Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen ltp ở đậu xanh vigna radiata l wilczek

` ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - - PHẠM THỊ OANH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - - PHẠM THỊ OANH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L.) Wilczek) Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, ngày 20 tháng năm 2010 Tác giả luận văn Phạm Thị Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Nguyễn Bích Nga - Phịng Miễn dịch học Viện Cơng nghệ Sinh học hết lịng giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ kỹ thuật viên phịng thí nghiệm Di truyền, Sinh học đại - Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Bộ môn Sinh học phân tử, Công nghệ gen - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên Qua đây, xin cảm ơn Bộ môn Hệ thống canh tác - Viện Nghiên cứu Ngô cung cấp số giống đậu xanh giúp tơi thực luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè nhiệt tình ủng hộ động viên tơi suốt q trình thực luận văn Tác giả luận văn Phạm Thị Oanh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ABA Abscisic Acid (Axit abxisic) bp Base pair (cặp base) CTAB Cetyltrimethyl-ammonium bromide cs Cộng DNA Deoxy ribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) EDTA Ethylen Diamin Tetracetic Acid (Axit etylen diamin tetraxetic) HSP Heat Shock Protein (Protein sốc nhiệt) IPTG Isopropylthio - β - D - galactosidase Kb Kilo base LB Luria and Bertani LEA Late embryogenesis abundant protein (Protein tích lũy với số lượng lớn giai đoạn cuối q trình hình thành phơi) LTP Lipid Transfer Protein (Protein vận chuyển lipit) MGPT Molecular chaperone (Môi giới phân tử) NXB Nhà xuất PCR Polymease Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PLC Phospholipase C RNA Ribonucleic acid (Axit Ribonucleic) TAE Tris Acetate EDTA X - gal - brom - - chlo - - indolyl - β - D - galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Tên bảng luận văn Bảng 1.1 1.2 Trang Các giai đoạn sinh trưởng phát triển đậu xanh Diện tích, sản lượng, suất đậu xanh giới năm gần 14 2.1 Các giống đậu xanh nghiên cứu 24 2.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng protein theo Lowry 28 2.3 Trình tự cặp mồi nhân gen LTP 31 2.4 Thành phần phản ứng PCR 31 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 32 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT 33 3.1 Một số đặc điểm hình thái giống đậu xanh nghiên cứu 36 3.2 Kích thước rễ, thân giống đậu xanh giai đoạn non 38 3.3 Hàm lượng lipid protein giống đậu xanh nghiên cứu 40 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Khả chịu hạn giai đoạn non giống đậu xanh nghiên cứu Phổ hấp thụ DNA bước sóng 260nm 280nm giống đậu xanh 044/ĐX06 HN Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Vị trí sai khác trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN Vị trí sai khác trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 46 52 54 55 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình Tên hình luận văn Trang 2.1 Hạt giống đậu xanh nghiên cứu 25 2.2 Đồ thị chuẩn định lượng protein theo Lowry 29 2.3 Sơ đồ vector pBT 33 3.1 3.2 3.3 Mối tương quan hàm lượng lipid protein giống đậu xanh nghiên cứu Đồ thị hình rada biểu diễn khả chịu hạn 42 43 Mối tương quan số chịu hạn chiều dài rễ giống đậu xanh nghiên cứu 44 3.4 Hình ảnh giống đậu xanh nghiên cứu sau 11 ngày gây hạn 45 3.5 DNA tổng số giống đậu xanh 044/ĐX06 BG 46 3.6 Hình ảnh điện di kết nhân gen LTP 47 3.7 Kết điện di DNA thu từ kỹ thuật thơi gel 48 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc 49 3.9 Kết điện di sản phẩm clony-PCR 50 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 Kết điện di sản phẩm tách plasmid mang gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN Trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh nghiên cứu So sánh trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN với trình tự cơng bố AY300807 So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 51 53 55 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek) ba đậu đỗ nhóm đậu