Khi thực hiện thử nghiệm ở cả mẫu chuẩn quốc tế và mẫu của IVAC Nha Trang, ở tất cả cỏc nồng độ, chỳng tụi đều gặp những lần thử nghiệm khụng cú giỏ trị (thử nghiệm vừa cú chuột sống vừa cú chuột chết ở cựng 1 độ pha).
Đối với mẫu chuẩn quốc tế ở nồng độ 1300 IU/mL trong 7 lần thử nghiệm cú 1 lần thử nghiệm khụng cú giỏ trị, bốn nồng độ cũn lại (1000 UI/mL, 1100 UI/mL, 1200 UI/mL và 1400 IU/mL) đều cú 2 lần thử nghiệm khụng cú giỏ trị trong tổng số 8 lần thực hiện thử nghiệm.
Ở mẫu của IVAC Nha Trang cả 3 mẫu (2 mẫu nồng độ 1500 IU/mL, 1 mẫu nồng độ 1600 IU/mL) đều cú 2 lần thử nghiệm khụng cú giỏ trị trong tổng số 8 lần thực hiện thử nghiệm cho mỗi nhúm.
Tất cả cỏc lần thử nghiệm khụng cú giỏ trị này đều cú độ pha loóng cao nhất gõy chết chuột trựng với nồng độ đó biết trước của mẫu. Cỏc lần thử nghiệm khụng cú giỏ trị đều khụng liờn tiếp nhau.
Đõy là một thử nghiệm tiến hành trờn động vật (chuột nhắt trắng giống Swiss) nờn dự đó khống chế trọng lượng và độ tuổi của chuột tham gia thử nghiệm nhưng kết quả thử nghiệm vẫn phụ thuộc nhiều vào sự đỏp ứng của từng cỏ thể động vật. Với cựng liều độc tố uốn vỏn và liều huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn nhưng mỗi cỏ thể cú thể cú đỏp ứng khỏc nhau. Việc xỏc định hiệu giỏ của khỏng huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn theo qui trỡnh này cũng chớnh là xỏc định độ pha lớn nhất vẫn cũn gõy chết toàn bộ số chuột thử nghiệm. Như vậy độ pha lớn hơn liền kề sẽ cú chuột sống toàn bộ, nghĩa là độ pha được xỏc định sẽ là ranh giới giữa chuột sống toàn bộ và chuột chết toàn bộ. Vỡ vậy, hoàn toàn cú khả năng xuất hiện tỡnh huống cạnh độ pha cú chuột
64
sống toàn bộ là độ pha cú chuột chết khụng toàn bộ bởi sự đỏp ứng giữa cỏc cỏ thể chuột trong độ pha cú thể khỏc nhau dự đó khống chế. Cỏc thử nghiệm "khụng cú giỏ trị" được loại bỏ, khụng được thống kờ trong nghiờn cứu.
4.2 Độ đỳng
4.2.1 Trọng lƣợng chuột tham gia thử nghiệm
Tất cả chuột sử dụng để đỏnh giỏ độ đỳng đều từ 3,5 đến 4 tuần tuổi và cú trọng lượng 16 - 18 gram. Để khống chế ảnh hưởng của trọng lượng chuột đến kết quả thử nghiệm, chuột tham gia thử nghiệm được phõn ngẫu nhiờn thành từng nhúm 4 con. Kết quả bảng 3.1 cho thấy trọng lượng trung bỡnh của chuột trong cựng độ pha, giữa cỏc độ pha trong 1 lần thử nghiệm và giữa cỏc lần thử nghiệm sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa thống kờ.
4.2.2 Độ dao động kết quả thử nghiệm
Thử nghiệm xỏc định độ đỳng được thực hiện trờn 5 nồng độ khỏc nhau (1000 IU/mL, 1100 IU/mL, 1200 IU/mL, 1300 IU/mL và 1400 IU/mL), trong đú mẫu 1400 IU/mL là mẫu chuẩn quốc tế, cỏc mẫu cũn lại là mẫu được pha loóng từ mẫu 1400 IU/mL. Kết quả của cỏc lần thực hiện thử nghiệm xỏc định độ đỳng được thể hiện trong 5 biểu đồ (Biểu đồ 3.1 đến 3.5), mỗi biểu đồ thể hiện kết quả của 6 lần thử nghiệm của cựng 1 mẫu. Theo kết quả thể hiện trờn cỏc biểu đồ này cho thấy hầu hết kết quả giữa cỏc lần thử nghiệm là trựng với giỏ trị của mẫu. Bốn trong 5 mẫu chỉ cú duy nhất 1 lần kết quả thử nghiệm khỏc với giỏ trị của mẫu. Riờng mẫu nồng độ 1100 IU/mL là cú 2 lần thử nghiệm kết quả khỏc với giỏ trị của mẫu, tuy nhiờn, 2 kết quả này khụng ở 2 lần thử nghiệm liờn tiếp (lần 2 và lần 5). Biểu đồ 3.2 cho thấy cỏc kết quả thử nghiệm của mẫu nồng độ 1100 IU/mL đều nằm trong khoảng X 2SD. Cỏc biểu đồ 3.1; 3.3; 3.4; 3.5 đều cho thấy những kết quả thử nghiệm khỏc với giỏ trị của mẫu đều nằm ngoài khoảng X 2SD nhưng vẫn nằm trong khoảng X 3SD, theo chỳng tụi điều này là cú thể chấp nhận được bởi những kết qu ả
65
thử nghiệm khỏc với giỏ trị của mẫu, thực chất là những kết quả của độ pha liền kề (chỉ bị lệch 1 độ pha) và đõy là một thử nghiệm sinh học. Hơn nữa về mặt thống kờ nếu trong 6 lần thử nghiệm cú tới 5 lần cú chung 1 giỏ trị, chỉ duy nhất 1 lần cú giỏ trị khỏc thỡ luụn luụn giỏ trị khỏc này sẽ nằm ngoài khoảng X 2SD, dự cho giỏ trị đú gần với 5 giỏ trị cũn lại tới đõu.
4.2.3 Độ đỳng của qui trỡnh
Độ đỳng của qui trỡnh ở mỗi nồng độ (1000 UI/mL, 1100 UI/mL, 1200 UI/mL, 1300 UI/mL, 1400 UI/mL) và chung cho 5 nồng độ được trỡnh bày trong bảng 3.3.
Kết quả bảng 3.3 cho thấy khoảng tin cậy 95%, CI của độ đỳng đối với cỏc mẫu nồng độ 1000 UI/mL, 1100 UI/mL, 1200 UI/mL, 1300 UI/mL, 1400 UI/mL tương ứng là 97,38% - 105,95%; 98,10% - 101,96%; 97,82% - 104,96%; 97,99% - 104,58% và 95,75% - 101,87%. Khoảng tin cậy 95%, CI của độ đỳng chung cho cả 5 nồng độ là 99,58% - 102,87%.
Về nguyờn tắc qui trỡnh càng cú độ đỳng càng cao thỡ càng tốt, tuy nhiờn, khi nhận định về độ đỳng của qui trỡnh phải căn cứ vào mục đớch, yờu cầu kiểm định, cũng như phụ thuộc vào sự sẵn cú của cỏc qui trỡnh kiểm định cú giỏ trị khỏc chứ khụng cú một tiờu chuẩn chung nào trong đỏnh giỏ tớnh đỳng của qui trỡnh (Qua tỡm hiểu cỏc tài liệu hướng dẫn thẩm định qui trỡnh của WHO [50], chỳng tụi khụng thấy cú qui định cụ thể về yờu cầu đối với độ đỳng của qui trỡnh).
Để cú thể nhận định về giỏ trị của qui trỡnh trong nghiờn cứu này cần so sỏnh với tớnh đỳng của qui trỡnh được thực hiện ở những đơn vị cú uy tớn khỏc và so sỏnh tớnh đỳng của qui trỡnh này với tớnh đỳng cỏc qui trỡnh xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn khỏc.
Tuy nhiờn, qua hồ sơ đăng ký sản phẩm gửi tới Viện, chỳng tụi thấy tất cả cỏc nhà sản xuất huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn đều sử dụng qui trỡnh kỹ thuật trung hũa để xỏc định hiệu giỏ của sản phẩm, một số đơn vị kiểm định ở
66
nước ngoài mà chỳng tụi được biết (Trung Quốc, Thỏi Lan) cũng sử dụng kỹ thuật này do đú chỳng tụi chưa cú điều kiện để so sỏnh tớnh đỳng của qui trỡnh này với qui trỡnh khỏc.
Kết quả nghiờn cứu độ đỳng cho thấy hầu hết cỏc lần thử nghiệm đều cú kết quả trựng với nồng độ biết trước của mẫu. Những trường hợp kết quả thử nghiệm khỏc với nồng độ biết trước của mẫu, thỡ sự khỏc biệt cũng chỉ ở mức 01 độ pha. Điều này cho thấy qui trỡnh xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn tinh chế bằng phương phỏp trung hũa cú độ đỳng cao.
4.3 Độ chớnh xỏc
4.3.1 Trọng lƣợng chuột tham gia thử nghiệm
Cũng giống như đỏnh giỏ xỏc định độ đỳng, trong thử nghiệm xỏc định độ chớnh xỏc tất cả chuột sử dụng để đỏnh giỏ độ đỳng đều từ 3,5 đến 4 tuần tuổi và cú trọng lượng 16 - 18 gram. Để khống chế ảnh hưởng của trọng lượng chuột đến kết quả thử nghiệm, chuột tham gia thử nghiệm được phõn ngẫu nhiờn thành từng nhúm 4 con. Kết quả bảng 3.5 cho thấy trọng lượng trung bỡnh của chuột trong cựng độ pha, giữa cỏc độ pha trong 1 lần thử nghiệm và giữa cỏc lần thử nghiệm sự khỏc biệt khụng cú ý nghĩa thống kờ. Như vậy "nguyờn liệu" trong nghiờn cứu này đạt chất lượng tốt.
4.3.2 Độ dao động kết quả thử nghiệm
Thử nghiệm xỏc định độ chớnh xỏc được thực hiện trờn 3 lụ SAT của IVAC hai lụ nồng độ 1500 IU/mL, một lụ nồng độ 1600 IU/mL.
Kết quả của cỏc lần thực hiện thử nghiệm xỏc định độ lặp lại được thể hiện trong 3 biểu đồ (Biểu đồ 3.6 đến 3.8), mỗi biểu đồ thể hiện kết quả của 12 lần thử nghiệm của cựng 1 mẫu (do 2 nhúm cỏn bộ thực hiện, mỗi nhúm thực hiện 6 lần).
Theo kết quả thể hiện trờn cỏc biểu đồ này cho thấy phần lớn kết quả đều nằm trong khoảng X 2SD. Khụng cú khi nào giỏ trị ở 2 lần thử nghiệm liờn tiếp cựng nằm ngoài khoảng X 2SD.
67
4.3.3 Độ lặp lại và độ chớnh xỏc trung gian
Hệ số biến thiờn khi xỏc định độ lặp lại của qui trỡnh ở mỗi lụ (lụ số 324, 325, 326) và chung cho 3 lụ được trỡnh bày trong bảng 3.7.
Kết quả bảng 3.7 cho thấy hệ số biến thiờn khi xỏc định độ lặp lại với khoảng tin cậy 95%, CI là 2,23% - 3,59%.
Hệ số biến thiờn khi xỏc định độ chớnh xỏc trung gian của qui trỡnh ở mỗi lụ (lụ số 324, 325, 326) và chung cho 3 lụ được trỡnh bày trong bảng 3.8.
Kết quả bảng 3.8 cho thấy hệ số biến thiờn khi xỏc định độ chớnh xỏc trung gian với khoảng tin cậy 95%, CI là 2,41% - 2,87%.
Theo cỏc tài liệu hướng dẫn về thẩm định qui trỡnh, hệ số biến thiờn đối với thử nghiệm trờn động vật cho phộp ở mức 20 - 50% [41] [45]. Đối chiếu với tiờu chuẩn này cỏc kết quả thử nghiệm cho thấy qui trỡnh xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn tinh chế bằng phương phỏp trung hũa cú độ lặp lại và độ chớnh xỏc trung gian cao.
4.4 Độ tuyến tớnh
Kết quả trong thử nghiệm xỏc định độ đỳng trờn 5 mẫu thử nghiệm cú nồng độ: 1000 IU/mL, 1100 IU/mL, 1200 IU/mL, 1300 IU/mL, 1400 IU/mL được sử dụng để xỏc định tớnh tuyến tớnh.
Biểu đồ 3.9 thể hiện mối tương quan tuyến tớnh nồng độ mẫu đó biết trước và kết quả thử nghiệm ở 5 nồng độ núi trờn, mỗi nồng độ được thực hiện 6 lần. Hệ số tương quan ở mức 0,8 - 1,0 được xem là cú tương quan chặt chẽ, với hệ số tương quan r = 0,9534 cho thấy giữa kết quả thử nghiệm và nồng độ của mẫu cú một mối tương quan tuyến tớnh chặt chẽ.
4.5 Độ mạnh và độ đặc hiệu
Cú nhiều yếu tố tham gia vào thử nghiệm và đều cú thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm. Khi đỏnh giỏ tớnh chớnh xỏc trung gian chỳng tụi đó phõn tớch kết quả của 2 nhúm kỹ thuật viờn khỏc nhau, kết quả cho thấy tuy cú sự khỏc
68
biệt giữa 2 nhúm nhưng sự khỏc biệt này khụng cú ý nghĩa thống kờ. Kỹ thuật xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn tinh chế bằng kỹ thuật trung hũa là thử nghiệm invivo, do đú, độ mạnh của thử nghiệm sẽ bị ảnh hưởng bởi trọng lượng của chuột sử dụng làm thử nghiệm. Để hạn chế ảnh hưởng của trọng lượng chuột lờn kết quả thử nghiệm, trong nghiờn cứu này chỳng tụi chỉ chọn chuột cú trọng lượng từ 16,0 - 18,0 gram và phõn phối đồng đều theo trọng lượng chuột vào cỏc nhúm (Kết quả phõn tớch thống kờ cho thấy khụng cú sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ về trọng lượng trung bỡnh của cỏc nhúm chuột giữa cỏc cỏc độ pha trong cựng lần thử nghiệm và giữa cỏc lần thử nghiệm với nhau).
Tuy nhiờn, để đỏnh giỏ mức độ ảnh hưởng của trọng lượng của chuột tham gia thử nghiệm này cần so sỏnh kết quả khi thực hiện thử nghiệm ở nhúm chuột 16,0 - 16,5 gram so với kết quả khi thực hiện ở nhúm chuột 17,5 - 18,0 gram. Mỗi lần thử nghiệm cần 32 con chuột, để cú đủ 32 con chuột cựng trọng lượng trong một lần thử nghiệm phải tuyển chọn từ hàng trăm con chuột. Vỡ thời gian nghiờn cứu ngắn nờn trong nghiờn cứu này chỳng tụi chưa cú đủ điều kiện để đỏnh giỏ mức độ ảnh hưởng của trọng lượng chuột tới kết quả thử nghiệm (Theo kế hoạch chỳng tụi dự kiến sẽ tiến hành đỏnh giỏ ảnh hưởng của trọng lượng chuột đến kết quả thử nghiệm vào thỏng 3/2012).
Để đỏnh giỏ độ đặc hiệu (khả năng xỏc định được chất cần tỡm cú trong mẫu thử khi cú mặt cỏc thành phần khỏc: tỏ dược, tạp chất...) cần sử dụng mẫu trắng (mẫu blank: mẫu cú đầy đủ cỏc thành phần như mẫu thử ngoại trừ khỏng độc tố uốn vỏn) và mẫu thờm (mẫu spike: mẫu cú thờm một lượng nhất định và biết trước khỏng độc tố uốn vỏn so với mẫu thử thụng thường) trong nghiờn cứu này chỳng tụi chưa cú điều kiện để cú được 2 loại mẫu này, vỡ vậy nghiờn cứu này chưa đỏnh giỏ được độ đặc hiệu của qui trỡnh.
