thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế bằng kỹ thuật trung hòa

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ ************** BÙI SỸ DŨNG thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván tinh chế kỹ thuật trung hßa Chuyên ngành : Vi sinh Y học Mã số : 60.72.68 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS TS Lê Văn Phủng HÀ NỘI - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ************** BỘ Y TẾ BI S DNG thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván tinh chế b»ng kü thuËt trung hßa LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI – 2011 : PGS.TS, Lê Văn Phủng, Viện trưởng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế, Trưởng môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện cho nghiên cứu định Quố , khơng phải , người viên M Bùi Sỹ Dũng Bùi Sỹ Dũng CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ab: Kháng thể (Antibody) Ag: Kháng nguyên (Antigen) CV: Hệ số biến thiên (Coefficient of variation) DĐVN IV: Dược điển Việt Nam IV DD/dd: Dung dịch ELISA: Thử nghiệm miễn dịch gắn men (Enzyme-linked Immunosorbent assay) RIA: Thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (Radio-Immuno-Assay) Fab: Mảnh Fab (Antigen binding fragment) Fc: Mảnh Fc (Cristallizable fragment) GMP: Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice) IVAC Viện vắc xin sinh phẩm y tế (Institute of vaccine and medical biologicals) IgG: Immunoglobulin G IU: Đơn vị quốc tế (Internationnal Unit) KĐQG: Kiểm định quốc gia HTKĐTUVC: Huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn HTKĐTUVTN: Huyết kháng độc tố uốn ván thử nghiệm L+/10: Liều thử thách độc tố uốn ván MC: Mẫu chuẩn MCQT: Mẫu chuẩn quốc tế MTN: Mẫu thử nghiệm NICVB: Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm Y tế (National Institute for Control of Vaccine and Biologicals) OD: Mật độ quang học (Optical Density) TN: Thử nghiệm TRS: Hồ sơ kỹ thuật (Technical Report Series) TCYTTG: Tổ chức Y tế giới (WHO) (World Health Organization) TIG-H: Kháng độc tố uốn ván có nguồn gốc từ người (Tetanus Immuno-Globulin-Human) ISO: Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế (International Standard Organization) SAT: Kháng độc tố uốn ván (Serum Anti Tetanus) SOP: Quy trình chuẩn (Standard Operating Procedure) SD: Độ lệch chuẩn (Standard deviation) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 14 1.1 Thẩm định qui trình 14 1.1.1 Những trường hợp cần phải thẩm định qui trình 14 1.1.2 Yêu cầu chung 14 1.1.3 Các tiêu thẩm định qui trình xét nghiệm, kiểm định 15 1.2 Vi khuẩn uốn ván huyết kháng uốn ván 20 1.2.1 Vi khuẩn uốn ván 20 1.2.2 Kháng độc tố uốn ván 24 1.2.3 Huyết kháng độc tố uốn ván 26 1.2.4 Sản xuất huyết kháng độc tố uốn ván 27 1.3 Kiểm định chất lượng huyết kháng độc tố uốn ván 33 1.3.1 Yêu cầu chung 33 1.3.2 Các tiêu chí kiểm tra chất lượng kháng độc tố uốn ván 33 1.3.3 Xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván kỹ thuật trung hòa 35 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Nguyên vật liệu 41 2.2.1 Động vật thí nghiệm 41 2.2.2 Độc tố uốn ván 41 2.2.3 Mẫu chuẩn 41 2.2.4 Mẫu thử nghiệm 41 2.2.5 Dung dịch pha độc tố uốn ván huyết kháng độc tố uốn ván .41 2.2.6 Dụng cụ 42 2.3 Phương