và biểu hiện ở trong quả

- Nhóm II: Bao gồm những gen LTP tổng hợp ra protein đượcbiểu hiện trong hạt

- Nhóm III: Bao gồm các gen LTPs tổng hợp ra protein đượcbiểu hiện trong mô lá Chúng được tạo ra khi có những ảnhhưởng của môi trường như tình trạng khô hạn và các tácnhân có thể gây bệnh

- Nhóm IV: Bao gồm các gen LTP tổng hợp nên các chuỗipolypeptide được cô lập và biểu hiện trong hoa [36], [45].

Ở cây đậu xanh, Liu K.H và cs (2003) đã phân lập thành công hai dạngkhác nhau của gen LTP và đặt tên là Vrltp1 và Vrltp2 [41] Trình tự cácamino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mangtính bảo thủ cao ở thực vật Trong hạt đậu xanh ở giai đoạn nảy mầm, nhómnghiên cứu chỉ tìm thấy mRNA của Vrltp1, còn trong mô sinh dưỡng thìmRNAcủa cả Vrltp1 và Vrltp2 chỉ tìm thấy ở lá và thân, không có ở chóp rễ.Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muốihoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ làm tăng tốc độ phiên mã củamRNA Vrltp1 và Vrltp2 Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng

rõ rệt tới sự phát triển các mô non và rất có thể đóng vai trò quan trọng trong

sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Hạt của 13 giống đậu xanh do Viện nghiên cứu Ngô cung cấp và một sốgiống thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, HàGiang Danh sách các giống đậu xanh nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các giống đậu xanh nghiên cứu

1 ĐXVN 4 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống Mungo 113 với ĐX 113

2 ĐXVN 5 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 04 với ĐX 113

3 VN 99-3 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống VN 93-1 với Vigna mungo

4 044/ĐX06 Do Viện NC Ngô lai tạo giữa giống ĐX 044 với ĐX 06

Hình 2.1 Hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các loại hóa chất: các hoá chất phục vụ nghiên cứu phân lập gen do cáchãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp

Các loại thiết bị máy móc: các thiết bị máy móc phục vụ sinh học phân

tử như máy PCR, máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, box cấy, máy lắc, lò visóng, cân điện tử, tủ sấy, tủ lạnh, bể ổn nhiệt, máy xác định trình tự nucleotide

tự động, pipetman, máy làm khô DNA (Speed Vac) và một số thiết bị, máymóc cần thiết khác

Địa điểm nghiên cứu: Các thí nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Sinhhọc phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học TháiNguyên; Phòng thí nghiệm Di truyền và Sinh học hiện đại - Khoa Sinh - Kỹthuật Nông nghiệp - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên vàPhòng Miễn Dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp sinh lí, hoá sinh

2.3.1.1 Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn

Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình

và cs (1998) [1]

Hạt đậu xanh được gieo vào trong các chậu trồng cây chứa cát vàngsạch Sau khi cây có 3 lá thật, tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách khôngtưới nước đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn cho cây che không chonước mưa có thể vào chậu thí nghiệm, thời điểm tiến hành thí nghiệm đượcthực hiện vào mùa khô từ tháng 9 đến tháng 11 âm lịch Khi cây non 3 lá thậtbắt đầu héo, tiến hành theo dõi mức độ héo của cây trong vòng 3, 5, 7, 9, 11ngày kể từ khi lô thí nghiệm bắt đầu có cây héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7,

9, 11 ngày Các chỉ tiêu phân tích gồm:

- Tỷ lệ cây không héo

- Tỷ lệ cây phục hồi

- Chỉ số chịu hạn tương đối

Khả năng chịu hạn tương đối của cây được biểu hiện bằng đồ thị rada,gồm các trục a, b, c, d, e, g, h, i, k, l và mang các trị số tương ứng an, bn, cn, dn,

en, gn, hn, in, kn,ln và chỉ số chịu hạn tương đối được tính bằng đồ thị rada theocông thức:

Sn = ½ sin α (an bn + bn cn + cn dn + dnen + engn + gnhn + hnin + inkn+knln+lnan) Trong đó:

- Góc α được tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau

- Sn: chỉ số chịu hạn tương đối

- n: ký hiệu các giống nghiên cứu

- Các chỉ tiêu theo dõi gồm:

- a: % cây không héo sau 3 ngày hạn

- b: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn

- c: % cây không héo sau 5 ngày hạn

- d: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn

- e: % cây không héo sau 7 ngày hạn.

- g: % cây phục hồi sau 7 ngày hạn

- h: % cây không héo sau 9 ngày hạn

- i: % cây phục hồi sau 9 ngày hạn

- k: % cây không héo sau 11 ngày hạn

- l: % cây phục hồi sau 11 ngày hạn

Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao

2.3.1.2 Định lượng lipid tổng số [3].