69
Theo khuyến cỏo của WHO trước khi ỏp dụng một phương phỏp mới (phương phỏp mới được xõy dựng hoặc phương phỏp chưa được tiờu chuẩn húa) thỡ cần thẩm định toàn phần, nhưng đối với phương phỏp đó tiờu chuẩn húa (đó cú trong Dược điển hoặc được chuyển giao kỹ thuật từ cỏc đơn vị cú uy tớn) thỡ chỉ cần thẩm định một phần, nếu cú thay đổi lớn về phương phỏp thử nghiệm (thay đổi dụng cụ, trang thiết bị, thay đổi cụng thức hoặc qui trỡnh thực hiện) thỡ cần tỏi thẩm định một phần.
Qui trỡnh xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độ tố uốn vỏn bằng kỹ thuật trung hũa đang sử dụng ở Viện Kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế (NICVB) là phương phỏp được ghi trong dược điển Việt Nam 4 (2009) và là qui trỡnh đang được sử dụng phổ biến ở trong khu vực và trờn thế giới. Do đú, việc chưa đỏnh giỏ được độ mạnh và độ đặc hiệu của qui trỡnh là một hạn chế của nghiờn cứu, nhưng là hạn chế cú thể chấp nhận được.
70
KẾT LUẬN
Qui trỡnh "Xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn tinh chế bằng kỹ thuật trung hũa" cú độ tin cậy cao với:
1. Độ đỳng của qui trỡnh
Độ đỳng của qui trỡnh (khi thực hiện trờn 5 mẫu thử: 1000 IU/mL, 1100 IU/mL, 1200 IU/mL, 1300 IU/mL, 1400 IU/mL) với khoảng tin cậy 95%, CI là 99,58% - 102,87%.
2. Độ chớnh xỏc của qui trỡnh
Độ lặp lại và độ chớnh xỏc trung gian của qui trỡnh khi thực hiện trờn 3 lụ mẫu thử khỏc nhau đều đạt ở mức cao.
Hệ số biến thiờn khi xỏc định độ lặp lại của qui trỡnh với khoảng tin cậy 95%, CI là 2,23% - 3,59%.
Hệ số biến thiờn khi xỏc định độ chớnh xỏc trung gian của qui trỡnh với khoảng tin cậy 95%, CI là 2,41% - 2,87.
3. Độ tuyến tớnh của qui trỡnh
Giữa kết quả thử nghiệm và nồng độ của mẫu thử nghiệm cú mối tương quan tuyến tớnh chặt chẽ với hệ số tương quan r = 0,9534.
71
KIẾN NGHỊ
Kết quả nghiờn cứu cho thấy qui trỡnh xỏc định hiệu giỏ huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn tinh chế bằng kỹ thuật trung hũa cú độ đỳng, độ chớnh xỏc cao và cú sự tương quan tuyến tớnh chặt chẽ giữa kết quả thử nghiệm và cỏc nồng độ của mẫu. Vỡ vậy, đề nghị Ban lónh đạo Viện Kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế tiếp tục sử dụng qui trỡnh đỏnh giỏ chất lượng huyết thanh khỏng độc tố uốn vỏn theo qui định trong dược điển Việt Nam IV (năm 2009, phụ lục 15.16, PL 328 - 329).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Artur M. GaLazka (1993), "Miễn dịch học của tiờm chủng" . Miễn dịch đại cương, WHO/EPI/93.11, tr.2 - 9.
2. Nguyễn Quế Anh (2000), "Theo dừi khỏng thể khỏng uốn vỏn ở phụ nữ cú thai sau khi tiờm phũng vắc xin uốn vỏn ở Việt Nam". Luận ỏn tiến sỹ Y học dự phũng Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội.
3. Nguyễn Đỡnh Bảng và cộng sự (2003), "Vắc xin và chế phẩm miễn dịch trong phũng và điều trị". Nhà xuất bản Y học, tr.302 - 310.
4. Lờ Huy Chớnh, chủ biờn (2001), Vi sinh Y học,"Trực khuẩn uốn vỏn",
Bựi Khắc Hậu, Nhà xuất bản Y học, Đại học Y Hà Nội, tr.264 - 269. 5. Nguyễn Quang Chung (2010), "Qui trỡnh xỏc định hàm lượng phenol
trong vắc xin và sinh phẩm". Tài liệu lưu hành nội bộ Viện Kiểm định quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế.
6. Đỗ Duy Cƣờng (1997), "Đỏnh giỏ tiờn lượng và gúp phần nghiờn cứu