ăn hạt Đây trồng có vị trí quan trọng nơng nghiệp nhiều nƣớc, có Việt Nam [7], [11] Trồng đậu xanh cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng ngƣời vật ni mà cịn có tác dụng cải tạo bồi dƣỡng đất, rễ đậu xanh có nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [5] Hiện nay, giống đậu xanh trồng Việt Nam chủ yếu giống có khả chịu hạn thƣờng bị nhiễm số bệnh nhƣ: sâu keo, sâu xanh… Trong năm gần đây, có số cơng trình nghiên cứu đậu xanh tiếp cận phân tích đại phân tử protein DNA nhƣ: nghiên cứu tính đa hình protein giống đậu xanh địa phƣơng kỹ thuật phân tích thành phần điện di protein dự trữ hạt, nghiên cứu tƣợng đa dạng DNA đƣợc nhân ngẫu nhiên [6], [10], [17] Một số nghiên cứu khả chịu hạn đƣợc tiến hành số loại trồng nhƣ đậu tƣơng, ngô, lúa… [1], [2], [9] Các nghiên cứu thống đặc tính chịu hạn trồng phức tạp nhiều gen quy định, có gen LTP (Lipid Transfer Protein) LTP gen liên quan đến sinh tổng hợp lớp biểu bì Khi gặp stress hạn, LTP kích thích tăng tổng hợp ngoại bì làm thực vật giảm nƣớc nhờ tăng độ dày lớp vỏ [36] Tuy nhiên, nghiên cứu mối liên quan đặc điểm sinh lí, hoá sinh sinh học phân tử gen LTP với khả chịu hạn đậu xanh hạn chế Xuất phát từ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá chất lƣợng hạt nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)” nhằm phục vụ việc thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP góp phần tạo đậu xanh chịu hạn Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lƣợng hạt giống đậu xanh nghiên cứu thông qua phân tích số tiêu hố sinh - Đánh giá nhanh khả chịu hạn giai đoạn non số giống đậu xanh - Phân lập nghiên cứu cấu trúc gen LTP liên quan đến tính chịu hạn Nợi dung nghiên cƣ́u - Phân tích số đặc điểm hình thái nhƣ: màu gốc thân mầm, màu vỏ hạt, hình dạng hạt, khối lƣợng 1000 hạt, chiều dài thân rễ giống đậu xanh thu thập đƣợc giai đoạn non - Phân tích tiêu hố sinh sau: hàm lƣợng lipid, protein tan tổng số giống đậu xanh thu thập đƣợc - Đánh giá khả chịu hạn giống đậu xanh thu thập đƣợc giai đoạn non - Tách chiết DNA tổng số số giống đậu xanh - Nhân gen LTP kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) - Tách dòng gen LTP giống đậu xanh chịu hạn tốt chịu hạn - Xác định trình tự gen LTP - Phân tích cấu trúc gen LTP Ý nghĩa khoa học Là sở cho việc thiết kết vector chuyển gen nhằm tạo đậu xanh mang gen LTP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu xanh Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek), có NST 2n = 22, loại đậu ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, đƣợc phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới chủ yếu nƣớc Đơng Nam Á Dạng dại V radiata đƣợc tìm thấy Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dƣơng, Đơng Phi [11] Phân loại khoa học đậu xanh: - Giới (regnum): Plantae - Ngành (division): Magnolyophita - Lớp (class): Magnolyopsida - Bộ (order): Fabales - Họ (Familia): Fabaceae - Chi (genus): Vigna - Loài (species): V radiata Chi Vigna chi lớn họ Đậu, bao gồm khoảng 150 loài thuộc chi phụ Vigna; Plectotropis; Ceratotropis; Lasionspron; Sigmoidotropis; Haydonia; Macrohynchus, đậu xanh số 16 loài phân chi Ceratotropis [5] 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu xanh Cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, loại trồng cạn thu hạt bao gồm phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt  Đặc điểm rễ Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ rễ phụ Rễ thƣờng ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, điều kiện thuận lợi ăn sâu tới 70 - 100 cm Rễ phụ thƣờng gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA 044/ĐX06 HN A A Hình 3.11 Trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh nghiên cứu Kết hình 3.11 cho thấy, chiều dài gen LTP hai mẫu nghiên cứu có kích thƣớc 351 nucleotide Khi so sánh trình tự BLAST NCBI, kết cho biết trình tự gen mã hố LTP đậu xanh Chúng tơi kết luận nhân, tách dịng đọc trình tự thành cơng đoạn gen mã hố LTP đậu xanh Mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide giống đậu xanh chịu hạn tốt 044/ĐX06 với