* Nguyên tắc

Dựa vào khả năng hoà tan của lipid trong dung môi hữu cơ để chiết lipid

có trong hạt đậu xanh Dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether

* Tiến hành

Hạt đậu xanh được sấy khô ở 700C đến khối lượng không đổi, nghiềnmịn, cân 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thêm 1,5 ml petroleumether, lắc đều trong 10 phút, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ Sau đó mang

đi li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, loại bỏ dịch Lặp lại quy trìnhnhư trên 3 lần

Hàm lượng lipid tính bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khichiết phần trăm khối lượng khô

% 100

a

b a

Trong đó: % L - % của lipid

a - khối lượng mẫu trước khi chiết

b - khối lượng mẫu sau khi chiết

2.3.1.3 Định lượng protein

Định lượng protein tan trong hạt đậu xanh theo phương pháp Lowry [3]

* Nguyên tắc

Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng, protein khử hỗn hợpphosphomolipdate - phosphovonphramate (thuốc thử Foling - Ciocalteau).Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein

* Lập đồ thị chuẩn định lượng protein

Nguyên liệu và hoá chất:

Albumin tiêu chuẩn 100%

Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N

Dung dịch B: CuSO4 0,5% trong Natri, kali tactrate 1%

Dung dịch C: 49 ml dung dịch A : 1 ml dung dịch B

Thuốc thử Foling

Pha dung dịch albumin 0,02% từ albumin gốc tinh khiết 100% Lấy 6ống nghiệm, đánh số thứ tự từ 1 đến 6, cho các chất tham gia phản ứng nhưtrong bảng 2.2 Sau đó đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sóng 750 nm

Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry

Hình 2.2 Đồ thị chuẩn định l ợng protein theo Lowry

* Tiến hành định lượng

Dựng cỏc dung dịch đệm phosphate citrate (pH = 10), NaCl 1M vànước cất để chiết protein tan cú trong hạt Mẫu sấy khụ tuyệt đối ở 1050C,nghiền mịn, cõn 0,05 g bột mẫu cho vào ống eppendorf 2 ml, thờm 1,5 mldung dịch đệm chiết, lắc đều trong 10 phỳt, bảo quản mẫu ở 40C trong 24 giờ.Sau đú mang đi li tõm 12000 vũng/phỳt ở 40C trong 20 phỳt, thu lấy dịch Lặplại quy trỡnh như trờn 3 lần nhưng lần thứ hai chỉ cần để lạnh trong 8 - 10 giờ,lần ba là 6 - 8 giờ Sau khi chiết bằng dung dịch đệm phosphate citrate (pH =10), tiếp tục tiến hành chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất Dịch chiếtchứa protein hoà tan đem xỏc định hàm lượng cựng protein chuẩn là albuminhuyết thanh bũ theo phương phỏp quang phổ hấp thụ bước súng 750 nm vớithuốc thử Foling Đơn vị tớnh hàm lượng protein là phần trăm khối lượng khụ

Hàm lượng protein được xỏc định dựa trờn đồ thị chuẩn định lượngprotein theo phương phỏp Lowry (hỡnh 2.2) Cỏch tớnh hàm lượng protein:

% 100

*

Pr

G : số mg mẫu phân tích

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo Gawel và Jarret (1991) [31]như sau:

(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nito lỏng thành bột mịn

(2) Bổ sung 0,8 ml đệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M,NaH2PO4 0,4 %, H2O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịchnổi Thêm 700 μl đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M,CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ Ủ 650C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra

để ở nhiệt độ phòng 5 phút

(3) Thêm 600 μl chloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút

(4) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút

(5) Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa

(6) Thêm 500 μl isoprropanol, trộn nhẹ đặt lên đá chờ có tủa trắng

(7) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô.(8) Bổ sung 300 μl cồn 70% búng nhẹ

(9) Li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn

(10) Làm khô DNA bằng máy speed vac

(11) Hoà tan DNA trong H2O khử ion

2.3.2.2 Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số

Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng 2 phương pháp:

(1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch củaDNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm Nồng độ DNAtrong dung dịch tách chiết được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (ng/μl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng

Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280 Dung dịch chứaDNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng

(2) Phương pháp điện di: Điện di kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trêngel agarose 0,8% Sản phẩm điện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi

và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng

độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết

2.3.2.3 Kỹ thuật PCR

Sau khi tách chiết và kiểm tra được độ tinh sạch của DNA tiến hành nhângen LTP bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi đặc hiệuđược trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi nhân gen LTP

2 Biến tính 94 1 phút

30

- Bổ sung 1000µl dung dịch Binding esdution

- Ủ ở 550C trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ cho gel tan hoàn toànthành dịch trong suốt

- Bổ sung 5 - 10µl Silica power vào và ủ sản phẩm ở 550C khoảng 5 phútrồi vontex khoảng 2 phút

- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng

- Bổ sung tiếp khoảng 500µl Buffer wash, vontex 2 phút Li tâm 10000vòng/phút trong 1 phút để loại dịch nổi, thu tủa (bước này lặp lại 3 lần)

- Làm khô DNA trong box

- Hoà tan DNA trong 20µl H2O deion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 550Ctrong 5 - 10 phút

- Li tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch nổi, bỏ tủa

- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel trên gel agarose 1% Sản phẩmđiện di được nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dướiánh sáng cực tím

2.3.2.5 Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng