Tiểu luận một số phương pháp dùng để định lượng protein

Protein đóng vai trò rất quan trọng, là thành phần không thể thiếu trong mọi hoạt động của cơ thể. Protein được tổng hợp từ nhiều nhóm nhỏ các amino axit, các axit này liên kết với nhau tạo thành dạng chuỗi. Cơ thể con người có thể tự tổng hợp và tạo ra các chuỗi axit amino, đó là những axit aminio không thể thiếu trong mọi chế độ ăn uống của chúng ta (kể cả trong chế độ ăn kiêng). Trong tất cả các tế bào của động, thực vật đều có chứa hàm lượng protein nhất định, số lượng và chất lượng protein đều rất đa dạng, tuỳ thuộc vào từng loài khác nhau. Các thực phẩm có chứa hàm lượng protein cao, có chứa đủ lượng amino axit rất cần thiết cho mọi đối tượng. Chúng được xem như là các protein có lợi, có nhiều trong thịt, cá, trứng. Ngược lại các loại thực phẩm có hàm lượng protein thấp, chứa một lượng nhỏ amino axit, chúng thường có nhiều trong các loại thực vật như đậu hà lan, lạc hay các loại hạt. Có thể tóm tắt các chức năng chủ yếu của protein như sau:•Protein là thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào, đặc biệt là cấu trúc nên màng tế bào.•Protein enzyme là chất xúc tác sinh học, xúc tác các phản ứng hoá sinh xảy ra trong tế bào nên có vai trò quyết định quá trình trao đổi chấtnăng lượng của cơ thể.•Protein của nguyên sinh chất có vai trò điều tiết các hoạt động sống xảy ra trong cơ thể. Nó quyết định các tính chất của nguyên sinh chất.

Protein đóng vai trò rất quan trọng, là thành phần không thể thiếu trong mọihoạt động của cơ thể Protein được tổng hợp từ nhiều nhóm nhỏ các amino axit, cácaxit này liên kết với nhau tạo thành dạng chuỗi Cơ thể con người có thể tự tổnghợp và tạo ra các chuỗi axit amino, đó là những axit aminio không thể thiếu trongmọi chế độ ăn uống của chúng ta (kể cả trong chế độ ăn kiêng) Trong tất cả các tếbào của động, thực vật đều có chứa hàm lượng protein nhất định, số lượng và chấtlượng protein đều rất đa dạng, tuỳ thuộc vào từng loài khác nhau Các thực phẩm

có chứa hàm lượng protein cao, có chứa đủ lượng amino axit rất cần thiết cho mọiđối tượng Chúng được xem như là các protein có lợi, có nhiều trong thịt, cá, trứng.Ngược lại các loại thực phẩm có hàm lượng protein thấp, chứa một lượng nhỏamino axit, chúng thường có nhiều trong các loại thực vật như đậu hà lan, lạc haycác loại hạt Có thể tóm tắt các chức năng chủ yếu của protein như sau:

• Protein là thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào, đặc biệt là cấu trúc nênmàng tế bào

• Protein - enzyme là chất xúc tác sinh học, xúc tác các phản ứng hoá sinh xảy

ra trong tế bào nên có vai trò quyết định quá trình trao đổi chất-năng lượng của cơthể

• Protein của nguyên sinh chất có vai trò điều tiết các hoạt động sống xảy ratrong cơ thể Nó quyết định các tính chất của nguyên sinh chất

• Nhiều loại protein có chức năng vận chuyển như hemoglobin vận chuyểnO2 trong máu, các chất làm nhiệm vụ vận chuyển qua màng

• Protein trong cơ có vai trò vận động

• Nhiều loại protein là các loại kháng thể được tạo ra trong cơ thể đề kháng lạicác kháng nguyên gây bệnh giúp cho cơ thể miễn dịch với bệnh tật

• Một số protein là hoocmon như insulin có vai trò quan trọng trong điều tiếthoạt động sinh lý của cơ thể (như insulin điều chỉnh lượng glucose trong máu ổnđịnh ở 1%)

Protein tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như đạm hữu cơ, đạm vô cơ Để xácđịnh được chúng thì hiện nay có nhiều phương pháp nhưng tùy theo đối tượng khảosát và tùy theo chiều hướng muốn khảo sát người ta áp dụng từng phương phápthích hợp có thể trực tiếp hoặc gián tiếp.

Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định lượng protein,cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể

I Định luợng Nitơ tổng số bằng phuơng pháp KJELDAHL

1 Nguyên tắc:

- Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng số và kết quảnhân với hệ số

- Trong phân tử protein, hàm lượng nitơ chiếm tỉ lệ 15- 18% khối lượng phân

tử Do đó nếu xác định được hàm lượng % nitơ trong nguyên liệu, tùy theo mỗi loạiprotein mà ta nhân với hệ số khác nhau

• Hàm lượng protein động vật: % protein = % N protein x 6,25

• Hàm lượng protein thực vật: % protein = % N protein x 6,25đối với hạt ngũ cốc; % protein = % N protein x 5,75 đối với hạt đậu đỏ

- Trong thực tế bên cạnh protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơnhư: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric Các chất này gọi là nitơ phi Protein Vìvậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein sau đóxác định nitơ Protein

• Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

• Nitơ protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi protein

Hình 2 Johan Gustav Christoffer Thorasager Kjeldahl (1849-1900), nhà hoá học người Đan Mạch Hình1

Bộ chưng cất Kjeldahl

- Dưới tác dụng của H2SO4 đặc, nhiệt độ cao nitơ có trong thành phần các hợpchất hữu cơ tạo thành (NH4)2SO4 Dùng kiềm đặc, đầy nitơ ra khỏi muối của nódưới dạng NH3 kết hợp với hơi nước tạo thành NH4OH Lượng nitơ có trong thànhphần NH4OH được xác định bằng hệ chuẩn H2SO4- NaOH hoặc H3BO3- H2SO4

0,01N

- Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bịphân huỷ và oxy hoá đến CO2 và H2O còn nito chuyển thành amoniac (NH3) và tiếptục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat

 Quá trình được thực hiện theo các bước sau :

Bước 1: Vô cơ hoá nguyên liệu

2 Hóa chất và nguyên liệu:

- Thuốc thử hỗn hợp: xanh metylen 0,1% và đỏ metylen 0,1% trong ethanol

960 với tỉ lệ 1/2; H2SO4 đặc; hỗn hợp xúc tác K2SO4/CuSO4 với tỉ lệ 3/1; H2SO4

0,01N; NaOH 0,01N; H3BO3 2%; ethanol 960; axit trichloacetic (TCA) 20% Cácnguyên liệu có nguồn gốc động vật như thịt, cá, nguồn gốc thực vật như gạo, ngô,đậu đỗ, sấy khô tuyệt đối ở 1050C

3 Dụng cụ:

- Ống đong 100ml, 50ml, 10ml; bình định mức 100ml; cốc 250ml, 100ml,50ml, đũa thủy tinh; lọ đựng hóa chất; máy Microkjeldahl bán tự động hoặc tựđộng; bếp đun; ống sinh hàn

- Trong khi đun theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khithấy dung dịch có màu trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ởtrên thành bình chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch Tiếp tục đun cho đến khidung dịch trong hoàn toàn Để nguội bình, chuyển dung dịch sang bình định mức100ml, dùng nước cất tráng lại bình kjeldahl và dẫn tới vạch

- Giai đoạn cất đạm theo phương pháp dùng hệ chuẩn H2SO4 - NaOH:

• Cho nước cất 1 lần tới 2/3 thể tích của bình, cắm điện đun sôi nước trongbình Hơi nước và nhiệt độ của bình 1 giúp cho nitơ trong (NH4)2SO4 của dịchnghiên cứu bị NaOH 30% đẩy ra dưới dạng NH3 NH3 được ngưng tụ nhờ hệthống làm lạnh và hơi nước tạo thành NH4OH Sau khi nước trong bình đã sôi,

cho vào bình hứng 10ml H2SO4 0,01N và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp, dung dịchtrong bình nón sẽ có màu tím hồng chứng tỏ môi trường axit Đặt bình hứng vàogiá đỡ sao cho đầu mút của ống sinh hàn ngập trong dung dịch của bình hứng.

