báo cáo tham quan thực tập xí nghiệp chế biến phế thải cầu diễn

Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzym ứng dụngtrong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụngTrehalase là enzym được sử dụng để sản xuất Trehalose

MỞ ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển nên vấn đề sức khỏe của con người ngàycàng được quan tâm Do đó các sản phẩm thực phẩm không ngừng được cảitiến nâng cao chất lượng, mẫu mã sản phẩm cũng ngày càng đa dạng Khinhững thành tựu về y học, hóa sinh học, sinh lý học và dinh dưỡng học đượcsoi sáng thì những thực phẩm ăn kiêng, thực phẩm điều trị bệnh, thực phẩmchức năng ra đời

Ngày nay thực phẩm chức năng đang được con người đặc biệt quan tâm

vì đây là những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp,nhưng trong đó lại chứa các hoạt chất có nhiều tác dụng tốt đối với sức khỏecon người Trong nhóm thực phẩm chức năng, đường chức năng là một bộphận quan trọng Có nhiều loại đường chức năng như: đườngParatinose, maltitol, sorbitol, Fructooligosaccharide (FOS), Trehalose Trong

số đó đường Trehalose là một loại có nhiều công dụng đối với cuộc sống conngười, đặc biệt đối với những người mắc bệnh tiểu đường, béo phì, sâu răng

và một số bệnh lý khác

Bên cạnh đó, công nghệ sinh học phân tử cũng đã phát triển nhanhchóng, đạt được những thành tựu to lớn về lý thuyết và thực tiễn Sự pháttriển không ngừng của sinh học phân tử giúp cho con người hiểu biết cơ sởkhoa học một số bệnh nan y, tìm ra các loại thuốc giúp cho con người chốnglại các bênh tật và nâng cao sức khỏe đời sống Thành tựu công nghệ sinh họcphân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệpđặc biệt là các sản phẩm chức năng

Cùng với sự phát triển của đường chức năng, các loại enzym ứng dụngtrong lĩnh vực này cũng ngày được quan tâm nghiên cứu và ứng dụngTrehalase là enzym được sử dụng để sản xuất Trehalose là nhân tố điều chỉnhquá trình đông lạnh, ngăn ngừa quá trình kết tinh, cung cấp giá trị dinh

dưỡng Do vậy nghiên cứu sản xuất Trehalase là enzym được sử dụng để sảnxuất Trehalose là nhu cầu cần thiết Đặc biệt trên thị trường Việt Nam hiệnnay chủ yếu nhập chế phẩm này từ nước ngoài nên giá thành tương đối cao.

Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzym Trehalase không chỉ có ý nghĩa khoahọc mà còn có giá trị kinh tế xã hội

Mặt khác, một số chủng vi sinh vật tích lũy các chất hoạt tính sinh họchoặc enzym, kháng sinh cao cũng được ứng dụng ở quy mô lớn mang lại

thành tựu và lợi ích kinh tế rất lớn cho con người như chủng Bacillus s.p, Bacillus Licheniformic, Bacillus sterothermophilus, đều có khả năng sinh

tổng hợp Trehalase

Nhưng bằng cách nào đó ta có thể thu được Trehalase? Làm cách nào

để chủng vi sinh vật Bacillus sterothermophilus có thể sinh tổng hợp

Trehalase? Cấu trúc, đặc tính, các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động củaTrehalase hay các điều kiện tối ưu cho hoạt động của Trehalase như thế nào?

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới và Việt Nam

I.1 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym trên thế giới

Enzym có vai trò vô cùng quan trọng, không chỉ xúc tác cho các phảnứng hóa học xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi hệ thống sốngchúng vẫn có thể xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (intro) Bởi vậy, côngnghệ enzym ngày càng phát triển Những thành tựu cơ bản về enzym là cơ sở

để phát triển các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tiễn

Hàng năm, hàng trăm tấn chế phẩm enzym được sản xuất phục vụ chongành công nghiệp và y học Năm 1980, trên thế giới sản xuất 530 tấnprotease từ vi khuẩn, 350 tấn glucoamylase, 320 tấn  – Amylase, 70 tấnglucoisomerase, tất cả trị giá 150 triệu USD

- Amylosidase: sản xuất với sản lượng 5 tấn /năm sử dụng để tách acid amin khỏi hỗn hợp DL axit amin (250 tấn L axit amin trên năm)

L Amyloglucosidase: sản lượng 1 tấn /năm, sản xuất 3000 tấn glucose từtinh bột/năm

- Glucoisomerase: sử dụng để sản xuất xiroglucose – fructose 42%(2.150.000 tấn /năm) và xiroglucose- fructose 55% (1.450.000 tấn/năm)

Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng với 4mục đích chính:

-Điều chỉnh những khiếm khuyết của nguyên liệu Trong công nghiệpchế biến đường, tinh bột, bánh mỳ, bia… người ta bổ xung Amylase để bùhoạt lực enzym yếu của nguyên liệu ngũ cốc Trong sản xuất fomat, enzymlipase và protease được sử dụng thay thế các enzym từ nguyên liệu sữa bị vôhoạt để thanh trùng

- Tham gia chuyển hóa, ứng dụng nhiều nhất trong sản xuất bánhbisque, fomat, nước uống … protease cho phép cải thiện tính lọc của bia vàtính năng ổn định của nó ở nhiệt độ thấp Amylase, pectinase, hemicellulasetạo điều kiện cho việc tách chiết và lọc nước quả Protease trung tính làmmềm dẻo khung gluten cải thiện độ nở của bột nhào và độ giòn của bisque.