pháp nghiên cứu 42 2.3.1 Thiết kế thử nghiệm cách xác định độ đúng, hệ số biến thiên, hệ số tương quan 42 2.3.2 Các bước tiến hành cho lần thử nghiệm 44 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 Độ 48 3.2 Độ xác 55 3.3 Độ tuyến tính 62 Chƣơng 4: BÀN LUẬN 63 4.1 Thử nghiệm "có giá trị" "khơng có giá trị" 63 4.2 Độ 64 4.2.1 Trọng lượng chuột tham gia thử nghiệm 64 4.2.2 Độ dao động kết thử nghiệm 64 4.2.3 Độ qui trình 65 4.3 Độ xác 66 4.3.1 Trọng lượng chuột tham gia thử nghiệm 66 4.3.2 Độ dao động kết thử nghiệm 66 4.3.3 Độ lặp lại độ xác trung gian 67 4.4 Độ tuyến tính 67 KẾT LUẬN 70 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Độ pha loãng cao mẫu thử gây chết chuột lần thử nghiệm xác định độ 48 Bảng 3.2 Trọng lượng chuột (g) sử dụng xác định độ 49 Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) kết thử nghiệm so với giá trị thực mẫu (độ đúng) 54 Bảng 3.4 Độ pha loãng cao mẫu thử gây chết chuột lần thử nghiệm xác định độ xác 55 Bảng 3.5 Trọng lượng chuột (g) sử dụng xác định độ xác 56 Bảng 3.6 Kết thử nghiệm tính theo % so với giá trị trung bình mẫu xác định độ xác qui trình 60 Bảng 3.7 Hệ số biến thiên xác định độ lặp lại qui trình 61 Bảng 3.8 Hệ số biến thiên xác định độ xác trung gian qui trình 61 10 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Minh họa độ độ xác qui trình 19 Hình 1.2 Bệnh nhân uốn ván 20 Hình 1.3 Trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani) 21 Sơ đồ 1.1 Cấu trúc phân tử độc tố uốn ván sản phẩm thu sau xử lý với Papain Thio urea 23 Sơ đồ 1.2 Tóm tắt qui trình sản xuất kháng độc tố uốn ván từ ngựa 28 Hình 1.4 Minh họa thử nghiệm trung hòa 36 Biểu đồ 3.1 Kết thử nghiệm độ mẫu nồng độ 1000 IU/mL 51 Biểu đồ 3.2 Kết thử nghiệm độ mẫu nồng độ 1100 IU/mL 52 Biểu đồ 3.3 Kết thử nghiệm độ mẫu nồng độ 1200 IU/mL 52 Biểu đồ 3.4 Kết thử nghiệm độ mẫu nồng độ 1300 IU/mL 53 Biểu đồ 3.5 Kết thử nghiệm độ mẫu nồng độ 1400 IU/mL 53 Biểu đồ 3.6 Kết thử nghiệm độ xác trung gian mẫu lô số 324 58 Biểu đồ 3.7 Kết thử nghiệm độ xác trung gian mẫu lô số 325 59 Biểu đồ 3.8 Kết thử nghiệm độ xác trung gian mẫu lơ số 326 59 Biểu đồ 3.9 Tương quan tuyến tính kết thử nghiệm với nồng độ mẫu 62 42 Marcel Delire (1997), "Immunoglobulins rationale for clinical use of polyvalent intravenous" Wrightson Biomedical publishing LTP, pp.12 - 17 43 Mary Ann C, Kerry H Cheever (1997), "Tetanus disease" Diseases second edition, Spring house, Pennsylvania, pp.109 - 111 44 Rey M., Guillaumont P And Majnonni D’intignano (1979), "Benefits of immunization versus risk factors in tetanus" Develop Biol Stand., 43, pp.15 - 23 45 Teeranart Jivapaisarnpong (2006), "Validation of bioassay" Training course on quality control of vaccines used in EPI, Ha Noi 46 Veronesi R (1981), "Tetanus important new concepts" Excerpta Medica Amsterdam - Oxford - Princeton 47 WHO (1973), "Geneva requirements for the sterility of biological substances", Technical Report Series No.530 48 WHO (1992), "Good manufacturing practices for biological products WHO expert committee on biological standardization" Technical Report Series No.822, forty - second Report 49 WHO (2001), "Part 2: Validation", A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 85 50 WHO (2004), "Part 2: Validation", A WHO guide to good manufacturing practice (GMP) requirements, pp.63 - 87 PHỤ LỤC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH THỂ TÍCH DUNG DỊCH ĐỘC TỐ UỐN VÁN CHỨA L +/10 CHUẨN BỊ Số lượng động vật thí nghiệm, độc tố uốn ván, mẫu chuẩn, theo phụ lục 1.1 Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng (Swiss) - Trọng lượng 16 - 18 gram - 3,5- tuần tuổi - Khỏe mạnh 1.2 Độc tố uốn ván Độc tố uốn ván tinh chế đặc hiệu Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) sản xuất: mã số: 0610; nồng độ 35 - 40 Lf/mL 1.3 Mẫu chuẩn Dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 14 IU/mL pha từ huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế đông khô: nồng độ 1400 IU/ống, nguồn gốc từ ngựa, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cung cấp 1.4 Dung dịch pha - Pha độc tố uốn ván: Jensen pepton (loạt số: J/02/11, NICVB pha, sử dụng hóa chất hãng: Labosi, Merck, Sigma) - Pha huyết kháng độc tố uốn ván mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm: Nước muối sinh lý 0,85% (loạt số: NM/05/11, hạn dùng: 15/10/2011, NICVB pha; NaCl (Merck), nước cất (NICVB) 1.5 Dụng cụ - Pipet aid kênh loại 20 - 200 µL: + 01 cái: mã code: 3454786, hãng Eppendorf + 01 cái: mã code: 3454806, hãng Eppendorf - Pipet aid kênh loại 50 - 100 µL: + 01 cái: mã code: 3454786, hãng Eppendorf + 01 cái: mã code: 3454806, hãng Eppendorf - Đầu loại 200 µL: Mã code: 4844; hãng sản xuất: Corning - Đầu loại 1000 µL: Mã code: 4846; hãng sản xuất: Corning - Tuýp nhựa vô trùng vô trùng loại 15 mL: Mã code: 430791; hãng sản xuất: Corning - Tuýp nhựa vô trùng vô trùng loại 50 mL: Mã code: 430829; hãng sản xuất: Corning - Bơm kim tiêm loại 1mL: VINAHANKOOK; hãng sản xuất: Công ty liên doanh Việt - Hàn sản xuất 1.6 Thiết bị - Hốt vô trùng NUAI - Class II, Model: No, Nu 440 - 400E; hãng sản xuất: Nhật Bản - Máy lắc tuýp: Voltex Mixer - SA3; hãng sản xuất: Mỹ - Tủ ấm 37 oC: SANYO Model: MIR - 162; hãng sản xuất: Nhật Bản - Găng tay Lưu ý: Các dung dịch pha chất chuẩn trước sử dụng cần đưa nhiệt độ phòng TIẾN HÀNH 2.1 Thủ tục bảo hộ lao động - Mặc áo bảo hộ - Đeo trang - Sử dụng găng tay vô trùng 2.2 Các bƣớc tiến hành thử nghiệm 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch tiêm Lần lƣợt cho vào ống nghiệm: - Dung dịch kháng độc tố nồng độ 0,5 IU/mL: 1mL/ống - Dung dịch độc tố uốn ván: ống thứ 0,602 mL; ống thứ hai 0,604 mL; ống thứ ba 0,606 mL; ống thứ tư 0,608 mL; ống thứ năm 0,610 mL - Nước muối sinh lý cho vừa đủ 2,5 mL/ống - Lắc ống, ủ 37 oC 45 phút, tránh ánh sáng 2.2.2 Tiêm chuột - Tiêm 0,5 mL dung dịch sau trung hòa da lưng cho chuột nhắt - Sử dụng 04 chuột cho độ pha Ống số Huyết kháng độc tố chuẩn (mL) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Dung dịch độc tố uốn ván sau pha loãng 1/30 (mL) 0,602 0,604 0,606 0,608 0,610 Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 (mL) 0,898 0,896 0,894 0.892 0,890 2.2.3 Theo dõi đánh giá kết - Theo dõi ghi số chuột chết vòng 96 độ pha thời điểm 24 giờ; 48 giờ; 72 96 - Thử nghiệm khơng có giá trị có độ pha tồn chuột sống chuột chết - Nhận định kết quả: Độ pha chứa L+/10 độ pha có nồng độ độc tố thấp mà gây chết chuột, thể tích dung dịch độc tố uốn ván sử