• Nếu lương axit trong bình hứng không đủ ngập, có thể cho thêm vào một ítnước cất vô đạm

• Cho vào bình cất 10ml dung dịch nghiên cứu và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp,sau đó tráng phễu bằng nước cất vô đạm Cho tiếp vào bình cất 15ml NaOH30% rồi đóng chặt van lại Dung dịch trong bình cất chuyển từ màu tím hốngsang màu xanh lá mạ thể hiện môi trường kiềm Sau 8-10 phút cất đạm, để kiểmtra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử dung dịch ở đầu ốngsinh hàn Nếu giấy quỳ còn màu xanh thì phải cất đạm tiếp, nếu giấy quỳ khôngđổi màu thì quá trình cất đạm đã xong, lấy bình hứng đem chuẩn độ

- Chuẩn độ: Dùng NaOH 0,01N chuẩn độ cho tới khi dung dịch trong bìnhhứng chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh lá mạ Lượng NaOH 0,01N dùng đểchuẩn độ bằng H2SO4 0,01N còn dư trong bình hứng

- Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số hay nitơ toàn phần được tính theocông thức :

N% = 1,42 x (V1 – V2) x 100 / a Trong đó

• a : là số nguyên liệu tính bằng gam của mẫu cất đạm

• Sau khi tính được nitơ tổng số, đem kết quả đó nhân với hệ số tương ứng sẽcho ra hàm lượng protein trong nguyên liệu

II Định lượng protein bằng phương pháp so màu

1 Định lượng protein bằng phương pháp Biure

- Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Albumin tiêu chuẩn 1%

- Chuẩn bị thuốc thử Biure: cân chính xác

 Lập đồ thị chuẩn

Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:STT Protein1%(ml) H2O(ml)

Nồng độProtein(mg/ml)

Thuốc thửBiure (ml) OD

- Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Đem đo

độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang

- Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắcđều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó đem đo mật độ quang ở bướcsóng 540nm Ghi mật độ quang

d Độ nhạy và khả năng ứng dụng

- Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phươngpháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng proteintương đối lớn 20-2000 µg/ml

2 Định lượng protein hoà tan theo Lowry (Biure cải tiến)

a Nguyên tắc

- Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợpphotphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chấtmầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm

- Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trongmột phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta

có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N

- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml

c Cách tiến hành

- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thíchhợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10phút Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần,lắc đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh datrời và đạt đến cường độ mầu cực đại Đem so mầu của hỗn hợp trên máy so mầuquang điện ở bước sóng 660nm Xác định được trị số mật độ quang học của dungdịch nghiên cứu Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình.

- Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch

C và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm

d Xây dựng đường đồ thị chuẩn

- Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương phápLowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn

- Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, tađược dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằngnước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µ g/ml để tiến hành xây dựng đồ

thị chuẩn

- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãngnhư trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độphòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng660nm

- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2mldung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm

 Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lýtheo phương pháp thống kê thông thường

Ta có phương pháp hồi quy

y = 0,55066844x + 0,01791961

Hình 6: Hàm lượng protein

Hình 6 : Đường đồ thị xác định nồng độ Protein theo phương pháp Lowry

 Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫunghiên cứu

e Độ nhạy và khả năng ứng dụng

- Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịchmẫu chứa vài chục µg protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5-2000 µg protein.Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứaacid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì tạokết tủa ảnh hưởng đến kết quả

3 Định lượng protein theo Bradford

- Hàm lượng protein huyết thanh có thể được định lượng theo phương phápBradford (1976)

a Nguyên tắc

- Dựa vào phản ứng của protein với xanh Coomassie (Coomassie BrilliantBlue G-250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm Trong môitrường acid Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác

mg

với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làmdung dịch có màu xanh Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.Dựa vào đường chuẩn của protein suy ra hàm lượng protein trong mẫu.

Hình 7: Phản ứng cho màu Coomassine

- Pipet man (Hãng Gilson – Pháp)

- Máy đo quang phổ Shimadzu UV – 200s (Japan)

c Cách tiến hành

 Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA): 1,8mldung dịch protein chuẩn có chứa từ 5 – 40mg BSA trong nước cất được đưa vàocóng đo nhựa.

- Thêm 0,6 ml dung dịch màu, lắc đều để 5 phút cho phản ứng xẩy ra ở nhiệt

độ phòng

- Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm sau 2 phút

- Dung dịch mẫu trắng (Blank) được chuẩn bị từ 1,8ml nước cất và 0,6 ml chấtthử màu

- Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD 595nm.Đường cong tiêu chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong cácmẫu chưa biết, cũng được xây dựng tương tự theo phương pháp Lowry

 Định lượng protein của mẫu

- Các mẫu có chứa từ 1 – 10 mg protein trong 1,8 ml H2O được đưa vào cóngnhựa

- Thêm vào 0,6ml dung dịch mầu lắc đều

- Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm

- Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein trong mẫu theo công thức

X(mg) =

1000

a V C

thời giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử Tuy nhiên phương pháp nàykhông dùng với những chất có chứa surfactants vì gây kết tủa của các phản ứng.Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả Màucoomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độquang.

