Đánh giá chất lượng hạt và nghiên cứu cấu trúc gen LTP ảnh hưởng khả năng chịu hạn ở đậu xanh (Vigna radiata L.Wilczek)

Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, sương… Khi các nhân tố này vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, dẫn đến giảm năng suất. Phản ứng chủ yếu của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm sự thoát hơi nước, giảm quang hợp, tăng tích lũy ABA, prolin, manitol, sorbitol… Nhờ vậy mà thực vật có thể thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường ngoại cảnh. Trên phương diện hóa sinh, thực vật xảy ra nhiều biến đổi nhằm chống lại hạn hán như giảm phức hợp CO2, giảm tổng hợp protein và các axit nucleic, tăng hoạt tính RNase và hàm lượng prolin, tăng nồng độ các chất hòa tan.

Ngoài ra, thực vật còn chống lại sự khô hạn bằng cách giữ không để mất nước hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu nước thông qua những sự biến đổi về cấu trúc và hình thái như: rễ to, khỏe, dài, có khả năng xuyên sâu; giảm diện tích lá; rút ngắn chu kỳ sống…[18]. Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật đã được biết đến như: vai trò của bộ rễ, khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic acid (ABA), aquaporin, các nhân tố ức chế protease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC..) [10]. Các chất và các gen tương ứng có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với môi trường xung quanh bao gồm: ion K+; các amino acid như prolin, estonine; các chất đường như sucarose, fructant, manitol, pinitol và các chất khác như glycine betain, β- alanin betain.

Các gen điều khển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA điều khiển (cis acting element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng. Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn được biết đến là: protein sốc nhiệt (Heat Shock Protein - HSP), môi giới phân tử (Molecular chaperone), protein LEA (Late embryogenesis abundant), Phospholipase C (PLC), protein vận chuyển lipit (LTP).

Protein vận chuyển lipid (LTP) và gen LTP (Lipid Transfer Protein) 1. Protein LTP

Protein LEA thực hiện các chức năng như: cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Nó không những chỉ được phát hiện trong hạt mà còn trong các mô tăng trưởng khi cây bị stress do thiếu nước, do mặn, và do lạnh. Sự biểu hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy nó có vai trò trong bảo vệ cây trồng chống chịu sự mất nước [57].

Canxi hoà tan được xem như chất truyền tín hiệu thứ cấp truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào có phản ứng bảo vệ. Khi bị stress hạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại bì giúp thực vật có thể giảm mất nước nhờ tăng độ dày của lớp vỏ ngoài [27]. LTP có khả năng tạo phức với một số acid béo và xúc tác cho quá trình vận chuyển lipid qua màng tế bào, giúp hạn chế sự mất nước.

LTP được gắn tại một vị trí cố định trên màng sinh chất của tế bào, nó có đặc điểm như một receptor vận chuyển acid béo qua màng tế bào. Phức hợp LTP - linoleic acid đã được chiết ra từ màng sinh chất của cây thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo [39]. Bên cạnh đó, LTP còn liên quan đến quá trình hình thành tầng cutin của tế bào thực vật, làm tăng khả năng chống chịu và hạn chế tác hại của stress muối và stress hạn.

LTP thuộc họ gen pathogenesis relate, có khả năng tổng hợp ra protein thúc đẩy quá trình vận chuyển phospholipid giữa các màng. Khi gặp các điều kiện cực đoan của môi trường, các nhân tố như hormone, các quá trình trao đổi ion, các con đường truyền tín hiệu… sẽ điều khiển gen LTP hoạt động và tổng hợp nên các sản phẩm protein tương ứng. LTP có thể hỗ trợ việc tạo ra các lớp sáp hoặc lớp biểu bì giúp thực vật bảo vệ, phản ứng và đáp ứng lại những thay đổi của môi trường [23], [25].

Trình tự các amino acid suy diễn của Vrltp1 và Vrltp2 đều có hai đoạn pentapeptide mang tính bảo thủ cao ở thực vật. Các tác giả cũng nhận thấy, khi gặp điều kiện bất lợi như stress hạn hay muối hoặc khi hàm lượng ABA ngoại bào quá cao sẽ làm tăng tốc độ phiên mã của mRNA Vrltp1 và Vrltp2. Từ đó đưa ra giả thuyết rằng gen LTP có ảnh hưởng rừ rệt tới sự phỏt triển cỏc mụ non và rất cú thể đúng vai trũ quan trọng trong sự thích nghi của thực vật trong điều kiện khô hạn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sau khi cây có 3 lá thật, tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn cho cây che không cho nước mưa có thể vào chậu thí nghiệm, thời điểm tiến hành thí nghiệm được thực hiện vào mùa khô từ tháng 9 đến tháng 11 âm lịch. Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng, protein khử hỗn hợp phosphomolipdate - phosphovonphramate (thuốc thử Foling - Ciocalteau). Dùng các dung dịch đệm phosphate citrate (pH = 10), NaCl 1M và nước cất để chiết protein tan có trong hạt.

Sau khi chiết bằng dung dịch đệm phosphate citrate (pH = 10), tiếp tục tiến hành chiết bằng dung dịch NaCl 1M và nước cất. Dịch chiết chứa protein hoà tan đem xác định hàm lượng cùng protein chuẩn là albumin huyết thanh bò theo phương pháp quang phổ hấp thụ bước sóng 750 nm với thuốc thử Foling. Hàm lượng protein được xác định dựa trên đồ thị chuẩn định lượng protein theo phương pháp Lowry (hình 2.2).

(1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm. Sau khi tách chiết và kiểm tra được độ tinh sạch của DNA tiến hành nhân gen LTP bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs (1985) với cặp mồi đặc hiệu được trình bày trong bảng 2.3. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X, với sự có mặt của marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm có kích thước khoảng 350 bp cho vào ống eppendort 1,5 ml. Chu trình nhiệt của phản ứng clony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR, chỉ thay đổi nhiệt độ gắn mồi là 540C. Sản phẩm clony-PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

Sau khi kiểm tra sản phẩm clony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.