dụng để pha độ pha thể tích cần tìm 2.2.4 Ghi chép - Biểu mẫu tiến hành xác định thể tích dung dịch độc tố uốn ván có chứa L+/10 (phụ lục 2) PHỤ LỤC BIỂU MẪU TIẾN HÀNH XÁC ĐỊNH THỂ TÍCH DUNG DỊCH ĐỘC TỐ UỐN VÁN CHỨA L+/10 THỦ TỤC HÀNH CHÍNH - Tên sinh phẩm: Loạt số: Cơ sở sản xuất: Lần thử nghiệm: Ngày thực hiện: Ngày kết thúc: Giờ thực hiện: Giờ kết thúc: Người chuẩn bị: Ký tên: Người thực hiện: Ký tên: Người giám sát: Ký tên: CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ Tên Số lượng Kiểm tra Chuột nhắt trắng Swiss 16 - 18 g (3,5 - tuần tuổi) Dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế Dung dịch độc tố uốn ván tinh chế 20 01 tuýp 01 tuýp Dung dịch Jensen pepton Nước muối sinh lý 0,85% Pipet thuỷ tinh 10 mL 20 mL 30 mL 05 Pipet thuỷ tinh mL Pipet thuỷ tinh mL, mL Tube thuỷ tinh loại 10 mL Giá đỡ tuýp 05 05 10 01 Bơm tiêm vô trùng mL Pipet - man (200 - 1000 µL) Pipet - man (50 - 200 µL) Hot laminair 20 02 02 01 Máy lắc Tủ ấm 37 oC 01 01 TIẾN HÀNH 3.1 Pha dung dịch độc uốn ván - Dung dịch độc tố uốn ván: Mã số: 0610, nồng độ 35- 40 Lf/mL Nguồn gốc: từ ngựa, IVAC cung cấp Nguyên liệu Thể tích cho lần thử nghiệm Dung dịch độ tố uốn ván chuẩn 0,2 mL Dung dịch Jensen pepton 5,8 mL 3.2 Pha huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế Dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế Loạt: Nồng độ: Nguồn gốc: từ ngựa, WHO cung cấp Nguyên liệu Thể tích cho lần thử nghiệm Dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế 0,2 mL Nước muối sinh lý 0,85% 5,4 mL 3.3 Trung hoà độc tố uốn ván với huyết chuẩn quốc tế Ống số Huyết kháng độc tố chuẩn (mL) 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 Dung dịch độc tố uốn ván sau pha loãng 1/30 (mL) 0,602 0,604 0,606 0,608 0,610 Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 (mL) 0,898 0,896 0,894 0,892 0,890 - Lắc ống máy lắc - Ủ ống nghiệm 37 oC 45 phút, tránh ánh sáng 3.4 Tiêm chuột - Tiêm 0,5 mL dung dịch tiêm da lưng cho chuột nhắt - Sử dụng 04 chuột cho độ pha 3.5 Theo dõi đánh giá kết - Theo dõi ghi số chuột chết vòng 96 độ pha thời điểm 24 giờ; 48 giờ; 72 96 Độ pha 24 Sống Chết - Nhận xét thử nghiệm: 48 Sống Chết Có giá trị  72 Sống 96 Chết Sống Chết Khơng có giá trị  3.6 Kết Thể tích dung dịch độc tố uốn ván chứa L+/10: mL PHỤ LỤC QUI TRÌNH XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG ĐỘC TỐ UỐN VÁN TINH CHẾ BẰNG KỸ THUẬT TRUNG HÒA 1.CHUẨN BỊ Số lượng động vật thí nghiệm, độc tố uốn ván, mẫu chuẩn, theo phụ lục 1.1 Động vật thí nghiệm - Chuột nhắt trắng (Swiss) - Trọng lượng 16 - 18 gram - 3,5 - tuần tuổi - Khỏe mạnh 1.2 Độc tố uốn ván Độc tố uốn ván tinh chế đặc hiệu Viện Vắc xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang (IVAC) sản xuất: mã số: 0610; nồng độ 35 - 40 Lf/mL 1.3 Mẫu chuẩn Dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 1400 IU/mL pha từ huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế đông khô: nồng độ 1400 IU/ống, nguồn gốc từ ngựa, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) cung cấp 1.4 Mẫu thử nghiệm - Huyết kháng độc tố uốn ván mẫu thử nghiệm Loạt số: 324/325/326 1.5 Dung dịch pha mẫu - Pha độc tố uốn ván: Jensen pepton (loạt số: J/02/11, NICVB pha, sử dụng hóa chất hãng: Labosi, Merck, Sigma) - Pha