Chương 7 : Những vector cloning dành cho các loại tế bào chủ trừ E.coli Hầu hết những thí nghiệm cloning được dùng E.coli làm tế bào chủ và nhiều loại vector phù hợp với vi khuẩn này. E.coli được sử dụng phổ biến khi thí nghiệm cloning nghiên cứu về những đặc điểm của sinh học phân tử như cấu trúc, chức năng gen. Tuy nhiên trong những trường hợp đặc biệt thì ta có thể sử dụng những tế bào chủ khác. Điều này có thể không giúp nghiên cứu gen nhưng ta có thể điều khiển hay cải thiện sự tổng hợp sản phẩm trao đổi chất (ví dụ như hormone insulin) hay thay đổi đặc tính của sinh vật (ví dụ như việc đưa gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây trồng). Do đó chúng ta cần quan tâm đến những vector cloning dành cho những tế bào chủ khác ngoài E.coli. 7.1 Vector dành cho nấm men và những loài nấm khác Nấm men Saccharomyces cerevisiae là loài sinh vật quan trọng trong công nghệ sinh học. Nấm men có vai trò trong sản xuất bia, bánh mì. Ngoài ra, nó còn được sử dụng như vật chủ trong sản xuất các loại dược phẩm từ những gen được clone. Việc khám phá ra một loại plasmid tồn tại trong hầu hết các chủng nấm men S.cerevisiae đã thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển của những dòng vector cloning dành cho nấm men (hình 7.1). Plasmid là một vòng có kích thước 2 µm, là một trong những plasmid có số lượng giới hạn chỉ tìm thấy trong tế bào eukaryote. Hình 7.1 : Plasmid 2 µm của nấm men, REP1 và REP2 phải có trong bản sao của plasmid và FLP mã hóa protein mà có thể biến đổi từ dạng A sang dạng B của plasmid. Tại FLP, trình tự gen được sắp xếp lại bằng sự tái tổ hợp nội phân tử. Chức năng của vùng D chưa được biết chính xác. 7.1.1 Marker chọn lọc cho plasmid 2 µm: Vòng 2 µm phù hợp là vector cloning: kích thước 6 kb, tồn tại trong tế bào nấm men với số lượng copy khoảng 70-200. Việc nhân đôi plasmid yêu cầu một số yếu tố tham gia: ori trên plasmid, vài enzyme được cung cấp từ tế bào chủ, các protein được mã hóa từ gen REP1 và REP2 nằm trên plasmid. Tuy nhiên, plasmid 2 µm làm vector cloning không phải là hoàn toàn hoàn hảo. Vấn đề đầu tiên là marker chọn lọc. Những vector cloning nấm men gần đây mang gen kháng các chất ức chế như methotrexate và copper nhưng hầu hết vector phổ biến sử dụng các loại khác của của hệ thống chọn lọc. Thực tế những gen nấm men bình thường được sử dụng để mã hóa cho enzyme cần trong sự tổng hợp amino acid. Ví dụ: gen LEU2 mã hóa β-isopropyl malate dehydrogenase, đây là enzyme cần trong sự chuyển hóa acid pyruvic thành leucine. Để sử dụng LEU2 như marker chọn lọc thì tế bào chủ là đột biến dị dưỡng. Tế bào chủ này có gen LEU2 bất hoạt. Nấm men leu2 không thể tổng hợp leucine và chỉ có thể tồn tại nếu amino acid này có trong môi trường dinh dưỡng (hình 7.2 (a)). Sự chọn lọc có thể vì sự tái tổ hợp chứa bản sao plasmid chứa gen LEU2 và có thể phát triển khi thiếu amino acid. Trong thí nghiệm cloning, tế bào được cấy trên môi trường thiếu amino acid; và chỉ những tế bào tái tổ hợp mới sống và tạo khuẩn lạc (hình 7.2 (b)). Hình 7.2 Sử dụng gen LEU2 như merker chọn lọc trong thí nghiệm cloning với nấm men. 7.1.2 Vector dựa trên vòng 2 µm – yeast episomal plasmid (YEps) Những vector được chế tạo từ plasmid 2 µm được gọi là YEps. Một số YEps chứa phân tử plasmid 2 µm hoàn chỉnh, một số khác chỉ sử dụng điểm ori của plasmid 2 µm. Ví dụ: YEp13 (hình 7.3). Hình 7.3 Plasmid episomal của nấm men – YEp13 YEp13 thể hiện vài đặc điểm của vector cloning nấm men. Đầu tiên, nó là một shuttle vector gồm: a) Thành phần lấy từ plasmid 2 µm: điểm ori và gen LEU2 làm marker chọn lọc. b) Trình tự hoàn chỉnh của dòng vector pBR322. Cho nên, YEp13 có khả năng sao chép và chọn lọc trong tế bào nấm men hay E.coli. Shuttle vector gặp khó khăn khi thu hồi phân tử DNA tái tổ hợp từ khuẩn lạc nấm men đã biến nạp, do khi shuttle vector được biến nạp vào tế bào nấm men, nó sẽ tích hợp vào một trong những sợi NST trong nhân nấm men. Cho nên tinh sạch mẫu DNA cloning ra khỏi chromosome là một công việc khó khăn và đây cũng là trở ngại lớn cho những thí nghiệm cloning có sử dụng bước đọc trình tự DNA. Nhưng khó khăn trên không xảy ra khi sử dụng vector YEps vì YEps tồn tại độc lập với nhân trong tế bào nấm men. Quy trình chuẩn được sử dụng để cloning trong nấm men là: B1: Tạo và sàn lọc DNA tái tổ hợp sẽ được thực hiện trong E.coli. B2: Tinh khiết và xác định đặc tính phân tử DNA cần cloning. B3: Phân tử DNA mục tiêu được đưa vào tế bào nấm men. (hình 7.4). Hình 7.4 Cloning với vector E.coli-yeast shuttle cụ thể là YEp13. 7.1.3 Đưa YEp vào DNA của nấm men Thuật ngữ “episomal” nói lên rằng YEp có thể sao chép độc lập với nhân và có thể tích hợp vào nhiễm sắc thể trong nhân của nấm men. Hiện tượng tích hợp xảy ra vì trên vector có mang những gen làm marker chọn lọc tương đồng chặt chẽ với các phiên bản của nó nằm trong DNA nhiễm sắc thể nấm men. Ví dụ với YEp13, sự tái tổ hợp có thể xảy ra giữa gen LEU12 của plasmid và gen LEU12 đột biến của nấm men, kết quả là toàn bộ plasmid được đưa vào nhiễm sắc thể của nấm men (hình 7.5). Hình 7.5 Recombination giữa plasmid và gen LEU2 của NST có thể hòa hợpYEp13 trong DNA NST nấm men. Sau đó có 2 copy của gen LEU2, một vẫn giữ chức năng của nó và một bị đột biến. 7.1.4 Những loại khác của vector cloning nấm men Ngoài YEps, còn có vài loại vector cloning dùng cho S.cerevisae: 1. Yeast integrative plasmids (YIps): là plasmid vi khuẩn cơ bản mang gen nấm men. Ví dụ: YIp5 là pBR322 chứa gen URA3 (hình 7.6(a)). Gen này mã hoá cho orotidine-5’-photphate decarbocylase (enzyme xúc tác sự sinh tổng hợp các pyrimidine nucleotide) và được sử dụng như marker chọn lọc như LEU2. YIp không thể tự nhân lên như plasmid và nó không chứa bất cứ phần nào của vòng 2 µm nhưng sự tồn tại của nó phụ thuộc vào sự hợp nhất trong DNA của nấm men. 2. Yeast replicative plasmids (YRps): là plasmid có thể tự nhân đôi độc lập vì có mang một đoạn trình tự DNA của NST. Đoạn trình tự này gồm: đoạn ori nằm gần với gen marker và vài đoạn gen marker chọn lọc. Ví dụ YRp7 (hình 7.6(b)) được tạo từ pBR322, diểm ori có nguồn gốc từ NST và gen TRP1 nằm gần đoạn ori, cần cho sự tổng hợp tryptophan. Hình 7.6 Vector YIp và YRp Các yếu tố quyết định chọn loại vector nấm men nào phù hợp cho thí nghiệm cloning. Thứ 1 là tần số biến nạp (transformation frequency) là số lượng vector biến nạp trong nấm men trên 1µg DNA plasmid. Sử dụng tần số biến nạp cao khi: cần thu một số lượng lớn DNA tái tổ hợp và lượng DNA mẫu ban đầu quá ít. Có thể sử dụng một số loại vector có tần số biến nạp cao như: YEPs (10000–100000 tế bào được biến nạp trên 1µg DNA vector), YRps (1000-10000) và YIps (1000 biến nạp trên 1µg DNA vector nếu sử dụng quy trình đặc hiệu, ngược lại chỉ thu được 1-10 biến nạp). Tần số biến nạp thấp của YIps cho thấy rằng: hiện tượng tích hợp NST với vector YIps hiếm khi xảy ra trước khi vector được giữ lại trong nấm men là cần thiết. Thứ 2 là số lượng copy của vector trong mỗi tế bào. YEps và YRps có số copy cao nhất (20-50 copy với YEps và 5-100 copy với YRps). Trái lại, YIps thường chỉ có 1 copy trên một tế bào. Số copy càng lớn thì càng thu nhiều sản phẩm protein mong muốn. Thứ 3 là tính ổn định của DNA vector tái tổ hợp. YIps tạo ra những DNA tái tổ hợp rất ổn định vì tần số thất thoát khi vector YIps đã được tích hợp vào NST là rất thấp. Những DNA tái tổ hợp tạo ra từ YRp là rất không ổn định do các plasmid này có khuynh hướng tập trung vào tế bào mẹ khi tế bào mẹ sinh ra tế bào con bằng cách nảy chồi. Cho nên các tế bào con trong trường hợp này không chứa DNA tái tổ hợp. Những YEps tái tổ hợp cũng mắc phải những hạn chế như YRp mặc dù những cải tiến trên plasmid 2 µm cho phép YEps ổn định hơn. Tuy nhiên, YIps vẫn được chọn lựa khi thí nghiệm yêu cầu phải giữ được gen mục tiêu trong tế bào nấm men qua nhiều giai đoạn nuôi cấy. 7.1.5 NST nhân tạo (artificial chromosome) được sử dụng để clone đoạn DNA lớn trong nấm men: Vector YAC (yeast artificial chromosome) phát triển từ sự nghiên cứu của NST eukaryote. Thành phần chủ yếu của NST (hình7.7): 1. Centromere: giúp NST phân bố đồng đều về 2 tế bào con trong suốt quá trình phân chia tế bào. 2. Hai telomere: nằm hai đầu mút của NST. Có nhiệm vụ: đảm bảo sự sao chép đầy đủ trình tự DNA ở 2 đầu mút NST trong quá trình nhân đôi và bảo vệ NST khỏi enzyme exonuclease. 3. Những điểm ori: nằm dọc theo NST, ở đó khởi đầu sự sao chép DNA, giống đoạn ori ở plasmid. Hình 7.7 Cấu trúc của chromosome NST nhân tạo được tạo ra bằng kỹ thuật tái tổ hợp rồi phân lập, sau đó kết hợp lại lần nữa trong test tube. DNA trong NST nấm men tự nhiên chỉ vài trăm kb trong khi đó NST nhân tạo có thể clone đuợc đoạn DNA lớn hơn. (a) Cấu trúc và cách dùng vector YAC: pYAC3 (hình7.8(a)) là plasmid pBR322 và có một số gen của nấm men. Trong đó có hai gen URA3 và TRP1 là marker chọn lọc tương ứng cho YIp5 và YRp7. Giống YRp7, đoạn DNA mang TRP1 cũng chứa điểm ori; nhưng trong pYAC3 còn chứa thêm chuỗi CEN4 là DNA ở vùng tâm động NST 4. Đoạn TRP1-ori-CEN4 chứa hai trong ba thành phần của NST nhân tạo. Thành phần thứ ba là telomere (chuỗi TEL). Bản thân hai đoạn trình tự này không phải là 2 telomere hoàn chỉnh nhưgn khi pYAC3 nằm trong nhân nấm men thì TEL có vai trò như một trình tự khơi màu cho telomere của NST trong nhân bám vào. Ngoài ra còn thành phần khác nữa là SUP4. SUP4 là marker chọn lọc, tại vị trí này DNA mục tiêu được chèn trong quá trình cloning. Quá trình cloning với pYAC3 (hình 7.8(b)): B1: Vector pYAC3 bị cắt thành ba đoạn bởi BamHI và SnaBI. Đoạn BamHI bị loại bỏ và 2 đoạn còn lại, mỗi đoạn chứa chứa một trình tự TEL và vị trí SnaBI. B2: DNA được clone phải được cắt tạo đầu bằng (blunt end) với SnaBI (SnaBI là dụng cụ cắt blunt end, nhận diện chuỗi TACGTA). B3: Gắn đoạn DNA mục tiêu vào giữa 2 nhánh còn lại của pYAC3 để tạo NST nhân tạo. B4: Biến nạp NST nhân tạo vào tế bào trần (protoplast) S.cerevisiae. Nấm men được sử dụng là đột biến dị dưỡng kép, trp1 - ura3 - , đột biến thành trp1 + ura3 + khi chứa 2 marker chọn lọc của NST nhân tạo.Những transformant được chọn lọc trên môi trường tối thiểu, chỉ những tế bào chứa biến nạp mang cấu trúc NST nhân tạo chính xác mới có thể phát triển. Bất cứ tế bào nào chứa NST nhân tạo không chính xác (chỉ mang 2 nhánh trái hay 2 nhánh phải hay một trong 2 nhánh) thì sẽ không phát triển trên môi trường do 1 trong 2 marker bị vắng mặt. Sự hiện diện của DNA chèn được kiểm tra bằng phương pháp test cho hiện tượng bất hoạt chèn của gen SUP4 với sự chỉ thị màu: khuẩn lạc trắng thì có recombinant, khuẩn lạc đỏ thì không. Hình 7.8 Vector YAC và cách sử dụng nó để clone đoạn DNA lớn. (b) Ứng dụng của vector YAC NST nhân tạo có thể được nhân lên một cách ổn định trong tế bào nấm men và chúng được sử dụng như phương tiện để clone những gen quá dài. Vài gen quan trọng của động vật lớn hơn 100kb sẽ phức tạp khi clone với E.coli nhưng vẫn thực hiện được với vector YAC. Vì vậy, YACs đã mở ra hướng nghiên cứu về chức năng và cơ chế hoạt động của gen mà trước đây khó thực hiện bằng kỹ thuật DNA recombination. Gần đây, YACs có thể nhân lên trong tế bào động vật từ đó ta có thể phân tích chức năng những gen mà sinh vật mang theo. YAC quan trọng trong việc tạo thư viện gen. Kích thước tối đa của gen đưa vào E.coli là 300 kb, thư viện gen người cần 30000 clone. YAC thường sử dụng để clone đoạn 600kb, ở loài đặc biệt có thể lên đến 1400kb nên chỉ cần 6500 clone cho thư viện gen người. Không may là “mega-YACs” không ổn định trong việc chèn DNA, DNA được clone thỉnh thoảng sắp xếp lại bằng việc tái tổ hợp bên trong phân tử. Nhưng YACs vẫn có giá trị lớn trong việc cung cấp những đoạn DNA lớn được clone sử dụng để sequencing trong Chương trình nghiên cứu gen người (Human Genome Project). 7.1.6 Những vector cho nấm men và nấm mốc khác: Episomal plasmid dựa trên vòng 2 µm của S.cerevisiae có thể nhân lên trong vài loại nấm men khác nhau nhưng điều này vẫn chưa đủ để cho thấy vector 2 µm có giá trị tổng quát. Trong trường hợp recombinant được cung cấp ổn định và phát triển trong thời gian dài trong bioreactor thì YIps là vector phù hợp cho thí nghiệm. Vector bây giờ phải thực hiện được với nhiều loài như nấm men Pichia pastoris, Kluveromyces lactis và nấm sợi Aspergillus nidulans, Neurospora crassa. 7.2 Vector cloning cho thực vật bậc cao: Cloning gen đã tạo ra những cây kháng virus, côn trùng, cà chua biến đổi gen…và nhờ những biến dị mới ở cây trồng bằng kỹ thuật cloning đã cải thiện được chất lượng dinh dưỡng, khả năng phát triển trong điều kiện khắc nghiệt… ở vài loài thực vật. Ba loại hệ thống vector được sử dụng thành công ở thực vật bậc cao: 1) Vector dựa trên plasmid tự nhiên của Agrobacterium. 2) Chuyển gen trực tiếp bằng cách sử dụng đoạn DNA không gắn với một vector cloning của cây. 3) Vector dựa trên virus của thực vật. 7.2.1 Agrobacterium tumefaciens Plasmid vi khuẩn: plasmid Ti (Tumour Inducing) của A.tumefaciens. A.tumefaciens là vi sinh vật đất gây bệnh, tạo khối u (crown gall) ở thực vật hai lá mầm. Crown gall xuất hiện khi gốc cây bị A.tumefaciens xâm nhập vào, dẫn đến sự tăng nhanh mô vùng đó (hình 7.9). Hình 7.9 Bệnh crown gall Khả năng gây crown gall liên quan đến sự hiện diện của plasmid Ti trong tế bào vi khuẩn. Đây là 1 plasmid lớn (>200kb) mang nhiều gen gây nên sự lây nhiễm (hình 7.10(a)). Đặc biệt, plasmid Ti có một phần phân tử có thể hoà hợp với DNA NST của cây (hình 7.10(b)). Đoạn này gọi là T-DNA, kích thước 15 và 30kb. Nó được duy trì ổn định trong cây và được chuyển tới tế bào con như NST toàn vẹn. T- DNA chứa hơn 8 gen được thể hiện ở tế bào thực vật và bảo đảm những gì của tế bào được chuyển nạp. Những gen này cũng tổng hợp trực tiếp những hợp chất hiếm gặp gọi là opine mà vi khuẩn sử dụng như chất dinh dưỡng (hình 7.10(c)). Hình 7.10 Plasmid Ti và sự hòa hợp của nó với DNA NST thực vật sau khi A.tumefaciens xâm nhiễm. (a) Sử dụng plasmid Ti để đưa gen mới vào tế bào thực vật: Gen mới được chèn vào T-DNA và sau đó vi khuẩn hoà hợp chúng với DNA NST của thực vật. Thực tế thì kích thước lớn của plasmid Ti làm thao tác trên phân tử khó khăn. Vấn đề chính là restriction site chỉ có duy nhất thì không thể thực hiện với plasmid kích thước 200kb. Hai cách mới để đưa DNA vào plasmid: 1)Vector đôi (hình 7.11): T-DNA không cần phải gắn trên plasmid Ti. Một hệ thống 2 plasmid, với T- DNA trên một phân tử nhỏ và phần còn lại của plasmid thì bình thường, tạo hiệu quả trong sự chuyển gen. T-DNA plasmid đủ nhỏ để có một restriction site và dễ dàng thao tác. Hình 7.11 Vector đôi. Sự bổ sung cho nhau của plasmid A và B khi chúng cùng hiện diện trong tế bào vi khuẩn A.tumefaciens. Plasmid B mang T-DNA được chuyển tới DNA NST thực vật bằng protein được mã hóa bởi gen trên plasmid A. 2) Sự hoà hợp chung (hình 7.12): Plasmid mới dựa trên pBR322 hay vector E.coli nhưng mang T-DNA. Sự tương đồng giữa phân tử mới và plasmid Ti nghĩa là nếu cả hai hiện diện trong cùng vi khuẩn A.tumefaciens, thì sự tái tổ hợp có thể hoà hợp pBR vào vùng T-NDA. Gen được clone được chèn vào restriction site trên pBR, chuyển vào vi khuẩn A.tumefaciens mang plasmid Ti và sự tái tổ hợp tự nhiên sẽ hòa hợp gen mới vào T- DNA. Sự lây nhiễm của cây dẫn đến gen mới được đưa vào cùng với T-DNA trong NST thực vật. Hình 7.12 Sự hòa hợp chung (b) Tạo cây chuyển gen với plasmid Ti: Làm lây nhiễm vào tế bào thực vật hay tế bào trần trong môi trường lỏng thực hiện hiệu quả hơn ở những cây trưởng thành (hình 7.13). Tế bào TV và tế bào trần được xử lý giống nhau bằng VSV. Ví dụ chúng có thể được tái sinh từ những tế bào chuyển nạp chứa gen được clone trong mỗi tế bào. Tuy nhiên sự tái sinh của một cây chuyển gen chỉ xảy ra nếu vector Ti giảm khả năng gây hại để tế bào chuyển gen không thể hiện bệnh. Điều này có thể thực hiện vì gen bệnh nằm trên T- DNA mà không cần cho quá trình lây nhiễm, đặc tính lây nhiễm điều khiển bởi vùng virulence của plasmid Ti. Gen bệnh được đưa ra khỏi T-DNA, thay thế bằng gen mới mà không làm xáo trộn quá trình lây nhiễm. Hình 7.13 Chuyển gen tế bào thực vật bằng recombinant A.tumefacien . (a) Sự xâm nhiễm vào một vết thương: tế bào thực vật được chuyển nạp chỉ hiện diện trong crown gall (b) Sự chuyển gen trong môi trường lỏng chứa tế bào: tất cả tế bào đều được biến nạp. Vector cloning Ti hiện nay là pBIN19 (hình 7.14) chứa 2 chuỗi trái, phải của T-DNA mang gen lac Z, cloning site và gen kháng kanamycin. Như shuttle vector, E.coli mang pBIN19 được clone, phân tử pBIN19 recombinant được chuyển vào A.tumefaciens và vào cây. Tế bào chuyển gen được chọn lọc bởi môi trường agar chứa kanamycin. Hình 7.14 Vector Ti đôi Plasmid Ti như pBIN19 gần đây được bổ sung bởi vector dựa trên plasmid Ri của A.rhizogenes. Plasmid Ri và Ti khác nhau ở điểm là chuyển T-DNA từ plasmid Ri đến cây không trong một crown gall mà trong tầng lông hút (hairy root). Khả năng rễ được chuyển nạp phát triển ở mật độ cao trong môi trường nuôi cấy và có thể chứa số lượng lớn protein từ gen được clone trong cây. 7.2.2 Cloning gen ở thực vật bằng sự chuyển gen trực tiếp Chuyển gen nhờ plasmid vi khuẩn dạng xoắn (supercoiled), không tự nhân lên trong tế bào thực vật nhưng có thể kết hợp với NST của cây bằng recombination. Sự kết hợp xảy ra một cách ngẫu nhiên ở bất kỳ vị trí nào trên NST thực vật (hình 7.15). Hình 7.15 Chuyển gen trực tiếp Làm sao DNA plasmid xoắn mang theo một marker chọn lọc và một gen đã clone lại có thể chuyển vào tế bào thực vật? Phương pháp là dùng những tế bào trần lơ lửng trong dung dịch nhớt polyethylene glycol (hợp chất tích điện âm, kích thước đa dạng) được dùng để kết tủa DNA trên bề mặt tế bào trần và kích thích bằng quá trình thực hay ẩm bào (hình 7.16(a)). Ngoài ra còn có phương pháp mới: điện xung (electroporation), vi tiêm (microinjection) và dung hợp bằng liposome chứa DNA (hình 7.16(b)). Sau đó, tế bào trần được đặt trong dung dịch kích thích sự tạo vách tế bào và được đưa vào môi trường chọn lọc, tạo mô sẹo. Hình 7.16: Chuyển gen trực tiếp bằng (a) sự tủa DNA trên bề mặt tế bào trần (b) dung hợp với liposome chứa DNA. 7.2.3 Việc thử sử dụng virus thực vật như vector cloning: Những đặc điểm của phage λ và M13 tạo nên những vector cloning quan trọng. Hầu hết thực vật là đối tượng lây nhiễm của virus, vậy có nên dùng virus để clone gen vào thực vật không? Vấn đề là đa số virus có bộ gen là RNA. Các virus này không có lợi để làm vector cloning vì thao tác khó khăn. Chỉ có 2 lớp virus DNA là caulimovirus và geminivirus phù hợp cho cloning gen. Mặc dù vector caulimovirus được dùng để clone gen mới vào cây củ cải nhưng có hai khó khăn. Thứ 1 là kích thước của gen caulimovirus giống như λ. Ngay cả khi bỏ đi những đoạn không cần thiết trên bộ gen virus thì khả năng chèn DNA vẫn bị hạn chế. Vì vậy vector caulimovirus chỉ được dùng để clone những đoạn DNA rất ngắn. Thứ 2 là sự hạn chế tế bào chủ đối với caulimovirus nên thí nghiệm cloning chỉ xảy ra ở loài brassicas như củ cải, bắp cải, bong cải. Còn về geminivirus? Có tiềm năng do khả năng xâm nhiễm tự nhiên vào cây trồng quan trọng như bắp, lúa mì. Nhưng trong quá trình xâm nhiễm, bộ gen của geminivirus tái sắp xếp lại và loại bỏ, mà đó là điều hoàn toàn bất lợi đối với một vector cloning. Và virus này phá hoại cây trồng, vì vậy ứng dụng geminivirus đang được kiểm soát để không lây nhiễm vào quần thể tự nhiên. 7.2.4 Những khó khăn trong cloning gen ở thực vật một lá mầm: Thực tế là A.tumefaciens và A.rhizogenes chỉ xâm nhiễm vào cây hai lá mầm. Ngoài ra, cây một lá mầm còn kháng hoàn toàn với sự biến nạp bằng vector Ti và Ri. Nhưng kỹ thuật mới đã chuyển thành công T-DNA. Tuy vậy, sự chuyển gen với vector Agrobacterium cần sự tái sinh cây nguyên vẹn (intact) từ tế bào trần, tế bào hay mô sẹo nuôi cấy được biến nạp. Việc tái tổ hợp để gắn kết DNA plasmid dạng xoắn vào NST thực vật thì hiệu quả trên cả cây một và hai lá mầm. Vì vậy chuyển gen trực tiếp là cách tốt nhất để có tế bào biến nạp của cây một lá mầm. Để chuyển gen trực tiếp hiệu quả thì thể biến nạp ban đầu phải là tế bào trần, tuy vậy vẫn có khó khăn trong tái sinh cây intact. Khi giải quyết vấn đề này phải tập trung vào kỹ thuật bắn gen (microprojectile) để đưa DNA plasmid vào phôi thực vật. Đã thành công trên cây ngô và một số cây một lá mầm khác. 7.3 Vector cloning cho tế bào động vật: Chuyển gen trực tiếp có thể thực hiện với tế bào động vật nhưng không mấy hiệu quả. NST nhân tạo cũng chưa thể sử dụng được. Vì vậy, những thí nghiệm cloning với tế bào động vật dựa trên vector virus. Vector nguồn gốc virus động vật: Thí nghiệm cloning đầu tiên trên tế bào động vật 1979 với vector virus 40 của khỉ (SV40).Virus này có khả năng nhiễm vào vài loài động vật hữu nhũ. Bộ gen kích thước 5,2kb (hình 7.17(a)) và chứa hai gen: “early gene” biểu hiện sớm chu kỳ xâm nhiễm và mã hóa protein cần cho sự nhân lên của DNA virus; “late gene” mã hóa protein vỏ capsid của virus. SV40 vẫn có vấn đề như vector virus khác ở thực vật là DNA mới chèn vào bộ gen virus không được lớn. Vì vậy, cloning với SV40 phải thay thế một hay nhiều gen trong bộ gen virus (hình 7.17(b)). Từ sau 1979, nhiều loại virus khác được dùng để clone gen ở động vật. Adenovirus có khả năng chứa đoạn DNA được clone lớn hơn so với SV40 nhưng khó thao tác hơn. Papillomavirus cũng có khả năng chứa DNA lớn và có thể tạo ra dòng tế bào biến nạp ổn định. Hình 7.17: SV40 và ví dụ về nó như vector cloning. Để clone gene -globin của thỏ, đoạn giới hạn từ HindIII đến BamHI bị loại bỏ (SVGT-5) và được thay thế bởi gen của thỏ. Bovine papillomavirus (BPV) gây bệnh u bướu ở gia súc, có chu kỳ xâm nhiễm không bình thường ở tế bào chuột, tấn công vào tế bào dưới dạng plasmid với khoảng 100 copy hiện diện trong một tế bào. Điều này không gây chết ở tế bào chuột và phân tử BPV được chuyển vào tế bào con qua sự phân bào. Vector shuttle gồm chuỗi BPV và pBR322 có khả năng nhân lên trong tế bào chuột và vi khuẩn. Và khả năng của baculovirus mang đến cũng rất lớn, giúp tạo lượng lớn protein chứa gen được clone trong tế bào côn trùng. . Ví dụ: YIp5 là pBR322 chứa gen URA3 (hình 7. 6(a)). Gen này mã hoá cho orotidine-5’-photphate decarbocylase (enzyme xúc tác sự sinh tổng hợp các pyrimidine nucleotide) và được sử dụng như marker. có mang một đoạn trình tự DNA của NST. Đoạn trình tự này gồm: đoạn ori nằm gần với gen marker và vài đoạn gen marker chọn lọc. Ví dụ YRp7 (hình 7. 6(b)) được tạo từ pBR322, di m ori có nguồn. tế bào biến nạp ổn định. Hình 7. 17: SV40 và ví dụ về nó như vector cloning. Để clone gene -globin của thỏ, đoạn giới hạn từ HindIII đến BamHI bị loại bỏ (SVGT-5) và được thay thế bởi gen của