Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 5 docx

Lúc đầu chỉ có sẵn một lượng vài nanogram DNA tái tổ hợp, nhưng mỗi vi khuẩn mang một plasmid sẽ phân chia nhiều lần để tạo ra một khuẩn lạc colony, mỗi tế bào lại chứa nhiều bản sao của

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

1

CHƯƠNG V: CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO SỐNG

Những thao tác được mô tả trong chương IV cho phép các nhà sinh học phân tử tạo ra

những phân tử DNA tái tổ hợp mới Bước tiếp theo trong thí nghiệm gene cloning là việc

chuyển những phân tử này vào trong tế bào sống, thông thường là vi khuẩn, chúng đồng

thời tăng trưởng và phân chia để sản xuất ra các clone (Hình 1.1) Nói một cách chính xác, “cloning” chỉ dùng cho các bước sau của phương pháp chứ không dùng cho việc tạo

chính phân tử DNA tái tổ hợp

Cloning phục vụ cho 2 mục đích, đầu tiên nó cho phép sản xuất được một số lượng lớn

phân tử DNA tái tổ hợp từ một lượng giới hạn nguyên liệu ban đầu Lúc đầu chỉ có sẵn một lượng vài nanogram DNA tái tổ hợp, nhưng mỗi vi khuẩn mang một plasmid sẽ phân

chia nhiều lần để tạo ra một khuẩn lạc (colony), mỗi tế bào lại chứa nhiều bản sao của

phân tử Từ một khuẩn lạc thuần nhất có thể tạo ra vài microgram DNA tái tổ hợp, tượng trưng cho sự nhân lên gấp hàng ngàn lần so với lượng ban đầu (hình 5.1) Nếu như vi khuẩn không được sử dụng như một nguồn DNA mà được sử dụng để nhân sinh khối thì lượng DNA tạo thành có thể đạt đến vài mg DNA tức là năng suất tăng lên gấp hàng

triệu lần Bằng cách này, cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA cần thiết cho việc

nghiên cứu sinh học phân tử vế cấu trúc và biểu hiện gen

Vai trò quan trọng thứ hai của cloning là được dùng trong quá trình tinh sạch Những thao tác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp hiếm khi được điều khiển tới mức độ mà không có một phân tử DNA nào khác hiện diện khi kết thúc quá trình sản xuất Việc gắn trộn có thể gồm, ngoài những phân tử tái tổ hợp mong muốn, còn có một số dạng sau:

1 Phân tử vectơ không đóng vòng (có bị cắt)

2 Những đoạn DNA mở (không gắn vào vectơ, có đoạn mang gen mong muốn hoặc không)

3 Phân tử vectơ tự đóng vòng mà không mang đoạn DNA mới được chèn

(“self-ligated” vectơ)

4 Phân tử DNA tái tổ hợp có mang đoạn DNA bị chèn sai (không mang gen mong muốn)

2

Hình 5.1: Cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA tái tổ hợp

Một tế bào đơn chứa nhiều bản sao tái tổ hợp

Phát triển thành 1 khuẩn lạc cung cấp vài µg DNA tái tổ hợp

Nuôi cấy trong 500 ml dịch lỏng, ủ trong 18h

Cung cấp vài mg DNA tái tổ hợp

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

3

Những phân tử không đóng vòng hiếm khi bị ảnh hưởng bởi vì mặc dù tế bào vi khuẩn

có thể mang chúng thì chỉ trong những trường hợp bất thường mới có thể nhân lên Có

nhiều khả năng là các enzyme trong tế bào chủ sẽ làm rã các mảnh DNA này Mặt khác,

phân tử “self-ligated” và những plasmid tái tổ hợp sai cũng có khả năng tái bản như

những phân tử mong muốn (hình 5.2b) Tuy nhiên, việc tinh sạch chọn ra các phân tử

mong muốn vẫn có thể đạt được qua cloning bởi việc bất cứ tế bào nào mang nhiều hơn

một phân tử DNA là hiện tượng rất bất thường Mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn

lạc, vì vậy mỗi tế bào trong dòng tế bào thu được đều chứa cùng phân tử Tất nhiên,

những khuẩn lạc khác nhau chứa những phân tử khác nhau: một số chứa những phân tử

DNA tái tổ hợp mong muốn, một số chứa những phân tử DNA tái tổ hợp khác và một số

chứa những vectơ “self-ligated” Do đó, vấn đề đặt ra là làm sao xác định được khuẩn lạc

chứa plasmid tái tổ hợp đúng

Hình 5.2: Cloning cũng tương tự như tinh sạch, từ một hỗn hợp nhiều loại phân tử khác

nhau, có thể thu được các clone chỉ chứa các bản sao của một loại phân tử

a Sản phẩm của sự gắn kết

đoạn DNA mở Phân tử vector tự đóng vòng

Phân tử vector gen phân tử DNA tái tổ hợp

không đóng vòng mong muốn Phân tử DNA tái tổ hợp sai

b Tất cả phân tử đóng vòng được clone (nhân dòng)

Tế bào chứa vector tự đóng vòng tế bào chứa phân tử DNA tái tổ hợp sai

Tế bào chứa phân tử mong muốn

Clone của vector Clone mong muốn Clone của phân tử sai

tự đóng vòng

4

Chương này đưa ra cách plasmid và vectơ phage, phân tử tái tổ hợp thu nhận từ các khuẩn lạc trên các tế bào vi khuẩn Xuyên suốt chương này, ta sẽ thấy việc chọn giữa khuẩn lạc chứa phân tử tái tổ hợp và khuẩn lạc chứa vectơ tự đóng vòng là tương đối dễ

dàng Việc khó hơn là làm sao để phân biệt các clone chứa phân tử DNA tái tổ hợp đúng trong tất cả những clone tái tổ hợp khác sẽ sẽ được đề cập trong chương VIII

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

5

5.1 Sự biến nạp – Sự hấp thụ DNA của tế bào vi khuẩn

Hầu hết các loài vi khuẩn đều có khả năng hấp thụ các phân tử DNA từ môi trường mà nó tăng trưởng Thông thường, một phân tử DNA khi vào tế bào theo cách này thường bị phân hũy nhưng thỉnh thoảng, nó có khả năng sống sót và tái bản trong tế bào chủ Đặc biệt, điều này sẽ xảy ra khi phân tử DNA là 1 plasmid có điểm khởi đầu sao chép được tế bào chủ nhận biết

Người ta thường theo dõi sự hấp thụ và duy trì ổn định của plasmid thông qua sự biểu

hiện của các gen nằm trên plasmid Ví dụ, tế bào E.coli thường nhạy cảm với các tác nhân ức chế sinh trưởng của kháng sinh Ampicillin và Tetracylin Tuy nhiên, các tế bào

mang plasmid pBR322, một trong những vectơ cloning được sử dụng đầu tiên vào những năm 1970 lại kháng được kháng sinh Đó là bởi vì pBR322 mang 2 nhóm gen, 1 nhóm

gen mã hóa cho enzyme beta lactamase (enzyme làm thay đổi Ampicillin sang dạng không độc đối với vi khuẩn), 1 nhóm gen mã hóa cho enzyme giải độc tetracylin Việc hấp phụ của pBR322 có thể phát hiện được ở tế bào E.coli bởi vì tế bào chuyển từ dạng nhạy cảm với Ampicillin và tetracylin sang dạng kháng với 2 loại kháng sinh trên

Trong những năm gần đây, giới hạn biến nạp đã tăng lên, bất cứ một loại tế bào nào, không kể tế bào vi khuẩn, tế bào nấm hay tế bào động thực vật đều có khả năng hấp thụ DNA cho dù kết quả của sự hấp thụ đó có xảy ra trong tấ bào hay không (thông qua những thay đổi phát hiện được)

5.1.1 Không phải tất cả các loài vi khuẩn đều có khả năng hấp thụ DNA như nhau

Trong tự nhiên, sự biến nạp không phải là quá trình chính để vi khuẩn có được thông tin

di truyền Điều này đã phản ánh được thực tế rằng trong phòng thí nghiệm, chỉ có một vài

loài vi khuẩn (chủ yếu thuộc 2 giống Bacillus và Streptococcus) có thể dễ dàng biến nạp

Nghiên cứu kỹ những tổ chức cơ thể này mới thấy được là chúng có những cơ chế gắn kết và hấp thụ rất tinh vi

Hầu hết các loài vi khuẩn, kể cả E.coli, chỉ có khả năng thu nhận một lượng DNA giới

hạn trong điều kiện bình thường Để tăng hiệu quả biến nạp, tế bào vi khuẩn thường phải trải qua môt số biến đổi vật lý hay hóa học hay cả hai Những tế bào được biến đổi như

vậy gọi là các tế bào khả biến (competent cell)

5.1.2 Chuẩn bị các tế bào E.coli khả biến (competent cell)

Cũng như nhiều phát minh khác trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA, biến nạp được quan tâm vào những năm 70, khi người ta quan sát thấy tế bào E.coli ngâm trong dung dịch muối

6

lạnh thì hấp thụ DNA hiệu quả hơn những tế bào không ngâm và trở thành bước phát triển quan trọng Trong kỹ thuật này, các phương pháp cũ thường sử dụng 50mM CaCl2

mặc dù những muối khác như Rubidium Cloride cũng không kém hiệu quả

Thực chất người ta không biết chính xác được tại sao phải xử lý Có khả năng do CaCl2

làm DNA giảm ở ngoài tế bào hoặc có thể muối CaCl2 gây ra một số dạng thay đổi trong màng tế bào làm tăng khả năng kết dính DNA Cho dù là trong trường hợp nào thì việc ngâm CaCl2 chỉ có tác dụng với việc kết dính DNA và không ảnh hưởng đến việc hấp phụ DNA vào tế bào Khi DNA được đưa vào môi trường chứa các tế bào đã được xử lý,

nó chỉ gắn lên trên bề mặt tế bào và tại thời điểm đó, nó hoàn toàn chưa được chuyển đến

tế bào chất (Hình 5.3) DNA chỉ thật sự dịch chuyển vào tế bào khả biến khi bị kích thích bằng cách gia nhiệt lên 420C Một lần nữa, nguyên nhân tại sao sốc nhiệt lại tạo ra hiệu quả vẫn không thể giải thích được

Hình 5.3: Tế bào vi khuẩn khả biến (competent bacterial cell)

Tế bào bình thường

Plasmid gắn bên ngoài tế bào xử lý bằng CaCl2

Tế bào khả biến (competent cell)

Plasmid chuyển vào trong tế bào 420C/2 phút

Tế bào được biến nạp (transformed cell)

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

7

5.1.3 Lựa chọn thể biến nạp

Sự biến nạp của các tế bào khả biến là một phương thức không mang lại hiệu quả, thêm nữa, việc chuẩn bị tế bào cũng cần phải được tiến hành cẩn thận, mặc dù 1ng pUC8 có thể tạo ra 1000-10000 thể biến nạp Điều này chứng tỏ chỉ có 0.01% phân tử được hấp thụ trong tổng số tế bào có trong môi trường khả biến Có nghĩa là phải tìm ra một phương pháp để phân biệt 1 tế bào đã nhận 1 plasmid trong hàng ngàn tế bào không được biến nạp

8

Câu trả lời là sử dụng gen đánh dấu (selectable marker) có mang plasmid Gen đánh dấu

đơn giản là gen mang lại cho tế bào được biến nạp một đặc tính mới không có ở tế bào

không biến nạp Một ví dụ điển hình của gen đánh dấu là gen kháng Ampicillin của pBR322 Sau khi thực hiện biến nạp với pBR322, chỉ có các tế bào E.coli hấp phụ plasmid mới thể hiện đặc tính kháng Ampicillin và Tetracillin (ampRtetR), do đó có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch chứa 2 loại kháng sinh này (Hình 5.4), còn thể

không biến nạp do vẫn còn nhạy cảm với Ampicillin và Tetracillin nên không có khả

năng tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Như vậy, việc phân biệt giữa thể biến nạp

(transformant) và thể không biến nạp(non-transformant) là khá dễ dàng

Hình 5.4: Lựa chọn các tế bào chứa plasmid pBR322 bằng cách nuôi cấy trên môi trường

thạch chứa Ampicillin hay Tetracillin hay cả hai

Tế bào E.coli bình thường tế bào E.coli chứa pBR322

(không chứa plasmid)

không thể tồn tại trong tồn tại và tạo colony trong

môi trường chọn lọc môi trường chọn lọc

môi trường thạch chứa 40µg/ml Ampicillin,

15 µg/ml Tetracillin hay kết hợp cả hai

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

9

Hấu hết plasmid dùng làm vectơ trong cloning chứa ít nhất 1 gen quy định tính kháng kháng sinh cho tế bào chủ bằng việc chọn lọc thể biến nạp qua phương pháp trãi đĩa trên môi trường thạch có chứa loại kháng sinh tương ứng Tuy nhiên, vấn đề nảy sinh là tính kháng kháng sinh không chỉ hoàn toàn do sự hiện diện của plasmid trong các tế bào được biến nạp Gen kháng kháng sinh trên plasmid cần phải được biểu hiện, từ đó mới có enzyme giải độc kháng sinh Ngay sau khi biến nạp, gen kháng kháng sinh biểu hiên ngay lập túc nhưng phải mất một vài phút tế bào mới tổng hợp được đủ lượng enzyme để có thể chịu đựng độc tố kháng sinh Đó là lý do vì sao không nên đưa tế bào biến nạp ngay vào môi trường chọn lọc ngay sau khi xử lý sốc nhiệt mà lúc đầu chỉ nên đưa vào môi trường lỏng không chứa kháng sinh và nuôi cấy trong thời gian ngắn Ngay sau đó,

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

11

5.2 Xác định thể tổ hợp (recombinant)

Việc trải đĩa trên môi trường chọn lọc cho phép phân biệt được các thể biến nạp và không biến nạp Vấn đề kế tiếp là phải xác định được khuẩn lạc biến nạp chứa tế bào mang các

phân tử DNA tái tổ hợp và chứa những phân tử vectơ “self-ligated” Với hầu hết vectơ

dùng trong cloing, sự chèn 1 đọn DNA vào trong plasmid sẽ phá đi sự nguyên vẹn của

một trong số các gen hiện diện trong phân tử Do đó, thể tổ hợp (recombinant) có thể

được nhận diện bởi những đặc tính được mã hóa bởi gen bất hoạt không còn hiện diện trong tế bào chủ nữa (Hình 5.6) Nguyên lý chung của sự chèn bất hoạt được minh họa

bới thí nghiệm cloning điển hình sử dụng pBR322 như là 1 vectơ

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

13

5.2.1 Chọn lọc thể tái tổ hợp với pBR322 - Sự chèn bất hoạt của một gen kháng kháng sinh

pBR322 có một số vùng cắt giới hạn đặc biệt có thể sứ dụng để mở vòng một vectơ trước

khi chèn vào một đoạn DNA mới (Hình 5.7a) Ví dụ: BamHI cắt pBR322 chỉ tại một vị trí nằm trong cụm gen mã hóa tính kháng Tetracillin Phân tử pBR322 tái tổ hợp (có mang đọan DNA ngoại lai tại vị trí BamHI (Hình 5.7b)) không còn khả năng tạo tính kháng Tetracillin trên tế bào chủ bởi một trong những gen cần thiết đã bị bất hoạt do sự

chèn DNA Những tế bào chứa phân tử pBR322 tái tổ hợp này vẫn kháng được

Ampicillin nhưng lại nhạy cảm vớt Tetracillin (ampR tetR)

Hình 5.7: Vector pBR322 dùng trong cloning

a Vector bình thường

b Vector tái tổ hợp có đoạn DNA ngoại lai chèn vào vị trí BamHI

(xem bản đồ pUC8 chi tiết ở hình 6.3 và 6.4 )

14

Việc sàng lọc chọn thể tái tổ hợp chứa pBR322 được tiến hành theo cách sau: Sau khi biến nạp, các tế bào được trãi đĩa trong môt trường chứa Ampicillin và nuôi cấy cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc (Hình 5.8a) Tất cả các khuẩn lạc này đều là thể biến nạp (nhớ

rằng các tế bào không biến nạp đều nhạy cảm với Ampicillin (ampS) nên dẽ không tạo khuẩn lạc trong môi trường chọn lọc)

Tuy nhiên, chỉ một vài phân tử chứa pBR322 tái tổ hợp còn đa số chứa các plasmid bình

thường, plasmid “self-ligated” Để xác định thể tái tổ hợp, các khuẩn lạc được cấy

chuyền qua một đĩa môi trường thạch khác chứa Tetracillin (Hình 5.8b) Sau khi nuôi

cấy, một vài khuẩn lạc gốc sẽ phát triển trở lại, số khác thì không (Hình 5.8c) Tế bào của những khuẩn lạc mọc được có chứa pBR322 bình thường (không có chèn DNA) và do đó

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

15

nhóm gen tạo ra tính kháng Tetracillin vẫn hoạt động (ampRtetR) Các khuấn lạc không

phát triển được trên môi trường thạch chứa Tetracillin là thể tái tổ hợp (ampRtetS) Cùng

lúc đó, những khuẩn lạc có cùng vị trí trên đĩa môi trường gốc chứa Ampicillin sẽ được

thu thập lại cho những nghiên cứu xa hơn

Hình 5.8: Chọn lọc pBR322 tái tổ hợp nhờ việc chèn bất hoạt vào gen kháng Tetracillin

a Tế bào được nuôi trên môi trường thạch chứa Ampicillin, tất cả thể biến nạp đều tạo

khuẩn lạc

b Các khuẩn lạc được cấy chuyến qua môi trường chứa Tetracillin

c Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường Tetracillin chứa các tế bào không được tái

tổ hợp (ampRtetR) , còn thể tái tổ hợp (ampRtetS) tuy không mọc được nhưng vị trí

của chúng trên đĩa Ampicillin thì đã được biết

b.Cấy chuyền đĩa – replica plating (môi trường thay đổi, vị trí khuấn lạc thay đổi) Khuôn gỗ

Chạm bề mặt Chạm bề mặt những tế bào bám vào khuôn

Vị trí khuẩn lạc trên môi trường Tetracillin các khuẩn lạc tetR môi trường Ampicillin

16

5.2.2 Sự chèn bất hoạt không phải lúc nào cũng liên quan đến tính kháng kháng sinh Mặc dù việc chèn bất hoạt đối với gen bất hoạt đem lại nhiều thuận lợi để xác định thể tái

tổ hợp song vài plasmid quan trọng dùng trong cloning lại sử dụng hệ thống xác định

khác Một ví dụ là pUC8 (Hình 5.9a) chứa gen kháng Ampicillin và gen “lac Z” mã hóa

cho một phần của enzyme beta galactosidase Cloning với pUC8 liên quan đến sự chèn

bất hoạt của gen “lac Z” mà từ đó xác định được thể tái tổ hợp không có khả năng tổng hợp beta galactosidase ( Hình 5.9b)