huyết kháng độc tố uốn ván mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm: Nước muối sinh lý 0,85% (loạt số: NM/05/11, hạn dùng: 15/10/2011, NICVB pha; NaCl (Merck), nước cất (NICVB) 1.6 Dụng cụ - Pipet aid kênh loại 20 - 200 µL: + 01 cái: mã code: 3454786, hãng Eppendorf + 01 cái: mã code: 3454806, hãng Eppendorf - Pipet aid kênh loại 50 - 100 µL: + 01 cái: mã code: 3454786, hãng Eppendorf + 01 cái: mã code: 3454806, hãng Eppendorf - Đầu loại 200 µL: Mã code: 4844; hãng sản xuất: Corning - Đầu loại 1000 µL: Mã code: 4846; hãng sản xuất: Corning - Tuýp nhựa vô trùng vô trùng loại 15 mL: Mã code: 430791; hãng sản xuất: Corning - Tuýp nhựa vô trùng vô trùng loại 50 mL: Mã code: 430829; hãng sản xuất: Corning - Bơm kim tiêm loại mL: VINAHANKOOK; hãng sản xuất: Công ty liên doanh Việt - Hàn sản xuất - Bông cồn sát trùng - Quần áo bảo hộ - Khẩu trang - Găng tay 1.7 Thiết bị - Hốt vô trùng NUAIR - Class II, Model: No, Nu 440 - 400E; hãng sản xuất: Nhật - Máy lắc tuýp: Voltex Mixer - SA3; hãng sản xuất: Mỹ - Tủ ấm 37 oC: SANYO Model: MIR - 162; hãng sản xuất: Nhật - Găng tay Lưu ý: Các dung dịch pha chất chuẩn trước sử dụng cần đưa nhiệt độ phòng TIẾN HÀNH 2.1 Thủ tục bảo hộ lao động - Mặc áo bảo hộ - Đeo trang - Sử dụng găng tay vô trùng 2.2 Các bƣớc tiến hành thử nghiệm Chuẩn bị dung dịch tiêm mẫu chứng Lần lƣợt cho vào ống nghiệm: - Dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 0,5 IU/mL: ống thứ 0,9 mL; ống thứ hai 1,0 mL; ống thứ ba 1,1 mL - Một thể tích dung dịch độc tố có chứa L+/10 - Nước muối sinh lý cho vừa đủ 2,5 mL/ống - Lắc ống, ủ 37 oC 45 phút, tránh ánh sáng Chuẩn bị dung dịch tiêm mẫu thử nghiệm Lần lượt cho vào 11 ống nghiệm tương ứng với độ pha (mỗi độ pha ống): - mL dung dịch kháng độc tố uốn ván mẫu thử - Một thể tích dung dịch độc tố có chứa L+/10 - Nước muối sinh lý cho vừa đủ 2,5 mL/ống - Lắc ống, ủ 37 oC 45 phút, tránh ánh sáng Trung hòa độc tố uốn ván với huyết kháng độc tố uốn ván Mẫu chứng Ống số C1 C2 C3 Huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn (mL) 0,9 1,0 1,1 Dung dịch độc tố có chứa L+/10 (mL) Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 mL Mẫu thử nghiệm Ống số Độ pha loãng huyết thử nghiệm T1 T2 T3 T4 T5 Dung dịch KĐTUV thử nghiệm (mL) 1 1 Dung dịch độc tố uốn ván chứa L+/10 (mL) Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 mL Tiêm chuột: - Tiêm 0,5 mL dung dịch tiêm (mẫu chứng/mẫu thử nghiệm) da lưng cho chuột nhắt - Sử dụng 04 chuột cho độ pha Theo dõi đánh giá kết quả: - Theo dõi ghi số chuột chết vòng 96 độ pha thời điểm 24 giờ; 48 giờ; 72 96 - Mẫu chứng sử dụng 0,9 mL 1,0 mL dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 0,5 IU/mL gây chết tồn chuột vịng 96 Số chuột mẫu chứng sử dụng 1,1 mL dung dịch kháng độc tố uốn ván chuẩn nồng độ 0,5 IU/mL sống tồn vịng 96 - Thử nghiệm khơng có giá trị có độ pha tồn chuột sống chuột chết - Nhận định kết quả: Dung dịch tiêm chứa lượng kháng độc tố uốn ván thử nghiệm lớn mà không bảo vệ chuột thời gian tương đương với mẫu chứng có chứa 1,0 mL kháng độc tố uốn ván có nồng độ 0,5 IU/mL - Hiệu giá kháng độc tố uốn ván thử nghiệm tính sau : Hiệu giá (IU/mL) = 0,5 x N Trong đó: N : Độ pha loãng huyết kháng độc tố uốn ván thử