giống đậu xanh chịu hạn HN đạt 97,7% (chỉ sai khác nucleotide lần lƣợt vị trí 107, 108, 109, 113, 276, 302, 313 314) Sự sai khác nucleotide giống đậu xanh chịu hạn tốt 044/ĐX06 với giống đậu xanh chịu hạn HN đƣợc thể bảng 3.6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.6 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN STT Vị trí 044/ĐX06 107 C 108 T 109 C 113 G 276 A 302 T 313 T 314 G HN A A T C T A A A Qua bảng 3.6 cho thấy, vị trí 107, 108, 109, 113, 276, 302, 313 314 nucleotide giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lƣợt C, T, C, G, A, T, T G, giống đậu xanh HN lần lƣợt đƣợc thay A, A, T, C, T, A, A A Các vị trí sai khác liên quan đến khả chịu hạn đậu xanh Từ kết xác định trình tự trên, chúng tơi tiếp tục so sánh trình tự gen LTP hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự giống đậu xanh Ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY300807 Kết so sánh trình tự nucleotide đƣợc thể hình 3.12 AY300807 044/ĐX06 HN AY300807 044/ĐX06 HN AY300807 044/ĐX06 | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT ATGGCTAGCC TGAAGGTTGC ATGCATGGTT GCGGTGGTGT TCATGGTCGT | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT GGTGAGTGCA CATATGGCAC ATGCGATCAC GTGCGGGCAA GTGGCCTCTT | | | | | | | | | | 110 120 130 140 150 CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG CTTTGGCTCC ATGCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn HN AY300807 044/ĐX06 HN AY300807 044/ĐX06 HN AY300807 044/ĐX06 HN AY300807 044/ĐX06 HN AY300807 044/ĐX06 HN CTTTGGAATC ATCCATCTCC TACCTCCAAA AGGGCGGAGT TCCGTCGGCG | | | | | | | | | | 160 170 180 190 200 TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC TCGTGTTGCA GCGGAGTGAA GGCCCTGAAC AGCGCCGCAA GTACCACCGC | | | | | | | | | | 210 220 230 240 250 TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT TGACCGCAAA ACCGCGTGCA ACTGTCTGAA AAACCTTGCC GGTCCAAAGT | | | | | | | | | | 260 270 280 290 300 CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCATCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC CGGGTATCAA CGAGGGCAAC GCCGCTTCAC TCCCAGGCAA ATGTAAAGTC | | | | | | | | | | 310 320 330 340 350 AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA ATCGTGCCCT ACTGGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA AACGTGCCCT ACAAGATCAG CACCTTCACC AACTGCGCTA ACATCAAGTA A A A Hình 3.12 So sánh trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN với trình tự cơng bố AY300807 Qua hình 3.12 cho thấy, trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN có hệ tƣơng đồng với trình tự nucleotide giống cơng bố với mã số AY300807 98,8% Các vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh đƣợc thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Vị trí sai khác trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN và AY300807 STT Vị trí AY300807 044/ĐX06 107 C C 108 T T 109 C C Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 HN A A T http://www.lrc-tnu.edu.vn 113 276 302 313 314 G T A A A G A T T G C T A A A Qua bảng 3.7 cho thấy, trình tự nucleotide vị trí 107, 108, 109 113 giống có mã số AY300807 lần lƣợt C, T, C G, giống đậu xanh HN lần lƣợt đƣợc thay A, A, T C Trình tự nucleotide vị trí 276, 302, 313 314 giống có mã số AY300807 lần lƣợt T, A, A A, giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lƣợt đƣợc thay A, T, T G So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN cho kết đƣợc thể hình 3.13 | | | | | | | | | | 044/ĐX06 HN 10 20 30 40 50 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV 044/ĐX06 HN | | | 110 IVPYWISTFT NCANIK NVPYKISTFT NCANIK Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 và HN Qua hình 3.13 cho thấy, giống đậu xanh 044/ĐX06 HN có độ tƣơng đồng trình tự amino acid protein gen LTP đạt 95,6% với vị trí sai khác đƣợc thể bảng 3.8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.8 Vị trí sai khác trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN STT Vị trí 044/ĐX06 36 A 37 P 38 C 101 I 105 W HN E S S N K Qua bảng 3.8 cho thấy, trình tự amino acid vị trí 36, 37, 38, 101 105 giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lƣợt