-Tăng giá trị nguyên liệu tự nhiên Sự phát triển của công nghệ enzym

đã cho ra đời một loạt các chế phẩm enzym cho phép tạo ra nhiều sản phẩm:chất làm đặc, chất thơm, chất tạo ngọt, chất tạo chua… việc cải thiện đặc tínhcủa enzym về tính đặc hiệu và tính chịu nhiệt là cơ sở để sản xuất chế phẩmenzym mới thích hợp môi trường và đặc hiệu hơn

- Cải thiện chất lượng sản phẩm: các enzym sử dụng để loại bỏ các chất

tự nhiên có ảnh hưởng xấu tới tính chất cảm quan của thực phẩm Chế phẩmenzym còn cho phép tạo hương vị, màu sắc sản phẩm như lipase trong sảnxuất fomat, lactase trong sản xuất sữa

Trong công nghiệp thực phẩm, protease được dùng để làm mềm thịt,công nghiệp bánh mỳ, enzym dịch vị 9 chủ yếu là chimosin thu được từ dạdày bò được sử dụng để sản xuất fomat, papain từ nhựa đu đủ để làm mềmthịt

Enzym trong công nghiệp thực phẩm chủ yếu sử dụng để sản xuấtđường tinh bột Đầu tiên người ta sử dụng hai enzym - Amylase và -Amylase để sản xuất mật từ tinh bột, sản phẩm này chứa dextrin, glucose vàmaltose được dùng nhiều trong công nghiệp bánh kẹo Glucose được sản xuấtnhờ - Amylase và - Amylase, tuy nhiên glucose dùng trong thực phẩm cónhược điểm độ ngọt thấp chỉ vào khoảng 0.8 lần đường kính vì vậy nó đượcdùng chủ yếu cho y dược

Năm 1998, tổng lượng đường tiêu thụ trên thế giới là 10 triệu tấn thìriêng Mỹ tiêu thụ 4.2 tấn Fructose (bao gồm cả xirogluco – fructose), nhật là

800.000 tấn, EU là 2 triệu tấn, Canada 300000 tấn, Đông Âu 200000 tấn, cácnước đang phát triển là 500000 tấn.

Sau công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzym được sử dụng trongcông nghiệp, nông nghiệp, dược phẩm, y tế, chế biến thức ăn gia súc Đặchiệu việc sử dụng enzym của các hệ vi sinh vật trong nước thải trong côngnghiệp xử lý môi trường ngày càng được nghiên cứu khai thác sử dụng

Trong công nghiệp dệt, Enzym từ nước chiết Malt và Pancrease được

sử dụng để rũ hồ Năm 1971, sử dụng enzym Amylase của Bacillus subtilis rũ

hồ ở nhiệt độ cao, rút ngắn thời gian

Trong công nghiệp bột giặt và tẩy rửa, các chế phẩm enzym được sửdụng là protease, lipase, cellulose, amylase, oxydoreductase tăng vận tốc vàhiệu quả quá trình tẩy rửa Một số enzym được bổ xung vào các loại xà phòng

và kem dưỡng da, thuốc đánh răng như bromelin, collagenase, lipase…cácenzym này có tác dụng tẩy hôi, tẩy các vết bẩn bám trên da khá tốt, đồng thờilàm mịn và tăng độ đàn hồi cho da

Trong nông nghiệp, enzym dùng để sản xuất thức ăn cho động vậtnhằm tăng giá trị thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng cho thức ăn Các enzym sửdụng với mục đích này là các enzym thủy phân như amylase, protease, đặchiệu là celluloase và hemicelluloase Chúng thủy phân các chất có phân tử lớnthành dạng dễ hấp thụ hơn thường làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn

Sự phát triển của y học phản ánh sự lớn mạnh của tiềm năng enzym.Ngay từ thế kỷ 19 enzym tụy tạng được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêuhóa Enzym tripsin, chymotripsin sử dụng để làm tiêu viêm, lành vết thương,vết bỏng, viêm phổi, viêm khí quản Tipsin chữa bệnh viêm tĩnh mạch huyếtkhối, viêm tụy Chymotripsin chữa bệnh loét dạ dày tá tràng Một số enzymtiêu hóa được sử dụng để chữa bệnh suy dinh dưỡng ở trẻ em, người già vàngười bệnh như pepsin (từ dạ dày lợn) Ngày nay, một số thuốc tổng hợp hóahọc đã lần lượt được thay thế bằng các quá trình enzym nhờ những ưu điểm

của nó Ví dụ việc sản xuất Pinicillin bán tổng hợp nhờ enzyme penicillinacylase để sản xuất hai dẫn xuất ban đầu 6- APA và 7 – ADCA, từ đó tổnghợp lên kháng sinh thế hệ II, III, IV, V Cùng với sự phát triển của kỹ thuậtgen và lai tạo tế bào, người ta đã sản xuất được những chất mà cơ thể sống chỉ

có thể tổng hợp được với lượng cực nhỏ như interferon, hormone sinh trưởngngười, isulin, vaccine… Ngoài việc nghiên cứu enzym trong y học lâm sàng

và trong điều trị học, người ta còn nghiên cứu sự phát triển của enzym trong

cơ thể từ giai đoạn bào thai cho đến lúc già Bởi vậy ngày nay enzym học cònđóng vai trò quan trọng trong di truyền học phân tử, trong nghiên cứu quátrình tiến hóa của các giống nòi và trong nhiều lĩnh vực khác

I.2 Tình hình sản xuất và ứng dụng enzym ở Việt Nam.

Việc nghiên cứu và ứng dụng enzym ở Việt Nam chỉ mới được tậptrung chú ý trong vài thập kỷ trở lại đây Cho đến nay Việt Nam chưa có mộtenzym nào được sản xuất ở quy mô công nghiệp mà mới chỉ dừng lại ở quy

mô nhỏ, phạm vi phòng thí nghiệm của các trường đại học, các viện nghiêncứu

Những chế phẩm enzyme được sử dụng rộng rãi nhất ở nước ta hiệnnay là amylase chủ yếu dùng trong công nghiệp sản xuất rượu bia, đườngglucose, đường nha, công nghiệp dệt…Enzyme phân giải protein (protease)tăng độ bền ngọt của bia, công nghiệp chất tẩy rửa, nước chấm, y học…

Một số enzyme (chủ yếu nhập từ nước ngoài) được sử dụng rộng rãitrong việc nâng cao chất lượng sản phẩm và đa dạng hóa sản phẩm sữa

Các chế phẩm protease (dùng trong công nghiệp sản xuất nước chấm,chế biến thịt cá) và prozimabo (y học) là các chế phẩm có nguồn gốc từ thựcvật

Sản lượng chế phẩm enzyme tiêu thụ hàng năm khoảng 100-300tấn/năm Tuy nhiên, việc sử dụng enzyme trong các ngành công nghiệp ở

nước ta còn ở dạng tiềm năng, do vậy trong những năm tới khả năng ứngdụng của enzyme còn được khai thác và mở rộng ra nhiều lĩnh vực khác: xử

lý rác thải sinh hoạt và rác công nghiệp, sản xuất bột dinh dưỡng trẻ em, sảnxuất chế phẩm probiotic, prebiotic…

I.3 Enzyme Trehalases

I.3.1 Giới thiệu về enzyme Trehalase

Trehalase là enzyme phân bố rộng rãi trong tự nhiên Nó được dùngkhá phổ biến trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác

Trehalase là một loại enzyme glycoside hydrolase có tác dụng xúc táccho quá trình chuyển đổi trehalose thành glucose Nó được tìm thấy trong hầuhết các động vật Trehalose là đường đôi không khử (α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside) là một trong những nguồn carbohydrate quantrọng nhất xuất hiện trong hầu hết các loại sinh vật, trừ lớp động vật có vú.Disaccharide được thủy phân vào 2 phân tử glucose bằng enzyme Trehalase

Có 2 loại Trehalase được tìm thấy trong Saccharomyces cerevisiae (nấm men), là Trehalase trung tính (NT)và Trehalase axit (AT) được phân loại dựa

vào độ pH của chúng [4] NT có độ pH là 7.0 trong khi AT là 4.5

Theo báo cáo mới đây, hơn 90% AT hoạt động trong S cerevisiae làngoại bào và tách ngoại bào Trehalose thành glucose trong môi trường chấtbao

I.3.2 Trehalase trong vi khuẩn

Trehalose được tìm thấy như tích lũy carbonhydrate trong

Pseudomonas, Bacillus, Rhizobium và trong rất nhiều khuẩn tia và là nguyên

nhân của khả năng kháng khuẩn Hầu hết các enzyme Trehalase tách biệt vớicác vi khuẩn có độ pH từ 6.5 đến 7.5

Enzyme Trehalase của Mycobacterium là một màng protein bị ràng buộc Tế bào chất Trehalase của Escherichiacoli K12 được kích thích bở sự

tăng cao trong nồng độ thẩm thấu Sự thủy phân của Trehalose thành glucosediễn ra trong bào chất, và sau đó glucose được chuyển vào các tế bào vikhuẩn Một tế bào chất Trehalase khác cũng được tìm thấy từ E.coli Gen mãhóa tế bào chất Trehalase có tính đồng đẳng cao với Trehalase tế bào chất

I.3.3Trehalase trong thực vật

Trong thế giới thực vật, mặc dù Trehalose được tìm thấy từ rất nhiều

loài cây không hoa bao gồm Selaginella lepidophylla và Botrychium lunaria;

đường rất hiếm trong cây có mạch và chỉ được tìm thấy trong quả chín của

các loại thuộc Apiaceae và trong lá cây của thực vật hạt kín có khả năng chịukhô hạn như Myrothamnus flabellifolius

Tuy nhiên enzyme Trehalase lại phổ biến trong các loại cây Điều nàyrất khó hiểu vì tuy thiếu cơ chất nhưng Trehalase lại có mặt ở các loại thựcvật bậc cao Không có sự chứng minh rõ ràng nào về vai trò hoạt động củaTrehalase trong thực vật Tuy nhiên có nhiều ý kiến cho rằng Trehalases cóthể đóng vai trò trong cơ cấu kháng khuẩn hoặc enzyme có thể đóng vai tròtrong việc giảm lượng Trehalose có nguồn gốc từ vi sinh thực vật

I.3.4 Trehalase trong nấm men

Trong S.cerevisiae có ít nhất 2 enzyme Trehalase khác biệt được tìm

thấy Một loại được điều hòa bởi cAMP-phụ thuộc phosphorylation Hoạtđộng của loại enzyme này được tìm thấy trong dịch bào tương Loại enzymehoạt động thứ hai được tìm thấy trong các không bào của 12 vi sinh vật tươngứng Nồng độ pH của Trehalase dịch bào tương vào khoảng 7.0 do đó nóđược cho vào cùng loại với Trehalase trung tính Trong khi đó, enzymeTrehalase không bào được cho rằng có khả năng hoạt động tốt nhất tại độ pH

khoảng 4.5 và được coi là Trehalase axit Hai loại enzyme này mã hóa bởi hailoại gen khác nhau là NTH1 và ATH1

I.3.5 Thủy phân Trehalose

Một phân tử Trehalose được thủy phân thành 2 phân tử glucose bằngenzyme Trehalase Thủy phân enzyme của Trehalose lần đầu tiên được tiến

hành vào năm 1893 tại Aspergillus niger bởi Bourquelot Fischer đã thấy được phản ứng này trong S cerevisiae vào năm 1895 Kể từ lần thủy phân

enzyme Trehalose đó, Trehalase (α, α-trehalose-1-C-glucohydrolase, EC3.2.1.28) đã được tìm thấy trong rất nhiều sinh vật bao gồm động vật và thựcvật Thủy phân Trehalose bằng enzyme Trehalase là một quá trình sinh lýhọc quan trọng của nhiều loại sinh vật như nảy mầm bào tử nấm, côn trùngbay và tăng trưởng lại trong tế bào không hoạt động tích cực

I.4 Tổng quan về đường chức năng Trehalose

I.4.1 Trehalose

Trehalose là một đường tự nhiên với chức năng tương tự như đườngsucrose nhưng ổn định hơn và có vị ngọt nhẹ hơn Trehalose là đường đa chứcnăng, vị ngọt nhẹ của nó (45% sucrose)

Hình 1: Biểu đồ hàm lượng đường trehalose, maltose, glucose, sucrose

Thành phần các chất dinh dưỡng trong đường Trehalose:

Hình 2: Công thức cấu tạo của trehalose

Hình 3:Sơ đồ phản ứng enzyme

I.4.2 Ảnh hưởng của Trehalose lên cơ thể sống

I.4.2.1 Ảnh hưởng của Trehalose đến sự chuyển hóa hydratcacbon

Trehalose không hoặc rất ít bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột nênkhi ăn lượng đường hòa tan trong máu không bị biến động Trong gan, hoạtlực của enzyme trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhưng sẽ được bình thườnghóa bởi sự cung ứng Trehalose Như vậy, Trehalose có vai trò khá tích cựctrong việc phòng và chữa bệnh tiểu đường xét về góc độ bệnh lý liên quanđến sự gia tăng của lipoprotein trong máu Vì thế Trehalose hiện nay được

dùng nhiều như một chất thấp năng lượng đặc biệt dành cho các đối tượng bịbệnh tiểu đường.

Từ kết quả của một nghiên cứu khác cho thấy, đối với những ngườimắc bệnh tiểu đường, nếu mỗi ngày mỗi người ăn 8g trehalose, lượng đườngtrong máu sẽ giảm nhanh trong 14 ngày

I.4.2.2 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ canxi của Trehalose

Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng Trehalose có thể tăng cường sựhấp thụ canxi của tế bào Nhờ đặc tính này, Trehalose có thể giúp cho conngười phòng chống các bệnh về chuyển hóa và bệnh loãng xương

Quá trình thúc đẩy hấp thụ canxi của Trehalose xảy ra trong ruột già

Cơ chế thúc đẩy trên chưa được xác định rõ ràng nhưng các tác giả đều cómột kết luận chung là do ba yếu tố sau:

+ Đường Trehalose trong ruột già được các vi sinh vật sinh axit lênmen, làm giảm pH của môi trường, dẫn đến sự tái hòa tan của các muối canxi

+ Trong ruột già các vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môitrường có chứa Trehalose sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuếch tánvào tế bào biểu bì thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi

+ Sự dịch chuyển Trehalose trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyểncủa hợp chất canxi – protein, nhờ đó canxi được tiếp xúc nhiều hơn với các tếbào thành ruột, tạo điều kiện tốt cho sự hấp thu vào máu Ngoài canxi,Trehalose đồng thời còn thúc đẩy sự hấp thụ cả magie Điều này thúc đẩy quátrình phát triển xương, tăng cường hàm lượng canxi trong xương

I.4.2.3 Ảnh hưởng của trehalose đến hệ vi sinh vật trong khoang miệng

Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn streptococci đột biến và các liêncầu khuẩn gây nên Các vi sinh vật có rất nhiều trong khoang miệng củangười và động vật Khi đưa thức ăn vào chúng sẽ lựa chọn thành phần dinhdưỡng thích hợp dễ lên men, phát triển và gây bệnh Vì thế nếu trong thành

phần thức ăn của ta không chứa hoặc ít chứa chất thích hợp cho quá trình dinhdưỡng của loại vi sinh vật trên sẽ có thể ngăn ngừa được bệnh Để xét ảnhhưởng của Trehalose đến bệnh sâu răng người ta đã tiến hành thí nghiệm trên

cơ thể chuột Kết quả cho thấy nhóm chuột thí nghiệm (ăn đường Trehalose)

bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn Saccaroza)

Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môitrường Trehalose đã chứng tỏ cơ chế và khả năng phòng bệnh sâu răng của

nó Đó là do Trehalose không phải là môi trường thích hợp cho các vi sinh vậttrên phát triển

Ngoài ra Trehalose còn có khả năng chữa bệnh sâu răng Vì thế ngàynay trên thế giới người ta còn dùng Trehalose thay thế cho đường kính trongthành phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em

để phòng bệnh sâu răng

I.4.2.4 Tính kháng khuẩn của trehalose

Như chúng ta đã biết probiotic là những chế phẩm chứa nhiều vi sinh vật cólợi như lactobacillus và bifidobacteria Các vi sinh vật này có khả năng khángkhuẩn gây bệnh đi ngoài Hiện nay các chế phẩm probiotic bán trên thị trườngthường chứa nhiều đường Trehalose, bởi đường Trehalose có tác dụng là cơ

chất tốt cho sự phát triển của các vi sinh vật có lợi Chính sự có mặt và đónggóp vai trò tích cực trên người ta đã nói rằng đường Trehalose có khả năngkháng khuẩn (antibiotic)

Hình 4: Một số loại thực phẩm chứa TrehalosePhụ thuộc vào độ tinh khiết Trehalose thương phẩm chủ yếu có hai loại

là Trehalose có độ tinh khiết 45% và Trehalose có độ tinh khiết cao hơn 70%.Với độ tinh khiết 45% thường được dùng trực tiếp như một loại thực phẩmhoặc như một loại chất ngọt bổ xung trong chế biến các loại thực phẩm khác.Còn đường có độ tinh khiết cao hơn 70% thường dùng cho các đối tượng mắcbệnh, các đối tượng ăn kiêng Ngoài ra đường tinh khiết 100% dùng trongviệc phân tích hóa học

Đường Trehalose có nhiều đặc tính sinh học đáng quý, có hương vị vàtính chất hóa lý tương tự đường kính nên được sử dụng thay thế đường kínhtrong sản xuất các loại thực phẩm chứa đường như kẹo, bánh và bột dinhdưỡng trẻ em.v.v… Sản phẩm sau khi cải tiến này sẽ có giá trị cao về mặtdinh dưỡng cũng như chức năng phòng ngừa bệnh tật đồng thời hương vịcũng được cải tiến rất nhiều

Trên thế giới việc sử dụng đường Trehalose trong sản xuất các mặthàng chức năng như sữa, bánh kẹo, thức ăn cho người bệnh.v.v… Các sảnphẩm được bổ sung đầu tiên là bánh quy, sữa chua Ngày nay đã được dùngcho các sản phẩm đồ uống

Ngoài ra, Trehalose còn được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau.Đường có độ tinh khiết thấp có thể làm chất bổ sung trong môi trường nuôicấy một số vi khuẩn, loại có hàm lượng trung bình dùng cho người ăn trựctiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phântích

Trehalose cũng được sử dụng như một loại dược phẩm dùng nhiều chocác đối tượng người già, trẻ em và người bệnh trong thời kỳ phục hồi sứckhỏe để tăng cường hoạt động tiêu hóa, giúp cho các đối tượng trên nhuậntràng ăn tốt Trehalose có tính hòa tan cao

Hình 5: Tính hòa tan của Trehalose và Sucrose

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUII.1 Nguyên vật liệu và hóa chất

II.1.1 Giống vi sinh vật

Chủng giống vi sinh vật Escherichia coli DH5 alpha.

E.coli được nuôi cấy trong môi trường LB (Luria – Bertani) [1%tryptone, 0.5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 100µg/ml ampicillin đểlàm nhân tố chọn lọc

Na2CO3(Trung Quốc), potassium acetate (Hàn Quốc), Boric axit (TrungQuốc), HCl (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), TEMED (Trung Quốc),APS (Trung Quốc), Dithiotheritol (Hàn Quốc), Ethidumbromide (Hàn Quốc)

II.1.5 Máy móc và thiết bị

Máy li tâm (Trung Quốc), máy so màu quang điện, máy đo pH, máy lắc(Trung Quốc), bình ổn nhiệt (Trung Quốc), nồi hấp (Trung Quốc), máy khuấy

từ (Trung Quốc), máy siêu âm (Trung Quốc), cân điện tử (Đức), máy điện di(Trung Quốc), tủ sấy, box cấy (Trung Quốc), cân kỹ thuật (Mỹ), buồng điện

di DNA (Nhật), máy li tâm lạnh siêu tốc liên tục (Đức)

Và các dụng cụ cần thiết khác như bình tam giác, ống nghiệm, ốngeppendof, đầu côn xanh, đầu côn vàng, đĩa peptri, pipet thủy tinh và pipetnhựa, blank,…

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Biến nạp E.coli DH5 alpha bằng phương pháp sốc nhiệt

Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp tách ra từ tế bàothể cho sang thể nhận

Có nhiều phương pháp biến nạp được sử dụng như biến nạp bằng xungđiện, sốc nhiệt…Trong đó biến nạp bằng sốc nhiệt là phương pháp được sửdụng phổ biến hơn cả, đơn giản và cho hiệu quả cao Cơ chế biến nạp chủ yếubao gồm việc làm thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn để vi khuẩn có thểtiếp nhận DNA từ bên ngoài, phục hồi lại cấu trúc thành tế bào sau khi tiếpnhận DNA để vi khuẩn mang DNA ngoại lai có thể phát triển bình thường.Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai được gọi là các tế bào khảbiến

Nguyên tắc: Để biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn thì bề mặt tế

bào được xử lý CaCl2 để tăng hoạt tính tiếp nhận DNA Tạo hỗn hợp vi khuẩnvới DNA trong điều kiện lạnh sau đó đưa hỗn hợp vào tình trạng nhiệt độ cao(4oC) Sự phân chia tế bào vi khuẩn xảy ra, DNA tự tiếp xúc với tế bào vikhuẩn Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, ở sốc lạnh các DNA sẽ đi vào và

cố định trong tế bào vi khuẩn Hỗn hợp này được chuyển vào đĩa peptri chứamôi trường có bổ sung kháng sinh.

Quy trình biến nạp gồm 2 giai đoạn: tạo tế bào khả biến và biến nạp

Phương pháp tiến hành như sau:

+ Tạo tế bào khả biến DH5 alpha

Hoạt hóa tế bào E.coli trên môi trường thạch LB (1% w/v Bactotrypton; 0.5% w/v Bactoyeast extract; 0.5 % NaCl; 2% Agar) ở 37oC, 24 giờ.Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 5ml LB lỏng

Hình 6: Vi khuẩn E.coli trong LB rắn (khuẩn lạc)Môi trường LB lỏng: 1% w/v Bacto trypton; 0.5% w/v Bactoyeastextract; 0.5 % NaCl

Nuôi trên máy lắc (37oC, 12 – 14 giờ) Sau đó lấy 1% dịch nuôi cấytrên (50µl cho 50ml môi trường nuôi cấy LB) tiến hành lắc trên máy lắc 200 –

250 rpm ở 37oC để đạt được Abs 600 (khoảng 2 – 3 giờ) Tiếp đó chuyển dịch

nuôi cấy trên vào hai ống ly tâm 50ml và ly tâm ở 4oC tốc độ 5000 – 7000rpm trong 5 phút.

Sau khi ly tâm bỏ dịch trong phía trên và cho một nửa (12.5 ml) dungdịch 50mM CaCl2 Lắc nhẹ để làm tan cặn tế bào sau đó bảo quản 30 phúttrên đá Tiến hành ly tâm 6000 rpm trong 5 phút, bỏ dịch trong phía trên vàcho vào 1/10 thể tích (2.5 ml) dung dịch 100mM CaCl2 và làm tan hoàn toàncặn Để bảo quản dịch tế bào lấy 850 µl dịch tế bào với 150 µl 100% glycerolbảo quản trong nitơ lỏng

+ Biến nạp

Lấy 200 µl dịch tế bào trên cho vào ống eppendoff và bổ sung 1 µlDNA Sau đó để trên đá 30 phút rồi sốc nhiệt 2 phút ở 42oC Sau sốc nhiệt bổsung thêm 1ml LB và ủ ở 37oC trong 1h Sau đó lấy 100 – 200 µl dịch đã biếnnạp trên cấy trên môi trường thạch LB chứa kháng sinh (100ml LB, 100µlAmp) và để phát triển qua đêm ở 37oC

Tất cả các thao tác đều làm trong box cấy vô trùng, các dụng cụ đềuđược hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút

II.2.2 Tách DNA plasmide

DNA tái tổ hợp sau khi được biến nạp vào chủng DH5 alpha sẽ nhânlên thành nhiều bản sao cùng với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Sau đóvector tái tổ hợp được tách chiết ra khỏi DNA genom vi khuẩn bằng cách xử

lý với NaOH, SDS Trong điều kiện này, DNA genom của vi khuẩn ở dạngmạch thẳng có phân tử lượng lớn sẽ bị đứt gãy còn plasmid ở dạng mạch vòng

có kích thước phân tử nhỏ và bền vững nên sẽ không bị đứt gãy Protein vàtạp chất được loại bỏ bằng hỗn hợp Chloroform: iso – amyl alcohol DNAplasmid thu được nhờ quá trình kết tủa với cồn và muối CH3COONa Có rấtnhiều phương pháp tách plasmid như: tách plasmid bằng phương pháp kiềm,tách plasmid bằng phương pháp boiling

Phương pháp tiến hành: Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng, nhặt

một khuẩn lạc E.coli chứa plasmid từ đĩa petri nuôi cấy tế bào qua đêm vàoống nghiệm hoặc bình tam giác có chứa 5ml môi trường LB lỏng có bổ sungchất kháng sinh Ampicillin (nồng độ 100µg/ml) nuôi lắc qua đêm ở nhiệt độ

37oC, tốc độ 200 vòng/phút Thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong cáceppendoff 1.5ml Ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối loạidịch nổi Đồng nhất tế bào, cho 100µl Sol I vào trong ống eppendoff chứa tếbào, hòa tan tế bào bằng máy vortex

Dung dịch Sol I: 25mM Tris – HCl pH 8.0; 10mM EDTA pH 8.0;50mM glucose Dung dịch được khử trùng ở 126oC và được cất giữ ở 4oC

Phá màng tế bào, cho 200µl Sol II vào tiếp, dùng tay đảo ngược ốngeppendoff nhanh, nhẹ nhàng từ 3 – 5 lần

Dung dịch Sol II: 0.2N NaOH; 1% SDS

Cho 150µl Sol III vào tủa protein, dùng tay đảo nhẹ ống từ 3 – 5 lần.Dung dịch Sol III: 3M Potasium Acetate pH 5.5; acetic acid 11.5Mdung dịch được khử trùng và cất giữ ở 4oC

Sau đó ly tâm ở 4oC với tốc độ 10000 rpm/phút trong 20 phút Dùngpipet lấy dịch trong ở trên cho vào eppendoff mới (eppendoff được khử trùng)

bỏ cặn Lấy 600 - 800µl Isopropanol cho vào và lắc lên lắc xuống nhiềulần Đem ly tâm ở 4oC với tốc độ 12000rpm/phút trong 10phút Ta bỏ dịchphía trên đi, lấy cặn (DNA) Ta cho 500µl cồn 70% (cồn để lạnh) để rửaDNA, dùng pipet bơm lên, bơm xuống cho DNA tung ra Ly tâm lạnh ở

12000 rpm/phút trong 15 phút sau đó lấy hết cồn ra rồi thực hiện rửa cồn 1lần nữa Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng

Hòa tan DNA plasmid tách được trong 40µl dung dịch TE hoặc nướccất vô trùng Điện di mẫu kiểm tra mấu DNA plasmid trên gel agarose 0.8%

II.2.3 Xác định DNA biểu hiện ở E.coli trên gel Agarose

Nguyên tắc: Phương pháp điện di DNA trên gel agarose dựa vào đặc

tính tích điện âm của phân tử axit Nucleic ở pH trung tính nhờ các nhómphotphat nằm trên các cầu nối phosphodiester của axit Nucleic Khi được đặttrong điện trường, các phân tử axit Nucleic sẽ dịch chuyển về cực dương vớitốc độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng Các phân tử có kích thướclớn sẽ di chuyển chậm hơn các phân tử có kích thước bé Khả năng di độngcủa các phân tử axit Nucleic này còn phụ thuộc vào nồng độ gel Ở đây chúngtôi sử dụng gel agarose 0.8% Các axit Nucleic trong gel sẽ hiện hình dưới tia

tử ngoại (UV) nhờ hóa chất ethidium bromide

Phương pháp tiến hành: 0.8% agarose gel trong dung dịch đệm TBE

được đổ trên một giá thể nằm ngang (chuẩn bị gel agarose vào dung dịch đệmđun cho agarose tan hoàn toàn) Để nguội khoảng 50oC,cho 1µl ethidiumbromide vào rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược.Sau khoảng 30 phút, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di Đổ dung dịchchạy điện di là đệm TBE (40mM Tris HCl và 2 mM EDTA, pH 8.) vào bể đểdung dịch ngập cách mặt gel khoảng 2mm và tiến hành tra mẫu Trộn mẫu với1.5µl đệm màu xanh 1X – xanh Bromophenol Quá trình chạy điện di đượctiến hành dưới hiệu điện thế 100V, thời gian là 25 – 30 phút Sau khi chạyxong lấy bản gel ra và đem soi bằng tia tử ngoại UV 280 nm, plasmid DNA lànhững vạch màu da cam được so sánh với marker DNA ta xác định được kíchthước và độ tinh sạch của DNA

II.2.4 Phương pháp phá vỡ tế bào

Protein chiết xuất từ các tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng đặcbiệt đối với nghiên cứu trong các lĩnh vực hóa sinh học, vi sinh học và sinhhọc phân tử cũng như cho sự phát triển của quá trình sản xuất protein trongcông nghệ sinh học và kỹ thuật sinh hóa Hiện nay, protein chiết xuất từ các tế

bào vi khuẩn thường được sử dụng phương pháp cơ học, đòi hỏi dụng cụtương đối đắt tiền và đòi hỏi kỹ năng kỹ thuật.

i4 lysis đệm đã được phát triển bằng công nghệ Enzyme Phòng thínghiệm của các quốc gia Trung tâm Kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học(BIOTEC) để cung cấp một giải pháp rẻ tiền để chiết xuất protein Có rấtnhiều phương pháp để phá vỡ tế bào: phương pháp phá vỡ tế bào bằngphương pháp cơ học và không bằng cơ học Trong đó, phương pháp cơ họcgồm có rất nhiều phương pháp như phương pháp phá vỡ tế bào bằng sóngsiêu âm, phá vỡ tế bào bằng máy đồng hóa cao áp, phá vỡ tế bào bằng phươngpháp lạnh đông,… Phương pháp không bằng cơ học như phương pháp sốcthẩm thấu, phương pháp xử lý kiềm,…

Do enzyme của chúng tôi là enzyme nội bào nên ở đây chúng tôi sửdụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tế bào Các bộ đệm lysis đã được xây dựng

để khai thác protein vi khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất để phá vỡ bề mặt tếbào Điều quan trọng ở đây là chúng tôi sử dụng dung dịch phá vỡ tế bào rất

có hiệu quả với nhiều loại tế bào vi khuẩn, nấm trong khi vẫn bảo toàn hàmlượng và hoạt tính của protein Dung dịch đệm cũng được sử dụng cho táchchiết DNA từ vi sinh vật

Các đặc điểm của i4 lysis đệm:

Sau đó thu tế bào, chuyển dịch nuôi vào trong 2 eppendoff mà ta vừacân được đem ly tâm ở 6000rpm/phút trong 20 phút ở 4oC để thu sinh khối.

Bỏ dịch trong và cân trọng lượng tế bào thu được

Bổ sung 200-300 µl/100mg tế bào Sau đó, hòa tan cặn bằng vortex vàđem ngâm đá 15 – 20 phút Ly tâm 10 000 v/phút trong 30 phút rồi bỏ cặn thudịch nổi

II.2.5 Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Bradford

Cơ sở của phương pháp: hàm lượng protein – enzyme đã được xác địnhvào năm 1976 bằng phương pháp của bradford Cơ sở của phương pháp làdựa vào độ hấp thụ màu của phản ứng giữa enzyme và dung dịch Bradford,dựa vào đồ thị chuẩn BSA-Bradford để tính hàm lượng protein – enzyme

Phương pháp tiến hành: cho 100µl dung dịch protein pha loãng vào900µl dung dịch Bradford (100mg Coomassie Brillitant Blue G250 hòa tan

500 ethanol, bổ sung 100ml phosphorich acid 85%, sau đó định mức đến 1lítbằng nước cất) Chuẩn bị blank (mẫu đối chứng) bằng cách bổ xung nước cấtthay cho protein Hỗn hợp phản ứng giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, cứ 1phút vortex một lần Sau đó, hỗn hợp được đo quang phổ ở bước sóng 620nmbằng máy spectrophotometer (máy so màu) Độ hấp thụ quang của dung dịchphản ứng dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford tính được nồng độenzyme – protein có trong mẫu

Dựa vào đồ thị đường chuẩn BSA-Bradford có: