Giáo trình -công nghệ di truyền - chương 8 doc

Chương 8 1 CHƯƠNG 8: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CLONE TỪ GENE ÐẶC TRƯNG Vấn đề được quan tâm hiện nay là làm cách nào để tạo phân tử DNA tái tổ hợp và chuyển chúng vào tế bào sống trong thực tiễn nhằm tạo các gen clone chuyên biệt và cung cấp thông tin quan trọng đối với SHPT và CNSH Kiểm tra thử nghiệm gene cloning – thông qua các kỹ thuật có thể chọn lọc trực tiếp những clone mang gene mong muốn hoặc phân biệt chúng với những thể tái tổ hợp khác mà quyết định sự thành công hay thất bại. 8.1 VẤN ĐỀ CHỌN LỌC: Ngay cả những vi sinh vật đơn giản nhất như E.Coli cũng chứa đến hàng ngàn gen và việc phân cắt giới hạn tổng số DNA tế bào tạo ra không chỉ những đoạn mang gen mong muốn mà còn tạo ra các đoạn chứa các gen còn lại.(H8.1a) Trong suốt phản ứng gắn kết sẽ tạo ra nhiều phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau do không có chọn lọc đối với từng đoạn rieng rẻ (H8.1b). Do đó mà có nhiều clone tái tổ hợp được tạo ra sau quá trình biến nạp và plating out ( trải trên đĩa) (H8.1c). Bằng cách nào đó mà xác định clone mong muốn. Hình 8.1: Vấn đề chọn lọc a. Cắt phân tử DNA bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI, rồi chuyển vào vector. b. Kết quả tạo phân tử DNA tái tổ hợp. c. Tất cả đều tạo khuẩn lạc, làm thế nào xác định clone mong muốn. 8.1.1 Hai kỹ thuật cơ bản để tạo clone mong muốn:  Chọn lọc trực tiếp từ gen mong muốn (H8.2a): chỉ những clone từ các gen mong muốn là được tạo ra. Hầu như sự chọn lọc được tiến hành trên đĩa.  Xác định clone từ gen library (H8.2b) :đòi hỏi thử nghiệm ‘shotgun’ cloning ban đầu để tạo clone library chứa hầu hết hoặc tất cả các gen có trong tế bào, sau đó phân tích từng clone riêng rẻ để xác định clone mong muốn. Hình 8.2: Hai kỹ thuật cơ bản xác định clone chuyên biệt a. Chọn lọc trực tiếp: chỉ thể tái tổ hợp mong muốn mới có thể sống sót. b. Xác định thể tái tổ hợp mong nuốn từ một clone library Chương 8 2 Trong các trường hợp tổng quát, thường sử dụng phương pháp chọn lọc trực tiếp do nhanh, rõ ràng nhưng không phải thích hợp cho tất cả các gen. Vì thế kỹ thuật xác định clone là rất quan trọng. 8.2 CHỌN LỌC TRỰC TIẾP: Điều cần thiết để có một cloned gen là plate (trải trên đĩa) những sản phẩm đã được biến đổi trên môi trường agar – môi trường chỉ cho phép những thể tái tổ hợp phát triển. Do đó chỉ những khuẩn lạc thu có các tế bào chứa phân tủ DNA tái tổ hợp. Ví dụ: chọn gen mong muốn có tính kháng chuyên biệt đối với kháng sinh. Cloned gene kháng kanamycin của plasmid R6-5( thật ra plasmid này mang gen kháng đến 4 loại khánh sinh: Kanamycin, Chloramphenicol, Streptomycin và Sulphonamide). Dùng E.CoRI cắt DNA plasmid tạo 13 đoạn gen và gen kháng Kanamycin nằm ở 1 trong 13 đoạn này (H8.3a). Để clone gen này, các đoạn thu được sau khi cắt bằng E.CoRI sẽ được chèn vào vị trí cắt của E.CoRI của vectorp BR322. Hỗn hợp nối kết gồm nhiều bản sao của 13 phân tử DNA tái tổ hợp, trong đó có gen kháng Kanamycin.(H8.3b) Những đoạn không có tính chèn sẽ ko được dùng để chọn lọc thể tái tổ hợp khi vị trí cắt của E.CoRI trên pBR322 được tạo ra. Điều này là do vị trí cắt không nằm trên gen kháng Ampicilin hoặc tetracylin ở plasmid này (H6.1).Điều này lại không quan trọng đối với việc clon gen kháng kanamycin do ở đây gen cần clon được sử dụng như 1 marker chọn lọc.Các sản phẩm biến nạp được trải trên đĩa thạch có chứa kanamycin, ở đó chỉ có thể tái tổ hợp chứa gen kháng kanamycin mới có khả năng sống sót và tạo ra khuẩn lạc (H8.3c). Hình 8.3:Chọn lọc trực tiếp clone gen kháng kanamycin của plasmid R6-5 a. Plasmid R6-5 bị phận cắt thành 13 đoạn khác nhau bởi EcoRI b. Gắn kết 13 đoạn gen này vào vector tạo 13 phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau, trải trên đĩa (plate out) c. Chỉ có một thể tái tổ hợp mọc được trên môi trường agar chứa kanamycin (50µg/ml), đó là thể chứa gen kháng kanamycin a.Marker rescue mở rộng phạm vi chọn lọc trực tiếp: Chương 8 3 Hạn chế của chọn lọc trực tiếp là chỉ dùng để clone các gen kháng kháng sinh. Hiện nay người ta sử dụng các dòng đột biến từ E.Coli làm vật chủ cho sự biến nạp được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật. Ví dụ: clone gen trpA từ E.coli – gen này mã hóa cho enzyme tổng hợp tryptophan (một loại aa thiết yếu). Dòng E.coli đột biến chứa gen không có chức năng trpA - chỉ sống sống trong mối trường tăng sinh có tryptophan. Và dòng E.coli trpA - là ví dụ về sự khuyết dưỡng. Dòng E.coli trpA - dùng để clone các bản sao của gen trpA: tinh sạch toàn bộ DNA từ dòng wilde-type không bị đột biến. Cắt DNA bằng enzyme endonuclease giới hạn, tiếp theo gắn kết vào một vector, tạo nhiều phân tử DNA tái tổ hợp trong đó có thể tái tổ hợp mang bản sao của gen trpA (H8.4a). Ngày nay hỗn hợp gắn kết được sử dụng để biến nạp vào các tế bào E.coli trpA - khuyết dưỡng.(H8.4b) Một số tế bào không bị khuyết dưỡng – không đòi hỏi tryptophan do các gen cần clone có khả năng sản xuất trực tiếp tryptophan (H8.4c). Do đó chọn lọc trức tiếp được thực hiện bằng cách trải đĩa các thể biến nạp lên môi trường tối thiểu không thêm chất bổ sung (tryptophan) (H8.4d). Thể khuyết dưỡng không mọc trên môi trường tối thiểu do vậy khuẩn lạc xuất hiện là thể tái tổ hợp chứa gen trpA cần clone. Hình 8.4: Chọn lọc trực tiếp clone gen trpA của dòng E.coli trpA - a. Tạo pBR322 tái tổ hợp b. Chuyển vào E.coli trpA - c. Gen plasmid được biểu hiện d. Trải trên môi trường tối thiểu (plate on to minimal medium), chỉ có thể tái tổ hợp trpA + sống được b. Phạm vi ứng dụng và hạn chế của marker rescue: Mặc dù marker rescue được sử dụng để clone gen, nhưng gặp phải hạn chế:  Dòng đột biến phải có hiệu lực đối với gen quan tâm  Cần môi trường chỉ có wild-type mới có thể sống sót ( những đột biến khuyết dưỡng không sống được) Trong nhiều trường hợp tổng quát, marker rescue ứng dụng cho các gen mã hóa các enzyme sinh tổng hợp, các gen này đã được chọn lọc từ môi trường tối thiểu (giống cách thức của trpA). Tuy nhiên, kỹ thuật này không hạn chế đối với Chương 8 4 E.coli và vi khuẩn, các dòng nấm men và nấm sợi khuyết dưỡng, marker rescue dùng để chọn lọc các genes cloned vào các sinh vật này. 8.3 XÁC ĐỊNH MỘT CLONE TỪ LIBRARY: a. Gene libraries: Gen library (trang130) là tập hợp nhiều clone khác nhau, hầu như chứa mọi gen đơn hiện diện trong một sinh vật cụ thể. Chuẩn bị gen library: tinh sạch DNA tổng số, đánh dấu điểm phân cắt giới hạn từng phần (a partial restriction digest), kết quả tạo ra các đoạn được clone vào vector thich hợp (H8.5), thường là vector thay thế lamda, cosmid, YAC. Hình 8.5: Chuẩn bị gen library từ vector cosmid Phân cắt DNA tế bào bằng Sau3A thành những đoạn có độ dài khoảng 35kb, gắn kết các đoạn này vào cosmid. Bảo quản invito, nhiễm vào E.coli. Tập hợp các dĩa petri mang khuẩn lạc tạo gene library Đối với vi khuẩn, nấm men, nấm sợi số clone cần tạo một gen library hoàn chỉnh không quá lớn do khó điều chỉnh (H6.1) Đối với động vật, thực vật dù một library hoàn chỉnh chứa nhiều clone khác nhau thì việc xác định clone mong muốn được chứng minh từ voi mamoth. Đối với những sinh vật này, loại library thứ hai, chuyên biệt không chỉ chuyên biệt đối với tất cả sinh vật mà còn đối với từng loại tế bào cụ thể hữu ích hơn. b. Không phải tất cả các gen biểu hiện cùng lúc: Đặc trưng của sinh vật đa bào là sự chuyên hóa của từng tế bào. Mỗi tế bào chứa những gen bổ sung giống nhau nhưng khác nhau về thành phần gen hoạt động và không hoạt động (H8.6) Hình 8.6: Các gen khác nhau được biểu hiện trong những loại tế bào khác nhau Thật ra chỉ có một vài gen được biểu hiện trong một tế bào được dùng để lập library nếu nguyên liệu này mRNA thay vì DNA. Nếu mRNA được sử dụng như vật liệu khởi đầu thì clone thu được là sự chọn lọc toàn bộ các gentrong tế bào. Kỹ thuật cloning dùng mRNA đặc biệt hữu ích nếu gen mong muốn được biểu hiên ở tỷ lệ cao trong từng loại tế bào cụ thể.Ví dụ: gen mã hóa giadin – một trong các protein quan trong có ở lúa mì, biểu hiên ở mức độ cao trong nhhung74 tế bào hạt đang phát triển. Trong các tế bào này có trên 30% mRNA chuyên biệt Chương 8 5 mã hóa gliadin. Rõ ràng nếu chúng ta có thể clone mRNA từ hạt lúa mì thì có thể thu được lượng lớn clone chuyên biệt mã hóa gliadin. c. Clone mRNA tương tự như cDNA: mRNA không thể tự gắn kết vào vector dùng để clone. Tuy nhiên mRNA có thể chuyển hóa thành DNA thông qua sự tổng hợp cDNA. Điều cốt yếu của phương pháp này là enzyme reverse trascriptase (RT) (Trang 58) dùng tổng hợp mạch bổ sung polynucleotide từ mạch RNA (H8.7a) Khi cDNA được tổng hợp, phân tử lai RNA bị phân giải từng phần bởi nuclease H (H8.7b). Các đoạn RNA còn lại đóng vai trò là primers (Trang 57) để polymerase I tổng hợp mách cDNA (H8.7c), tạo DNA mạch kép và sẽ gắn kết vào vector và clone (H8.7d). Các clone cDNA thu được là sự hiện diện của mRNA chuẩn bị ban đầu. Trong trường hợp mRNA lấy từ hạt lúa mì, cDNA library chứa một lượng lớn clone mRNA mã hóa gliadin.(H8.7e). Hình 8.7: Sơ đồ cloning cDNA a. Tổng hợp mạch đầu tiên: mRNA gắn đuôi polyA sẽ bắt cặp với primer oligo(dT) tạo mạch DNA nhờ reverse transcriiptase b. Phân giải RNA bằng Rnase H tạo các doạn RNA c. Tổng hợp mạch thứ hai từ những đoạn RNA bị phân cắt trước đó nhờ DNA polI tạo cDNA mạch kép d. Gắn kết cDNA vào vector e. Biến nạp 8.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLONE: Xác đính clone dựa vào sản phẩm dịch mã của gen được clone, nhưng thường dùng kỹ thuật hydrization probing xác định trực tiếp phân tử DNA tái tổ hợp thì chính xác hơn. 8.4.1. Lai các mạch nucleic acid bổ sung với nhau: Hầu hết sự bắt cặp của các phân tử acid nucleic tạo cấu trúc lai không ổn định bởi chỉ một số ít các liên kết bên trong mạch được hình thành (H8.8a). Tuy nhiên nếu các polynucleotide bổ sung nhau, sau đó mở rộng sự bắt cặp giữa các base sẽ tạo ra các phân tử mạch kép ổn định (H8.8b) Hình 8.8: Lai acid nucleic Chương 8 6 a. Phân tử lai không ổn định được tạo từ 2 mạch DNA không tương đồng. b. Thể lai ổn định tạo ra giữa 2 mạch bổ sung (có vùng ngắn không bổ sung nhưng không ảnh hưởng đến tính ổn dịnh chung) c. Thể lai DNA – RNA tạo ra từ một gen và bản sao của nó Sự bắt cặp xảy ra giữa các phân tử DNA - DNA, RNA – RNA, DNA – RNA. Sự lai acid nucleic được xác dùng để xác định từng clone tái tổ hợp nếu probe (là DNA hoặc RNA) bổ sung với gen mong muốn có hiệu quả. 8.4.2. Việc dò tìm khuẩn lạc bằng phương pháp lai và vòng tan thực khuẩn thể (plaque) (colony and plaque hybridization probing) Hybridization probing dùng xác định phân tử DNA tái tổ hợp có trong khuẩn lạc vi khuẩn hay plaque. Phương pháp: Chuyển khuẩn lạc hay plaque lên màng nitro cellulose hay màng nylon (H8.9a), sau đó xử lý loại bỏ chất nhiễm bẩn chỉ giữ lại DNA (H8.9b). Việc xử lý thường làm biến tính phân tử DNA, làm đứt liên kết hydro trong từng mạch của chuỗi xoắn kép. Các phân tử mạch đơn này được gắn chặt vào màng thông qua xử lý nhiệt: màng nitrocellulose xử lý ở 80 0 C; chiếu tia UV nếu sử dụng màng nylon. Các phân tử sẽ bám vào màng bằng liên kết đường – phaosphat (sugar – phosphate backbones), do đó các base sẽ không bắt cặp với phân tử acid nucleic bổ sung. Probe được đánh dấu, biến tính bằng nhiệt, rối chuyển lên màng ở dạng hóa chất hòa tan làm tăng cường sự lai acid nucleic (h8.9c). Sau khi lai, rửa lọc (filter) để loại bỏ probe không gắn kết, làm khô và xác định vị trí của probe đã gắn kết. Hình 8.9: Dò tìm khuẩn lạc (colony hybridization probing) bằng probe có đánh dấu phóng xạ a. Chuyển khuẩn lạc lên màng nitrocellulose hay nylon, vi khuẩn bám dính vào màng. b. Phân giải tế bào bằng cách sử dụng hổn hợp alkali và protease, sau đó tinh sạch DNA, gắn kết DNA lên màng thông qua xử lý nhiệt c. Probe bằng DNA được đánh dấu d. Đọc kết quả qua phóng xạ tự ghi. Chương 8 7 Trước đây sử dụng nucleotide được đánh dấu phóng xạ (radioactive nucleotide) hay bằng việc tạo vết cắt nhỏ (nick) hoặc biến đổi đầu bằng thành đầu lồi (end – filling) – xem thêm glossary hoặc alternatively bằng cách sử dụng các hexamer DNA ngẫu nhiên gắn kết với DNA chuỗi đơn (random priming) (H8.10) tạo probe có hoạt tính cao có thể phát hiện một số lượng nhỏ DNA nối kết màng. Phát hiện tín hiệu lai thông qua phóng xạ tự ghi. Do đánh dấu phóng xạ gây nguy hiểm nên prbe được đánh dấu bằng chất không có hoạt tính phóng xạ(H8.11) Hình 8.10: Đánh dấu DNA bằng cách sử dụng các hexamer DNA ngẫu nhiên gắn kết với DNA chuỗi đơn (random priming). Hổn hợp hexamer ngẫu nhiên (hexameric oligonuclotides của trình tự ngẫu nhiên) là phức hợp áo chứa ít nhất một vài phân tử có thể bắt cặp (base – pair) với probe. DNA mạch kép bị biến tính bởi nhiệt độ tạo DNA mạch đơn. Bổ sung hexamer oligonucleotides ngẫu nhiên, một số hexamer bắt cặp.Thêm Klenow polymerase và dNTPs, một trong hai loại đã được đánh dấu, DNA gắn kết trên màng được đánh dấu. Sau đây là 2 phương pháp đánh dấu probe không có hoạt tính phóng xạ: Phương pháp 1: sử dụng dUTP đã biến đổi qua phản ứng với phản ứng với biotin – một phân tử hữu cơ có ái lực mạnh đối với protein avidin tạo biotin – dUTP, sau đó tiến hành lai. Rửa và phát hiện vị trí lai của các biotin – dUTP đã gắn kết bằng marker có đánh dấu huỳnh quang (H8.11a). Phương pháp 2: probe DNA được trộn chung với horseradish peroxidase và phát hiện thông qua hoạt tính phân giải luminol của enzyme nhờ sự phát quang qua phản ứng hóa học (H8.11b). Tín hiệu này được ghi nhận qua film từ máy ảnh giống như chụp bằng tia phóng xạ. 8.4.3. Ví dụ thực tiễn sử dụng mẫu dò để lai: Trong thực hành bản chất của probe được quy định bởi thông tin có thể về gen mong muốn. Ở đây ta xét đến 3 khả năng:  Vị trí trong tế bào mà gen mong muốn biểu hiện ở mức độ cao thì sử dụng lập cDNA library.  Nơi nào mà trình tự amino acid của protein được mã hóa bởi gen thì được biết hoàn toàn và chuyên biệt.  Vị trí gen thuộc họ gen có liên quan (a) Làm giàu probe để phân tích cDNA library, thu nhận cloned gen: Chương 8 8 Việc xác định những clone gliadin là trường hợp đơn giản của việc sử dụng các cDNA riêng biệt từ library để probe các thành phần khác của library (H8.12). Một clone được chọn lọc ngẫu nhiên; phân tử DNA tái tổ hợp được tinh sạch, đánh dấu và dùng probe các clone tồn tại. Việc làm giàu cDNA được xem như tạo một clone gliadin và được phân tích chi tiết hơn (giải trình tự DNA, li trích sản phẩm dịch mã) để đưa ra kết luận. (b) Những probe oligonucleotide dùng cho các gen đã biết được đặc tính của sản phẩm dịch mã: Thường các gen dùng để clone mã hóa cho protein được nghiên cứu khá chi tiết và đã biết trước. Nếu biết được trình tự aa, có thể dùng genetic code để dự đoán trình tự của gen tương ứng. Sự suy đoán này chỉ mang tính tương đối bởi chỉ có methionine và tryptophan được mã hóa hóa bởi bộ ba codon (can be assigned unambiguously to triplet codons), tất cả aa khác được mã hóa bởi ít nhất 2 codon cho một aa. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp, các codon khác nhau mã hóa cho từng aa khác nhau có liên quan nhau. Chẳng hạn, alanine mã hóa bởi GCA, GCT, GCG, GCC. Vì thế, 2 trong 3 Nu của bộ ba mã hóa alanine có thể đoán đúng. Ví dụ sau sẽ làm rõ cách thực hiện những suy đoán này. Xét cytochrom c – một protein đóng vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp mô bào của sinh vật hiếu khí. H8.13 trình bày trình tự protein cytochrom c của nấm men, trình tự này chứa một đoạn bắt đầu tại vị trí aa 59 : Trp – Asp – Glu – Asn - Asn – Met. Trình tự này được mã hóa bởi TGG – GA T C – GA A G – AA T C – AA T C – ATG. Although this represents a total of 16 different possible sequences, 14 trong 18 Nu có thể đoán đúng. Tuy nhiên ngày nay thì những đoạn oligonucleotide ngắn của trình tự đoán trước (predetermined sequence) có thể được tổng hợp trong phòng thí nghiệm (H8.14). Vì thế một probe oligoNu có thể tạo ra dựa theo trình tự Nu suy đoán và probe này có thể xác định gen mã hóa protein. Ví dụ, cytochrom c của nấm men, 16 oligoNu có thể mã hóa cho Trp – Asp – Glu – Asn – Asn – Met sẽ được tổng hợp, hoặc phân chia hoặc tổng hợp (either separatedly or as a pool) và sau đó sử dụng probe genomic nấm men hoặc cDNA library (H8.15). Probe có vài Nu tương đồng với cytochrom c gene cung cấp đầy đủ tín hiệu lai rõ ràng.Thậm chí nếu nhiều hơn 1 clone cho kết quả lai dương tính, việc reprobe với 1 oligoNu định trước bởi một đoạn khác của trình tự aa cytochrom c đưa kết quả xác định (H8.15). Tuy nhiên phái chọn lựa đoạn protein dùng đoán trình tự Nu, chú ý: hexapeptide Ser – Glu – Tyr – Leu – Thr – Asn có thể được mã hóa bởi vài ngàn trình tự 18 Nu, rõ ràng đây là sư lựa chọn không thích hợp đối với phương pháp tổng hợp probe. Chương 8 9 Hình 8.14: Sơ đồ đơn giản hóa sự tổng hợp oligoNu. Những nhóm bảo vệ (protecting groups) được gắn vào điểm cuối của đầu 5 ’ và đầu 3 ’ ngăn chặn sự phản ứng giữa các Nu đơn riêng lẻ. Bằng cách kiểm soát thời gian một cách chặt chẽ vào những thời điểm loại bỏ protecting groups, các monoNu có thể thêm vào từng cái một cho sự tổng hợp. Hình 8.15: Việc sử dụng các oligoNu cuối đã được đánh dấu (synthetic, end – labelled oligonucleotides) để xác định clone gene cytochrom của nấm men: các oligoNnu này tạo thể lai với clone cytochrom c , qua phóng xạ tự ghi phát hiện được clone cytochrom c. Reprobe với oligoNu được dự đoán trước thứ hai: xác nhận kết quả clone cytochrom c (c) Việc dò tìm khác nguồn gốc (heterologous probing) cho phép xác định gen liên quan (related genes): Thường một số lượng đáng kể Nu tương đồng được nhận ra khi 2 gen mã hóa cho cùng một loại protein, nhưng từ những sinh vật khác nhau thì phải được so sánh, phản ánh sự duy trì cấu trúc gen tring suốt quá trình biến đổi. Thông thường, hai gen thừ những sinh vật có quan hệ thì tương đồng for probe mạch đơn chuẩn bị từ một gen để định dạng thể lai (hybrid) ổn định với gen thứ hai. Mặc dù 2 phân tử không bổ sung toàn vẹn nhưng đủ base pairs thì sẽ được định dạng để tạo cấu trúc ổn định.(H8.16) Hình 8.16: Sử dụng một phân tử acid nucleic để nhận dạng các phân tử có liện quan bằng cách lai với probe (heterologous probing) a. Thể lai giữa các mạch DNA có liên quan (related DNA): tạo cấu trúc ổn định b. Heterologous probing giữa các loài ( gen cytochrom c nấm men được đánh dấu + gene library của DNA Neurospora có thể tạo được clone cytochrom c Neurospora). Chương 8 10 c. Heterologous probing trong cùng một loài (gene library lúa mì + gliadin cDNA được đánh dấu tạo members of the gliadin multigene family). Heterologous probing sử dụng phép lai giữa các trình tự liên quan để xác định clone. Ví dụ: cytochrom c gen của nấm men được xác định trước bằng oligoNu probing cũng có thể nó được dùng như hybridizatio probe để xác định những cytochrom c gen trong các clone library của sinh vật khác. Một probe chuẩn bị từ gen nấm men sẽ không bổ sung nguyên vẹn với gen nấm men nhưng những base bắt cặp đầy đủ sẽ xảy ra trong một phép lai được định dạng và phat hiện bằng phóng xạ tự ghi.(H8.16b).Điều kiện thí ngiệm sẽ biến đổi để cấu trúc khác nguồn không mất ổn định và biến mất trước khi chụp ảnh phóng xã tự ghi. Heterologous probing cũng có thể xác định các related gen trong cùng một sinh vật. Nếu clone cDNA gliadin ở lúa mì được xác định để probe một genomic library sẽ tạo thể lai không chỉ với chính bản thân gen của nó mà còn với các gen khác. (H8.16c). Tất cả chúng liên quan với cDNA gliadin, nhưng có trình tự khác biệt không đáng kể.Đó là do gliadins lúa mì định dạng một phức nhom protein liên quan được mã hóa bởi các gen trong họ đa gen. Một khi một gen trong họ được clone thì sau đó những gen khác được cô lập bằng heterologous probing. 8.4.4. Phương pháp xác định dựa trên việc phát hiện sản phẩm dịch mã của gen cần clone: Hybridization probing là phương pháp đước ưa chuộng hơn trong việc xác định thể tái tổ hợp chuyên biệt từ clone library. Đây là kỹ thuật đợn giản, sử dụng để kiểm tra đến 10 000 thể tái tổ hợp cho một thí nghiệm cho phép chụp ảnh (screen) các gen library lớn có thể chụp trong thời gian ngắn có thể. Tuy nhiên yêu cầu đối với một probe có ít nhất một phần bổ sung với gen mong muốn vài lần đề được sử dụng để tạo thể lai trong việc xác định clone. Luân phiên dò tìm bằng phép lai (hybridization probing) là sự chọn lọc miễn dịch (immunological screening). Sự khác biệt là ở chổ: hybridization probing sẽ probe những đoạn DNA được clone một cách trực tiếp, còn phương pháp miễn dịch phát hiện protein mã hóa bởi gen được clone. Vì thế kỹ thuật miễn dịch giả định rằng gen được clone đang biệu hiện, do đó protein được tạo ra và không hiện diện một ách bình thường trong tế bào chủ. (a). Yêu cầu sử dụng kháng thể cho phương pháp phát hiện miễn dịch: Nếu một protein tinh sạch được tiêm vào máu thỏ, hệ thống miễn dịch của thỏ sẽ tổng hợp kháng thể để gắn kết và phân giải protein ngoại lai. Đây là một dạng (version) của cơ chế bảo vệ tự nhiên của cơ thể mà động vật sử dụng để chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, virus và các tác nhân truyền nhiễm khác. Yêu cầu đối với thỏ là tỷ lệ kháng thể có trong máu đủ cao có thể trải qua vài ngày để chất lượng được tinh sạch. (H8.17). Kháng thể được tinh sạch này chỉ liên kết với protein đã tiêm cho con thỏ ban đầu. [...].. .Chương 8 (b) Sử dụng kháng thể tinh sạch để phát hiện prtein trong khuẩn lạc tái tổ hợp Có nhiều kiểu chọn lọc miễn dịch nhưng phương pháp hữu ích nhất là dò tìm trực tiếp bằng thể lai bản sao (đối chiếu) của khuẩn lạc (a direct counterpart of colony hybridization probing) Các khuẩn lạc chứa thể tái tổ hợp được chuyển lên màng... tái tổ hợp được chuyển lên màng lai polyvinyl, làm dung giải tế bào, thêm vào dung dịch chứa kháng thể đặc biệt (H8.18a) Kháng thể được đánh dấu hoặc màng được rửa với dung dịch protein A được đánh dấu – một protein vi khuẩn gắn kết chuyên biệt với globulin miễn dịch sản xuất kháng thể (H8.18b) Nguyên tử đánh dấu có thể là chất có hoạt tính phóng xạ, trong trường hợp đó phát hiện khuẩn lạc liên kết với... lạc liên kết với nguyên tử được đánh dấu bằng phóng xạ tự ghi hoặc bằng tín hiêu huỳnh quang nếu nguyên tử đánh dấu không có hoạt tính phóng xạ, cũng có thể phát hiện bằng sự phát quang hóa học Hình 8. 18: Sử dụng kháng thể tinh sạch để phát hiện protein trong các khuẩn lạc tái tổ hợp Thay vì sử dụng protein A đã được đánh dấu, thì có thể sử dụng chính kháng thể được đánh dấu hoặc một kháng thể được... xạ tự ghi: kết quả dương tính là protein tái tổ hợp đã được clone (c) Những vấn đề biểu hiện gen: Immunological screening phụ thuộc vào gene được clone đang biểu hiện để sản phẩm dịch mã protein hiện di n trong các tế bào tái tổ hợp Tuy nhiên, gen của sinh vật này thì không biểu hiện trong sinh vật khác Đặc biệt, thật không giống như các gen được clone ở động thực vật được biểu hiện trong tế bào E.coli . thành (H8.8a). Tuy nhiên nếu các polynucleotide bổ sung nhau, sau đó mở rộng sự bắt cặp giữa các base sẽ tạo ra các phân tử mạch kép ổn định (H8.8b) Hình 8. 8: Lai acid nucleic Chương 8 6 a của sinh vật hiếu khí. H8.13 trình bày trình tự protein cytochrom c của nấm men, trình tự này chứa một đoạn bắt đầu tại vị trí aa 59 : Trp – Asp – Glu – Asn - Asn – Met. Trình tự này được mã. nhận cloned gen: Chương 8 8 Việc xác định những clone gliadin là trường hợp đơn giản của việc sử dụng các cDNA riêng biệt từ library để probe các thành phần khác của library (H8.12). Một clone