nghiệm 0,5: Số IU có mL dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn 2.3 Ghi chép - Biểu mẫu tiến hành xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván tinh chế (phụ lục 4) PHỤ LỤC BIỂU MẪU TIẾN HÀNH XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG ĐỘC TỐ UỐN VÁN TINH CHẾ BẰNG KỸ THUẬT TRUNG HÒA I THỦ TỤC HÀNH CHÍNH - Tên sinh phẩm: Loạt số: Cơ sở sản xuất: Lần thử nghiệm: Ngày thực hiện: Ngày kết thúc: Giờ thực hiện: Giờ kết thúc: Người thực hiện: Ký tên: Người giám sát: Ký tên: II CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ Tên Chuột nhắt trắng Swiss 16 - 18 gram Dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn quốc tế Dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván thử nghiệm Số lƣợng 32 01 tuýp 03 ống Dung dịch độc tố uốn ván chứa L+/10 01 tuýp Dung dịch Jensen pepton Nước muối sinh lý 0,85% Pipet thuỷ tinh 10 mL Pipet thuỷ tinh mL Pipet thuỷ tinh mL, mL Tube thuỷ tinh loại 10 mL Giá đỡ tuýp Bơm tiêm vô trùng mL Pipet - man (200 - 1000 µL) Pipet - man (50 - 200 µL) Hot laminair Máy lắc Tủ ấm 37 oC 20 mL 30 mL 05 05 05 13 01 20 02 02 01 01 01 Kiểm tra III TIẾN HÀNH 3.1 Pha huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn Lấy 0,1 mL mẫu chuẩn nồng độ 1400 IU/mL + 9,9 mL nước muối sinh lý để dung dịch huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn chứa 14 IU/mL Lấy 0,2 mL mẫu chuẩn 14 IU/mL (WHO) + 5,4 mL nước muối sinh lý để dung dịch chứa 0,5 IU/mL 3.2 Pha huyết kháng độc tố uốn ván thử nghiệm Loạt số: Hạn dùng: Số đơn vị quốc tế ghi nhãn: Hộn ống mẫu ta dung dịch (A), lấy 0,5 mL dùng pha loãng bậc 10 theo bước sau: 1/ 10-1: 0,5 mL (A) + 4,5 mL NMSL 2/ 10-2: 0,5 mL (10-1) + 4,5 mL NMSL -3 3/ 10 : -2 1,0 mL (10 ) + 9,0 mL NMSL HTKĐTUV 10-3 (mL) NMSL (mL) Độ pha loãng 3.3 Trung hoà độc tố uốn ván với huyết kháng độc tố uốn ván Mẫu chứng Ống số C1 C2 C3 Huyết kháng độc tố uốn ván chuẩn (mL) 0,9 1,0 1,1 Dung dịch độc tố có chứa L+/10 (mL) Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 mL Mẫu thử nghiệm Ống số T1 T2 T3 T4 T5 1 1 Độ pha loãng huyết thử nghiệm Dung dịch KĐTUV thử nghiệm (mL) Dung dịch độc tố uốn ván chứa L+/10 (mL) Nước muối sinh lý vừa đủ 2,5 mL 2.4 Tiêm chuột - Tiêm 0,5 mL dung dịch tiêm da lưng cho chuột nhắt - Sử dụng 04 chuột cho độ pha - Theo dõi chuột 96 2.5 Kết theo dõi số chuột sống chết thời điểm Độ pha loãng 24 Sống 48 Chết Sống Chết 72 Sống Chết 96 Sống Các lô chuột chứng C1 C2 C3 Các lô chuột thử nghiệm T1 T2 T3 T4 T5 Kết Nhận xét thử nghiệm: Có giá trị Khơng có giá trị Hiệu giá đạt: đơn vị quốc tế mL Chết ván tinh chế kỹ thuật trung hòa ... hạn chế tiến hành nghiên cứu đề tài: 13 "Thẩm định qui trình xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván tinh chế kỹ thuật trung hòa" với mục tiêu sau: 1- Xác định độ qui trình 2- Xác định độ xác. .. đạt chất lượng 1.3.3 Xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván kỹ thuật trung hòa 1.3.3.1 Nguyên lý kỹ thuật Là phản ứng xẩy kháng độc tố uốn ván huyết với độc tố uốn ván Huyết thử pha loãng... kháng độc tố uốn ván tinh chế cần có qui trình đánh giá có độ tin cậy cao Hiện nay, khu vực giới sử dụng phổ biến qui trình xác định hiệu giá huyết kháng độc tố uốn ván kỹ thuật trung hịa Qui trình