Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 5 docx

Chuyển DNA vào trong tế bào sống 1 CHƯƠNG V: CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO SỐNG Những thao tác được mô tả trong chương IV cho phép các nhà sinh học phân tử tạo ra những phân tử DNA tái tổ hợp mới. Bước tiếp theo trong thí nghiệm gene cloning là việc chuyển những phân tử này vào trong tế bào sống, thông thường là vi khuẩn, chúng đồng thời tăng trưởng và phân chia để sản xuất ra các clone (Hình 1.1). Nói một cách chính xác, “cloning” chỉ dùng cho các bước sau của phương pháp chứ không dùng cho việc tạo chính phân tử DNA tái tổ hợp. Cloning phục vụ cho 2 mục đích, đầu tiên nó cho phép sản xuất được một số lượng lớn phân tử DNA tái tổ hợp từ một lượng giới hạn nguyên liệu ban đầu. Lúc đầu chỉ có sẵn một lượng vài nanogram DNA tái tổ hợp, nhưng mỗi vi khuẩn mang một plasmid sẽ phân chia nhiều lần để tạo ra một khuẩn lạc (colony), mỗi tế bào lại chứa nhiều bản sao của phân tử. Từ một khuẩn lạc thuần nhất có thể tạo ra vài microgram DNA tái tổ hợp, tượng trưng cho sự nhân lên gấp hàng ngàn lần so với lượng ban đầu (hình 5.1). Nếu như vi khuẩn không được sử dụng như một nguồn DNA mà được sử dụng để nhân sinh khối thì lượng DNA tạo thành có thể đạt đến vài mg DNA tức là năng suất tăng lên gấp hàng triệu lần. Bằng cách này, cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA cần thiết cho việc nghiên cứu sinh học phân tử vế cấu trúc và biểu hiện gen. Vai trò quan trọng thứ hai của cloning là được dùng trong quá trình tinh sạch. Những thao tác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp hiếm khi được điều khiển tới mức độ mà không có một phân tử DNA nào khác hiện diện khi kết thúc quá trình sản xuất. Việc gắn trộn có thể gồm, ngoài những phân tử tái tổ hợp mong muốn, còn có một số dạng sau: 1. Phân tử vectơ không đóng vòng (có bị cắt). 2. Những đoạn DNA mở (không gắn vào vectơ, có đoạn mang gen mong muốn hoặc không). 3. Phân tử vectơ tự đóng vòng mà không mang đoạn DNA mới được chèn (“self- ligated” vectơ). 4. Phân tử DNA tái tổ hợp có mang đoạn DNA bị chèn sai (không mang gen mong muốn). Chuyển DNA vào trong tế bào sống 2 Hình 5.1: Cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA tái tổ hợp Một tế bào đơn chứa nhiều bản sao tái tổ hợp Phát triển thành 1 khuẩn lạc cung cấp vài µg DNA tái tổ hợp Nuôi cấy trong 500 ml dịch lỏng, ủ trong 18h Cung cấp vài mg DNA tái tổ hợp Chuyển DNA vào trong tế bào sống 3 Những phân tử không đóng vòng hiếm khi bị ảnh hưởng bởi vì mặc dù tế bào vi khuẩn có thể mang chúng thì chỉ trong những trường hợp bất thường mới có thể nhân lên. Có nhiều khả năng là các enzyme trong tế bào chủ sẽ làm rã các mảnh DNA này. Mặt khác, phân tử “self-ligated” và những plasmid tái tổ hợp sai cũng có khả năng tái bản như những phân tử mong muốn (hình 5.2b). Tuy nhiên, việc tinh sạch chọn ra các phân tử mong muốn vẫn có thể đạt được qua cloning bởi việc bất cứ tế bào nào mang nhiều hơn một phân tử DNA là hiện tượng rất bất thường. Mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc, vì vậy mỗi tế bào trong dòng tế bào thu được đều chứa cùng phân tử. Tất nhiên, những khuẩn lạc khác nhau chứa những phân tử khác nhau: một số chứa những phân tử DNA tái tổ hợp mong muốn, một số chứa những phân tử DNA tái tổ hợp khác và một số chứa những vectơ “self-ligated”. Do đó, vấn đề đặt ra là làm sao xác định được khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp đúng. Hình 5.2: Cloning cũng tương tự như tinh sạch, từ một hỗn hợp nhiều loại phân tử khác nhau, có thể thu được các clone chỉ chứa các bản sao của một loại phân tử a. Sản phẩm của sự gắn kết đoạn DNA mở Phân tử vector tự đóng vòng Phân tử vector gen phân tử DNA tái tổ hợp không đóng vòng mong muố n Phân tử DNA tái tổ hợp sai b. Tất cả phân tử đóng vòng được clone (nhân dòng) Tế bào chứa vector tự đóng vòng tế bào chứa phân tử DNA tái tổ hợp sai Tế bào chứa phân tử mong muốn Clone của vector Clone mong muốn Clone của phân tử sai tự đóng vòng Chuyển DNA vào trong tế bào sống 4 Chương này đưa ra cách plasmid và vectơ phage, phân tử tái tổ hợp thu nhận từ các khuẩn lạc trên các tế bào vi khuẩn. Xuyên suốt chương này, ta sẽ thấy việc chọn giữa khuẩn lạc chứa phân tử tái tổ hợp và khuẩn lạc chứa vectơ tự đóng vòng là tương đối dễ dàng. Việc khó hơn là làm sao để phân biệt các clone chứa phân tử DNA tái tổ hợp đúng trong tất cả những clone tái tổ hợp khác sẽ sẽ được đề cập trong chương VIII. Chuyển DNA vào trong tế bào sống 5 5.1 Sự biến nạp – Sự hấp thụ DNA của tế bào vi khuẩn Hầu hết các loài vi khuẩn đều có khả năng hấp thụ các phân tử DNA từ môi trường mà nó tăng trưởng. Thông thường, một phân tử DNA khi vào tế bào theo cách này thường bị phân hũy nhưng thỉnh thoảng, nó có khả năng sống sót và tái bản trong tế bào chủ. Đặc biệt, điều này sẽ xảy ra khi phân tử DNA là 1 plasmid có điểm khởi đầu sao chép được tế bào chủ nhận biết. Người ta thường theo dõi sự hấp thụ và duy trì ổn định của plasmid thông qua sự biểu hiện của các gen nằm trên plasmid. Ví dụ, tế bào E.coli thường nhạy cảm với các tác nhân ức chế sinh trưởng của kháng sinh Ampicillin và Tetracylin. Tuy nhiên, các tế bào mang plasmid pBR322, một trong những vectơ cloning được sử dụng đầu tiên vào những năm 1970 lại kháng được kháng sinh. Đó là bởi vì pBR322 mang 2 nhóm gen, 1 nhóm gen mã hóa cho enzyme beta lactamase (enzyme làm thay đổi Ampicillin sang dạng không độc đối với vi khuẩn), 1 nhóm gen mã hóa cho enzyme giải độc tetracylin. Việc hấp phụ của pBR322 có thể phát hiện được ở tế bào E.coli bởi vì tế bào chuyển từ dạng nhạy cảm với Ampicillin và tetracylin sang dạng kháng với 2 loại kháng sinh trên. Trong những năm gần đây, giới hạn biến nạp đã tăng lên, bất cứ một loại tế bào nào, không kể tế bào vi khuẩn, tế bào nấm hay tế bào động thực vật đều có khả năng hấp thụ DNA cho dù kết quả của sự hấp thụ đó có xảy ra trong tấ bào hay không (thông qua những thay đổi phát hiện được). 5.1.1 Không phải tất cả các loài vi khuẩn đều có khả năng hấp thụ DNA như nhau Trong tự nhiên, sự biến nạp không phải là quá trình chính để vi khuẩn có được thông tin di truyền. Điều này đã phản ánh được thực tế rằng trong phòng thí nghiệm, chỉ có một vài loài vi khuẩn (chủ yếu thuộc 2 giống Bacillus và Streptococcus) có thể dễ dàng biến nạp. Nghiên cứu kỹ những tổ chức cơ thể này mới thấy được là chúng có những cơ chế gắn kết và hấp thụ rất tinh vi. Hầu hết các loài vi khuẩn, kể cả E.coli, chỉ có khả năng thu nhận một lượng DNA giới hạn trong điều kiện bình thường. Để tăng hiệu quả biến nạp, tế bào vi khuẩn thường phải trải qua môt số biến đổi vật lý hay hóa học hay cả hai. Những tế bào được biến đổi như vậy gọi là các tế bào khả biến (competent cell). 5.1.2 Chuẩn bị các tế bào E.coli khả biến (competent cell) Cũng như nhiều phát minh khác trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA, biến nạp được quan tâm vào những năm 70, khi người ta quan sát thấy tế bào E.coli ngâm trong dung dịch muối Chuyển DNA vào trong tế bào sống 6 lạnh thì hấp thụ DNA hiệu quả hơn những tế bào không ngâm và trở thành bước phát triển quan trọng. Trong kỹ thuật này, các phương pháp cũ thường sử dụng 50mM CaCl 2 mặc dù những muối khác như Rubidium Cloride cũng không kém hiệu quả. Thực chất người ta không biết chính xác được tại sao phải xử lý. Có khả năng do CaCl 2 làm DNA giảm ở ngoài tế bào hoặc có thể muối CaCl 2 gây ra một số dạng thay đổi trong màng tế bào làm tăng khả năng kết dính DNA. Cho dù là trong trường hợp nào thì việc ngâm CaCl 2 chỉ có tác dụng với việc kết dính DNA và không ảnh hưởng đến việc hấp phụ DNA vào tế bào. Khi DNA được đưa vào môi trường chứa các tế bào đã được xử lý, nó chỉ gắn lên trên bề mặt tế bào và tại thời điểm đó, nó hoàn toàn chưa được chuyển đến tế bào chất (Hình 5.3). DNA chỉ thật sự dịch chuyển vào tế bào khả biến khi bị kích thích bằng cách gia nhiệt lên 42 0 C. Một lần nữa, nguyên nhân tại sao sốc nhiệt lại tạo ra hiệu quả vẫn không thể giải thích được. Hình 5.3: Tế bào vi khuẩn khả biến (competent bacterial cell) Tế bào bình thường Plasmid gắn bên ngoài tế bào xử lý bằng CaCl 2 Tế bào khả biến (competent cell) Plasmid chuyển vào trong tế bào 42 0 C/2 phút Tế bào được biến nạp (transformed cell) Chuyển DNA vào trong tế bào sống 7 5.1.3 Lựa chọn thể biến nạp Sự biến nạp của các tế bào khả biến là một phương thức không mang lại hiệu quả, thêm nữa, việc chuẩn bị tế bào cũng cần phải được tiến hành cẩn thận, mặc dù 1ng pUC8 có thể tạo ra 1000-10000 thể biến nạp. Điều này chứng tỏ chỉ có 0.01% phân tử được hấp thụ trong tổng số tế bào có trong môi trường khả biến. Có nghĩa là phải tìm ra một phương pháp để phân biệt 1 tế bào đã nhận 1 plasmid trong hàng ngàn tế bào không được biến nạp. Chuyển DNA vào trong tế bào sống 8 Câu trả lời là sử dụng gen đánh dấu (selectable marker) có mang plasmid. Gen đánh dấu đơn giản là gen mang lại cho tế bào được biến nạp một đặc tính mới không có ở tế bào không biến nạp. Một ví dụ điển hình của gen đánh dấu là gen kháng Ampicillin của pBR322. Sau khi thực hiện biến nạp với pBR322, chỉ có các tế bào E.coli hấp phụ plasmid mới thể hiện đặc tính kháng Ampicillin và Tetracillin (amp R tet R ), do đó có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch chứa 2 loại kháng sinh này (Hình 5.4), còn thể không biến nạp do vẫn còn nhạy cảm với Ampicillin và Tetracillin nên không có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Như vậy, việc phân biệt giữa thể biến nạp (transformant) và thể không biến nạp(non-transformant) là khá dễ dàng. Hình 5.4: Lựa chọn các tế bào chứa plasmid pBR322 bằng cách nuôi cấy trên môi trường thạch chứa Ampicillin hay Tetracillin hay cả hai Tế bào E.coli bình thường tế bào E.coli chứa pBR322 (không chứa plasmid) không thể tồn tại trong tồn tại và tạo colony trong môi trường chọn lọc môi trường chọn lọc môi trường thạch chứa 40µg/ml Ampicillin, 15 µg/ml Tetracillin hay kết hợp cả hai Chuyển DNA vào trong tế bào sống 9 Hấu hết plasmid dùng làm vectơ trong cloning chứa ít nhất 1 gen quy định tính kháng kháng sinh cho tế bào chủ bằng việc chọn lọc thể biến nạp qua phương pháp trãi đĩa trên môi trường thạch có chứa loại kháng sinh tương ứng. Tuy nhiên, vấn đề nảy sinh là tính kháng kháng sinh không chỉ hoàn toàn do sự hiện diện của plasmid trong các tế bào được biến nạp. Gen kháng kháng sinh trên plasmid cần phải được biểu hiện, từ đó mới có enzyme giải độc kháng sinh. Ngay sau khi biến nạp, gen kháng kháng sinh biểu hiên ngay lập túc nhưng phải mất một vài phút tế bào mới tổng hợp được đủ lượng enzyme để có thể chịu đựng độc tố kháng sinh . Đó là lý do vì sao không nên đưa tế bào biến nạp ngay vào môi trường chọn lọc ngay sau khi xử lý sốc nhiệt mà lúc đầu chỉ nên đưa vào môi trường lỏng không chứa kháng sinh và nuôi cấy trong thời gian ngắn. Ngay sau đó, Chuyển DNA vào trong tế bào sống 10 plasmid được tái bản và biểu hiện vì thế khi tế bào được cấy vào đĩa môi trường có kháng sinh, chúng có đủ lượng enzyme để tồn tại (Hình 5.5). Hình 5.5: Biểu hiện kiểu hình. Ủ ở 37 0 C trong 1h trước khi nuôi cấy trên đĩa sẽ làm tăng khả năng sống sót của các cá thể biến nạp trên môi trường chọn lọc vì vi khuẩn có thời gian để tổng hợp các enzyme kháng kháng sinh Protein kháng kháng sinh plasmid ngay sau khi biến nạp sau khi nuôi cấy 1h ở 37 0 C [...]... galactosidase (Hình 5. 9a) còn thể tái tổ hợp cũng kháng Ampicillin nhưng không có thể tổng hợp beta galactosidase (Hình 5. 9b) Sự sàng lọc cho sự hiện di n hay không hiện di n trên thực tế khá dễ dàng Chỉ cần thử nghiệm sự phân cắt lactose thành glucose và galactose, kiểmtra các phản ứng khác nhau xúa tác bởi enzyme Điều này đói hỏi phải có chất tương tự như lactose và X-gal (5bromo-4-chloro-3-indoline-β-galactopyranosid)... số các gen hiện di n trong phân tử Do đó, thể tổ hợp (recombinant) có thể được nhận di n bởi những đặc tính được mã hóa bởi gen bất hoạt không còn hiện di n trong tế bào chủ nữa (Hình 5. 6) Nguyên lý chung của sự chèn bất hoạt được minh họa bới thí nghiệm cloning điển hình sử dụng pBR322 như là 1 vectơ 11 Chuyển DNA vào trong tế bào sống Hình 5. 6: Sự chèn bất hoạt a Vector bình thường- không được tái... 5. 10b Hình 5. 10: Bản chất của việc chèn bất hoạt vào gen “Lac Z” của pUC8 a Gen của E.coli và gen của plasmid tổng hợp những phần khác nhau của βgalactosidase b Sàng lọc thể tái tổ hợp bằng môi trường thạch chứa X gal và IPTG 18 Chuyển DNA vào trong tế bào sống a Chức năng của gen “lac Z”  1 phần - galactosidase mã hóa bởi gen của vi khuẩn  1 phần - galactosidase mã hóa bởi gen của plasmid  -. .. thạch X-gal: vết lan chứa phage bình thường có màu xanh, vết lan tái tổ hợp không có màu (Hình 5. 13a) 5. 4.2 Sự chèn bất hoạt của gen λCI Vài dạng vectơ cloning chỉ có những vị trí cắt giới hạn duy nhất trên gen CI ( Hình 2.9) Sự chèn bất hoạt của gen này làm thay đổi hình thái những vết lan trên môi trường Những vết lan bình thường bị đục, còn tại vị trí tái tổ hợp chứa gen CI thì trong (Hình 5. 13b) 5. 4.3... nhiễm vào λ không tái tổ hợp không nhiễm vào được d Chọn lọc dựa trên kích thước genome λ (hệ gen) 25 Chuyển DNA vào trong tế bào sống 5. 4.4 Chọn lọc dựa trên kích thước genome λ (hệ gen) Quá trình tạo vỏ λ hướng tới tạo một kiểu phage trưởng thành chỉ có thể chèn vào phân tử DNA vào khoảng kích thước 3 7 -5 2 kb vào cấu trúc đầu Nếu phage có kích thước nhỏ hơn 37kb sẽ không được tạo vỏ Nhiều vectơ λ được... thể hoàn thành chu trình gây nhiễm ở E.coli do sự vắng mặt các sản phẩm của những gen đột biến không tạo thành cuả trúc hoàn chỉnh của capsid Thay vào đó là sự tích lũy những sản phẩm của tất cả gen mã hóa cho lớp vỏ bọc protein (Hình 5. 11b) Do đó, hỗn hợp cho việc đóng gói invitro được chuẩn bị bằng cách kết hợp dịch tan của 2 giống tế bào nuôi cấy, 1 bị nhiễm λD-, 1 bị nhiễm λ E- Hỗn hợp bây giờ chứa... bào sống 5. 2.1 Chọn lọc thể tái tổ hợp với pBR322 - Sự chèn bất hoạt của một gen kháng kháng sinh pBR322 có một số vùng cắt giới hạn đặc biệt có thể sứ dụng để mở vòng một vectơ trước khi chèn vào một đoạn DNA mới (Hình 5. 7a) Ví dụ: BamHI cắt pBR322 chỉ tại một vị trí nằm trong cụm gen mã hóa tính kháng Tetracillin Phân tử pBR322 tái tổ hợp (có mang đọan DNA ngoại lai tại vị trí BamHI (Hình 5. 7b)) không... lạc xanh = - galactosidase được tổng hợp\ Xgal  sản phẩm có màu xanh  Khuẩn lạc trắng = - galactosidase không được tổng hợp Xgal  không tạo sản phẩm màu xanh 19 Chuyển DNA vào trong tế bào sống 5. 3 Chuyển DNA vào trong tế bào vi khuẩn Có 2 phương pháp khác nhau để đưa phage vào trong tế bào vi khuẩn tạo ra DNA tái tổ hợp :lây nhiễm và tạo vỏ phage invitro a Sự lây nhiễm: đây là quá trình tương... DNA vào trong tế bào sống đoạn DNA khác vào để kích thước bộ gen lên đến 37 kb hay hơn Vì vậy, chỉ những vectơ tái tổ hợp này mới có thể lặp lại 5. 5 Sự truyền thông tin của những tế bào không thuộc vi khuẩn Những hướng chuyển DNA vào nấm men, nấm mốc, động- thực vật cũng rất cần thiết nếu những sinh vật này cũng được sử dụng như vật chủ cho gen cloning Mặc dù tế bào được ngâm muối thường xử lý với... tiếp (Hình 5. 15a) Kỹ thuạt này được ứng dụng đầu tiên trên tế bào động vật nhưng ngay sau đó lại thành công trong tế bào động vật Phương pháp thứ hai liên quan đến sự phá tế báo bằng vi đạn có vận tốc cao được làm bằng vàng hay tungsten có phủ DNA Những vi đạn này được đưa vào tế bào bằng súng Kỹ thuật này còn được gọi là biolistics và đã được sử dụng để nuôi nhiều loại tế bào khác nhau 5. 5.2 Biến nạp . lactose và X-gal ( 5- bromo-4-chloro-3-indoline-β-galactopyranosid) cũng bị phân cắt bởi β-galactosidase tạo ra sản phẩm màu xanh đậm. Nếu X-gal (cộng cới chất cảm ứng emzyme như isopropyl- thiogalactoside. bào được cấy vào đĩa môi trường có kháng sinh, chúng có đủ lượng enzyme để tồn tại (Hình 5. 5). Hình 5. 5: Biểu hiện kiểu hình. Ủ ở 37 0 C trong 1h trước khi nuôi cấy trên đĩa sẽ làm tăng khả. galactosidase (Hình 5. 9a) còn thể tái tổ hợp cũng kháng Ampicillin nhưng không có thể tổng hợp beta galactosidase (Hình 5. 9b). Sự sàng lọc cho sự hiện di n hay không hiện di n trên thực tế khá