A, P, C, I W, giống đậu xanh HN lần lƣợt đƣợc thay E, S, S, N K So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06 HN với giống đậu xanh có mã số AY300807 cho kết đƣợc thể hình 3.14 AY300807 044/ĐX06 HN | | | | | | | | | | 10 20 30 40 50 MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLAPCIS YLQKGGVPSA MASLKVACMV AVVFMVVVSA HMAHAITCGQ VASSLESSIS YLQKGGVPSA | | | | | | | | | | 60 70 80 90 100 SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV SCCSGVKALN SAASTTADRK TACNCLKNLA GPKSGINEGN AASLPGKCKV AY300807 044/ĐX06 HN | | | 110 NVPYKISTFT NCANIK IVPYWISTFT NCANIK NVPYKISTFT NCANIK AY300807 044/ĐX06 HN Hình 3.14 So sánh trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 Qua hình 3.14 cho thấy, độ tƣơng đồng trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 http://www.lrc-tnu.edu.vn xanh 044/ĐX06 HN lần lƣợt 98,2% 97,4% Các vị trí sai khác đƣợc thể bảng 3.9 Bảng 3.9 Vị trí sai khác trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh 044/ĐX06, HN AY300807 STT Vị trí AY300807 044/ĐX06 HN 36 A A E 37 P P S 38 C C S 101 N I N 105 K W K Qua bảng 3.9 cho thấy, trình tự amino acid vị trí 36, 37và 38 giống đậu xanh có mã số AY300807 lần lƣợt A, P C, giống đậu xanh HN lần lƣợt đƣợc thay E, S S Trình tự amino acid vị trí101 105 giống đậu xanh có mã số AY300807 lần lƣợt N K, giống đậu xanh 044/ĐX06 lần lƣợt đƣợc thay I W Sự sai khác trình tự nucleotide trình tự amino acid sở để chúng tơi có nghiên cứu nhiều giống đậu xanh so sánh hai nhóm chịu hạn tốt nhằm tìm kiếm thay đổi vị trí nucleotide amino acid liên quan đến tính trạng chịu hạn giống đậu xanh Đây tiền đề tạo sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có khả chịu hạn tốt, phục vụ cho phát triển đậu xanh vùng trung du miền núi phía Bắc KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận 13 giống đậu xanh có nguồn gốc khác đƣợc sử dụng nghiên cứu có: khối lƣợng 1000 hạt dao dộng từ 46,40 g (ở giống 044/ĐX06) đến 58,00 g (ở giống BG 2), chiều dài thân giai đoạn non dao động từ 8,05cm (ở giống HN 2) đến 14,12 cm (ở giống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 http://www.lrc-tnu.edu.vn 044/ĐX06), chiều dài rễ giai đoạn non dao động từ 6,24 cm (ở giống HN 2) đến 11,45 cm (ở giống 044/ĐX06) Các giống đậu xanh nghiên cứu có hàm lƣợng lipid dao động từ 2,17 % (ở giống 044/ĐX06) đến 4,78 % (ở giống HN 2), hàm lƣợng protein dao động từ 18,54 % (HN 2) đến 28,78 % (ở giống 044/ĐX06) Khả chịu hạn giống đậu xanh nghiên cứu có khác biệt Hai giống có khả chịu hạn cao 044/ĐX06 BG cịn hai giống có khả chịu hạn HN HN Đã nhân bản, chọn dịng xác định trình tự gen LTP giống chịu hạn tốt (044/ĐX06) giống chịu hạn (HN 2) thành công Chiều dài gen LTP hai giống đậu xanh có kích thƣớc 351 nucleotide với độ tƣơng đồng 97,7 % Độ tƣơng đồng trình tự amino acid protein gen LTP hai giống đậu xanh đạt 95,6 % Độ tƣơng đồng trình tự gen LTP hai giống đậu xanh nghiên cứu với trình tự gen LTP đậu xanh đƣợc công bố ngân hàng gen 98,8 % Độ tƣơng đồng trình tự amino acid protein gen LTP giống đậu xanh có mã số AY300807 với giống đậu xanh 044/ĐX06 HN lần lƣợt 98,2 % 97,4 % II Đề nghị Cần tiếp tục nhân bản, chọn dịng đọc trình tự gen LTP nhiều giống đậu xanh khác để tìm thị phân tử tính chịu hạn đậu xanh Từ sở để thiết kế vector chuyển gen nhằm tạo đậu xanh có khả chịu hạn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Lê Trần Bình cs (1998), Cơng nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nơng nghiệp Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi lúa, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 http://www.lrc-tnu.edu.vn Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn thị Hiền, Phùng Gia Tƣờng (1998), Thực hành Hố sinh học, NXB Giáo dục Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr: 3-9 Đƣờng Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh Kỹ thuật thâm canh biện pháp tăng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao Động - Xã Hội, tr: 5-31 Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), „„ Nghiên cứu tính đa dạng di truyền 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) kỹ thuật RAPD‟‟, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(1), tr: 57-66 Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các đậu ăn hạt Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr: 5-6 Kết nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991- 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr: 4-188 Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nông Nghiệp 10 Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học, Hà Nội 11 Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1998), Cây đậu xanh, NXB Nông Nghiệp 12 Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1991), Những nghiên cứu chọn tạo giống đậu đỗ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr: 2-20 13 Đỗ Tất Lợi (1997), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 14 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội, tr: 20-215 15 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dịng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 16 Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2001), “Hàm lƣợng axit amin hạt dòng đậu tƣơng đậu xanh đột biến”, Tạp chí Sinh học, 23(4) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003), Nghiên cứu thành phần hố sinh hạt tính đa dạng di truyền số giống đậu xanh có khả chịu hạn khác nhau, Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Đại học Thái Nguyên 18 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006), Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử số giống đậu xanh chịu hạn, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ 19 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 20 Phạm văn Thiều (1997), Cây đậu xanh Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp 21 Nguyễn Thị Thu Trang (2008), Đánh giá chất lượng hạt, khả chịu hạn phân lập gen cystatin số giống đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Luận văn thạc sĩ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Đại học Thái Nguyên Tài liệu tiếng Anh: 22 Arondel V., Vergnolle C., Cantrel C., Kader J.C (2000), “Lipid transfer protein are encoded by a small multigen familly in Arabidopsis thaniana”, Plant Science, 157, pp: 1-12 23 Blein J.P., Coutos P.T., Marion D., Ponchet M (2002), “From elicitins to lipid-transfer proteins: a new insight in cell signalling involved in plant defence mechanisms”, Trends in Plant Science, 7, pp: 293-296 24 Blilou I., Ocampo J.A., Garcia - Garrido J.M (2005), „„ Induction of LTP and Pal gene expression in rice roots clonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae‟‟, www.ncbi.nlm.nih.gov 25 Bourgis F., Kader J.C (1997), “Lipid-transfer proteins: Tools for manipulating membrane lipids”, Physiologia Plantarum, Volume 100, Number 1, pp: 78-84 26 Carvalho A.O., Souza-Filho G.A., Ferreira B.S., Branco A.T., Araujo I.S., Fernandes K.V., Retamal C.A., Gomes V.M (2006), „„Cloning Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 http://www.lrc-tnu.edu.vn and characterization of a cowpea seed lipid transfer protein cDNA: expression analysis during seed development and under fungal and cold stresses in seedling tissues‟‟, Plant Physiol Biochem, 44(11-12), pp: 732-742 27 Carvalho A.O., Tavares O.L.M., Santos I.S., Cunha M., Gomes V.M (2001), “Antimicrobial peptides and imunolocatization of a LTP in Vigna radiata seeds‟‟, Plant physiol Biochem, 39, pp: 137-146 28 Chen Y.J., Wu M.F., Yu Y.H., Tam M.F., Lin T.Y (2004), “Developmental expression of three mungbean Hsc70s and substratebinding specificity of the encoded protein”, Plant and Cell Physiology, 45(110), pp: 1603-1614 29 Douliez J.P., Michon T., Elmorjani K and Marion D (2000), “Structure, Biological and Technological Functions of Lipid Transfer Proteins and Indolines, the Major Lipid Binding Proteins from Cereal Kernels”, Journal of Cereal Science, Volume 32, Issue 1, pp: 1-20 30 Dure L.III., Crouch M., Harada J, T-H Ho, Mundy J, Quatrano R.S., Thomas T., Sung Z.R (1989), „„Common amino acid sequence domains among the LEA proteins of higher plants‟‟, Plant Mol Biol, 12, pp: 475-486 31 Gawel N.J., Jarret R.H (1991), Genomic DNA isolation 32 Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A (2005), „„LEA proteins prevent protein aggrevation due to water stress‟‟, Biochem, 388, pp: 151-157 33 http://faostat.fao.org 34 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/AY300807 35 Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C.A., Kader J.C and Zachowski A (1999), “Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties”, Molecular and Cellular Biochemistry, 192, pp: 157-161 36 Kader J.C (1996), “Lipid-transfer proteins in plants”, Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology , 47, pp: 627-654 37 Kang S.J., Kim M.C., Yoo D.W., Park K.S (2002), Vigna rariata cystatin mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AF454396 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 Karen S and John M (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, The plant cell, 2, pp: 503-512 39 Kimberly D.C., Mark A.T and Lawrence B.M (2005), „„Increased Accumulation of Cuticular Wax and Expresion of Lipid Transfer Protein in Response to Periodic Drying Events in Leaves of Tree Tobacco‟‟, www.ncbi.nlm.nih.gov 40 Kim Y.J, Kim J.E, Lee J.H., Lee M.H., Jung H.W., Bahk Y.Y, Hwang B.K., Hwang I., Kim W.T (2003), „„The Vr - PLC3 gene encodes a pultative plasma membrane - localized phosphoinoside - specific phospholipase C whose expression is induces by abiotic stress in mungbean (Vigna radiata L.)”, Federation of Eropean Biochemical Societies Letters, 556, pp: 127-136 41 Liu K.H., Lin T.Y (2003), “Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiate”, DNA sequence - The Journal of sequencing and mapping, 14(6), pp: 420-426 42 Malgorzata G., Barbara Z (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases”, Acta Biochimica Polonica, 51(3), pp: 609-624 43 Masuta C., Furuno M., Tanaka H., Yamada M., Koiwai A (2005), „„Molecular cloning of a cDNA clone for tobacco lipid transfer protein and expression of the functional protein in Escherichia‟‟, www.ncbi.nlm.nih.gov 44 Molina A., Garcia O.F (1993), “Developmental and pathogen-induced expression of three barley genes encoding lipid transfer proteins”, The Plant Journal, 4, pp: 983-991 45 Molina A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P., Garcisa O.F (1996), “Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP4 from barley show differential responses to bacterial pathogens”, Molercular and General Genetics, 252, pp:162-168 46 Ouvrard O., Cellier F., Ferrare K.,Tousch D., Lamaze T., Dupuis J.M and Casse D.F (1996), “Identification and expression of water stress- and abscisic acid-regulated genes in a drought-tolerant sunflower genotype”, Plant Molecular Biology, Volume 31, Number 4, pp: 819-829 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 Pandurangam V., Sharma - Natu P., Sreekanth B., Ghildiyal M.C (2006), ‘‘Photosynthetic acclimation to elevated CO in relation to Rubisco genee expression in three C3 species‟‟, Indian Journal of Experimental Biology, 44(5), pp: 408-415 48 Park C.J., Shin R., Park J.M., Lee G.J., You J.S and Paek K.H (2002), “Induction of pepper cDNA encoding a lipid transfer protein during the resistance response to tobacco mosaic virus”, Plant Molecular Biology, Volume 48, Number 3, pp: 243-254 49 Pe M E (1993), “Mapping quantitative trait loci (QTLs) for resistance to gibberella zeae infection in maize”, Molercular Gene Geneet, 241(12), pp: 11-16 50 Raesh S., Manickam A (2006), „„Prediction of functions for two LEA proteins from mungbean”, Bioinformation, 1(4), pp: 133-138 51 Sossountzov L., Ruiz A.L., Vignols F., Jolliot A., Arondel V., Tchang F., Grosbois M., Guerbette F., Miginiac E., Delseny M., Puigdomenech P and Kader J.C (1991), “Spatial and Temporal Expression of a Maize Lipid Transfer Protein Gene”, The Plant Cell, Vol 3, pp: 923-933 52 Sterk P., Booij H., Schellekens G.A., Van Kammen A., De Vries S.C (1991), “Cell-specific expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene”, The Plant Cell, 3, pp: 907-921 53 Terras F.R., Schoofs H.M., De Bolle M.F (1992), “Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds”, The Journal of Biological Chemistry, 267, pp:15301-15309 54 Terres S.S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A (1992), „„A probable lipid transfer protein is induced by NaCl in stems of tomato plants‟‟, Plants Molecular Biology, 105, pp: 749-756 55 Verma D.P.S (1990), “Genetic engineering for prolin biosynthesis and the role prolin in salt stress and symbiotic nitrogene fixation”, In: Proccedings of the international symposium on molecular and genetic approaches to plant stres, Newdelhi, pp: 14-17 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 Vignols F Lund G., Pammi S., Tremousaygue D., Grellet F., Kader J.C., Puigdomenech P., Delseny M (1994), “ Characterizarion of a rice gene coding for a lipid transfer protein”, Gene, 142, pp: 420-426 57 Wise (2003), „„Leaping to conclusions a computational reanalysis of latte embryogenesis abundant proteins and their possible roles‟‟, BMC Bioinformatics, 4, pp: 52-57 58 Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L (2007), „„Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions‟‟, TAG, 115, pp: 35-46 59 Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T., Wu R (1996), „„Expression of a late embyogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice‟‟, Plant Physiol, 110, pp: 249-257 60 Zhencai W and Jacqueline K B (2003), “Isolation and characterization of a cDNA encoding a lipid transfer protein expressed in Valencia orange during abscission”, Journal of Experimental Botany, 385, pp: 1183-1191 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt luận văn Danh mục bảng luận văn Danh mục hình luận văn MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên c ứu Nội dung nghiên c ứu Ý nghĩa khoa học CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu xanh 1.1.2 Đặc điểm nông sinh học đậu xanh 1.1.3 Sinh trƣởng phát triển đậu xanh 1.1.4 Đặc điểm hoá sinh hạt đậu xanh 1.1.5 Tầm quan trọng đậu xanh 1.1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất đậu xanh 10 1.2 GEN LTP VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH 15 1.2.1 Hạn tác động hạn trồng 15 1.2.2 Cơ sở hóa sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 17 1.2.3 Protein vận chuyển lipid (LTP) gen LTP (Lipid Transfer Protein) 21 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 VẬT LIỆU 24 2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phƣơng pháp sinh lí, hố sinh 26 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử 30 2.3.3 Phƣơng pháp xử lí số liệu 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HỐ SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU 37 3.1.1 Đặc điểm hình thái khối lƣợng 1000 hạt giống đậu xanh 37 3.1.2 Chiều dài rễ, thân giống đậu xanh giai đoạn non 38 3.1.3 Đặc điểm hoá sinh hạt giống đậu xanh 39 3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU XANH NGHIÊN CỨU Ở GIAI ĐOẠN CÂY NON 42 3.3 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN LTP 47 3.3.1 Kết tách chiết DNA tổng số 47 3.3.2 Kết nhân gen LTP 48 3.3.3 Kết tinh sản phẩm PCR 48 3.3.4 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α……48 3.3.5 Kết chọn lọc plasmid tái tổ hợp clony-PCR 49 3.3.6 Kết tách plasmid từ khuẩn lạc mẫu nghiên cứu 51 3.3.7 Kết xác định trình tự nucleotide mẫu nghiên cứu 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... đề tài: ? ?Đánh giá chất l? ?ợng hạt nghiên cứu đặc điểm cấu trúc gen LTP Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) ” nhằm phục vụ... - PHẠM THỊ OANH ĐÁNH GIÁ CHẤT L? ?ỢNG HẠT VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC GEN LTP Ở ĐẬU XANH (Vigna radiata (L. ) Wilczek) Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH... QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ L? ?ỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu xanh Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) , có NST 2n = 22, loại đậu ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, đậu xanh có