III Định lượng protein bằng phương pháp dùng Bicinchoninic Acid (BCA)

1 Nguyên tắc

- Dựa vào phản ứng giữa protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạomàu đỏ tía (tím) có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 562nm

Hình 8: Phản ứng cho acid bincinchoninic (BCA)

- Đầu tiên protein sẽ khử Cu2+ thành Cu+ và tạo thành phức có màu xanh trongmôi trường kiềm Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu+ được tạo ra ở trêncho màu đỏ tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm

- Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure Nó phát hiệnprotein tương đối lớn 20-2000 µg, nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng CU

dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơtrong phân tử có aminoacid, cystine, cystein, tyrosine, trytophan cũng bắt màu vớiBCA làm ảnh hưởng đến kết quả

IV Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ

- Nguyên tắc của phương pháp này là các axit amin acid thơm như trytophan,tyrosine và phenylalanine trong chuỗi pholypeptit có phổ hấp thụ cực đại ở bướcsóng 280nm

1 Cách tiến hành

- Nguyên liệu: dung dịch protein để đo, đệm hòa tan protein

- Thiết bị: máy đo quang phổ UV có cuvet thạch anh đường truyền sóng là1cm

Quá trình gồm các bước sau:

• Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trongthể huyền phù Lấy dịch nổi để xác định mật độ quang học

• Bước 2: Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấpthụ về 0 với cuvet chứa đệm

• Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu Nếu giá trị được > 2,0 thì phaloãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường truyền ánh sáng ngắn hơn (2mm) chođến khi số đọc được nằm trong khoảng 0,5 đến 1,5

• Bước 4: Lặp lại bước 2 và 3 ở bước sóng 260nm

• Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm Tỉ số này nên nhỏ hơn 0,6 Nếulớn hơn 0,6 thì protein không sạch có lẫn các tạp chất khác đặc biệt với acidnucleic

2 Tính kết quả

- Sử dụng BSA làm chất chuẩn, biết rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA cónồng độ 1mg/ml sẽ có mật độ quang học là OD = 0,67 Dựa vào đó có thể xác địnhhàm lượng protein trong các mẫu thí nghiệm theo công thức sau:

Y(mg) =

67,0

.]

2 Lựa chọn các protein tiêu chuẩn cần có cấu trúc tương tự như cấu trúc củacác protein cần đo xét nghiệm ở mẫu nghiên cứu vì các protein thường có hệ số tắtkhác nhau ở bước sóng 280nm (Hệ số tắt biểu thị bằng sự hấp thụ của dung dịch1% protein đối với một tia sáng có bề dày 1cm) Thêm vào đó, các protein có cấutrúc khác nhau cũng cho khả năng tạo phản ứng mầu khác nhau với các thuốc thửtạo mầu như thuốc thử folin – ciocalteu, coomassie brilliant blue G 250

Sau đây là bảng cho các giá trị hệ số tắt (E1280% , nghĩa là sự hấp thụ của dungdịch 10mg protein/ml ở bước sóng 280nm) đối với một số loại protein khác nhau:Bảng 2: Hệ số tắt của một số protein ở bước sóng 280nm (theo Fashman, 1976)

3 Nếu chưa biết hệ số tắt của protein, hoặc dung dịch gồm hỗn hợp của một

số dạng protein thì nồng độ protein tổng số có thể được tính theo phương trình sau:  Nồng độ protein, tính theo

mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260

Trong đó:

• A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm

• A260 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm

4 Nếu tỉ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein đã lẫn(nhiễm) axit nucleic, các peptit, chất tẩy rửa hoặc chất kháng khuẩn azit natri(NaN3) Trường hợp này cần sử dụng phép đo nồng độ protein theo kỹ thuật Lowryhoặc Bradford

5 Dung dịch protein có nồng độ thấp hơn 0,1mg/ml thường cho kết quảkhông chính xác

3 Độ nhạy và khả năng ứng dụng

- Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch.Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp(dưới 0,05-0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng