51 Tài liệu trên mạng internet 26. (http://www.baocantho.com.vn/vietnam/suckhoe/5345/ ><HTML>) 27. http://www.hanoimoi.com.vn 28. VACS Tạp chí Thế giới Phụ nữ. http://www.vnn.vn/chuyenmuc/camnang/mypham/lamdepvoisua.htm 29. http://www.nld.com.vn/tintuc/kinh-te/tin-the-gioi/97615.asp > <HTML><HEAD><TITLE>Báo Ngƣời Lao Động - Tin thế giới</TITLE> <META content="text/html; 30. Sippy Kaur. Lactic acid fermentation http://honeybee.helsinki.fi/users/lindstro/Opetus/Opetus - 2003/Seminaarityot - 2001/Sippy/mikro400/sippy.htm 31. http://www.lactospore.com/intro.htm 32. Niju Narayanan, Pradip K. Roychoudhury, Aradhana Srivastava * , 2004. L(+) lactic acid fermentation and its product polymerization. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, 2004, vol. 17. http://www.ejbiotechnology.info/content/vol17/issue2/full/7/bip/. 33. Niju Narayanan, Pradip K. Roychoudhury, Aradhana Srivastava * . Isolation of adh mutant of Lactobacillus rhamnosus for production of L(+) lactic acid. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, 2004, vol. 7. http://www.ejbiotechnology.info/content/vol7/issue1/full/7/index.html > <HTML><HEAD><TITLE>Full Text - Isolation of adh mutant of Lactobacillus rhamnosus for production of L(+) Lactic acid</TITLE> 34. Ralph P. Tittsler, Carl S. Pederson, Esmond E. Snell, David Hendlin, and Charles F. Niven, Jr. Symposium on the Lactic acid Bacteria 1 . Bublished by the American Society for Microbiology.1952 December, v 16(4): 227-260. http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?tool=pmcentrez&pageindex=1&artid= 180749 > <Html><head><title>symposium on the lactic acid bacteria bacteria1</title> <META http-equiv=Content-Type content="text/html 35. http://www.pubmedcentral.gov/pagerender.fcgi?artid=180749&pageindex=30 > <HTML> Ralph P. Tittsler, Carl S. Pederson, Esmond E. Snell, David Hendlin, and Charles F. Niven, Jr, 1952. symposium on the lactic acid bacteria 1 36. http://www.dsmz.de/media/med011.htm 52 37. http://141.150.157.117:8080/prokPUB/chaphtm/256/COMPLETE.htm 38. http://www.nld.com.vn/tintuc/kinh-te/tin-the-gioi/97615.asp ><HTML> 39. http://www.chemsystems.com/newsletters/perp/jun02_01-s3abs.cfm > <HTML><HEAD><TITLE> 40. http://www.the-infoshop.com/study/bc27352_fermentation_ingredients.html > <HTML><HEAD><TITLE>[Report] Global Fermentation Ingredients Market Research, Trends, Analysis</TITLE> <META content=text/html. 53 PHỤ LỤC 1. Thành phần một số loại môi trường 1.1. Môi trường MRS Broth (de Man, Rogosa and Sharpe Broth) [36] Pepton 10 g Cao thịt 10 g Cao nấm men 5 g Glucose 20 g Tween 80 1 g K 2 HPO 4 2 g Sodium acetate 5 g Amonium citrate 2 g MgSO 4 .7H 2 O 0,2 g MnSO 4 .H 2 O 0,05 g Nƣớc cất 1000 ml Khử trùng ở 121 o C trong 15 phút. Điều chỉnh pH = 6,2 - 6,5 1.2. Môi trường MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar) Từ môi trƣờng MRS Broth có bổ sung 2 % agar. Khử trùng ở 121 o C trong 15 phút. 1.3. Môi trường YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] Cao nấm men 10 g Glucose 20 g CaCO 3 20 g Agar 15 g Nƣớc cất 1000 ml 1.4. Môi trường thử khả năng lên men đường [11] Pepton 10 g NaCl 5 g Cao thịt 1 g Phenol red (7,2 ml dung dịch phenol red 0,25 %): 0,018 g Nƣớc cất 1000 ml 54 Hòa tan 10g carbohydrate cho vào môi trƣờng dịch thể cơ bản này. Lấy từng thể tích 2,5 ml cho vào các ống nghiệm có chứa ống durham lật ngƣợc với ống nghiệm. Hấp tiệt trùng trong 10 phút ở 118 o C. pH cuối = 7,4 ± 2 1.5. Môi trường thạch nitrate bán lỏng Cao thịt 3 g Pepton bột 5 g KNO 3 1 g Nƣớc cất 1000 ml Điều chỉnh pH sau khi hấp: 6,8 - 7,2 1.6. Môi trường thử khả năng phân giải gelatin Môi trƣờng NB tổng hợp 10 g 10 % gelatin Nƣớc cất 1000 ml Điều chỉnh pH sau khi hấp: 6,8 - 7,2 1.7. Môi trường thạch bán lỏng di động Môi trƣờng NB tổng hợp 13 g Agar 5 g Nƣớc cất 1000 ml pH = 7,2 1.8. Môi trường thử khả năng sinh indol Môi trƣờng Nutrient Broth (NB) Cao thịt 5 g Pepton 10 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml pH = 7,0 ± 0,2 2. Thuốc nhuộm và thuốc thử 2.1. Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] Thuốc nhuộm tím bromocresol Purple 0,2 g Nƣớc cất (vô khuẩn) 100 ml Hòa tan 0,2 g thuốc nhuộm trong nƣớc cất và pha loãng đến 100 ml. 55 2.2. Thuốc nhuộm Gram [11] - Tím kết tinh Hucker + Dung dịch A Crystal violet (chất nhuộm chiếm 90 %) 2 g Ethanol 95 % 20 ml + Dung dịch B Ammonium oxalate 0,8 g Nƣớc cất 80 ml Trộn các dung dịch A và B lại với nhau. Bảo quản 24 giờ rồi lọc qua giấy lọc thô. Gram’s iodine: Iodine 1 g KI 2 g Nƣớc cất 300 ml Cho KI vào cối, thêm iodine và nghiền bằng chày trong 5 - 10 giây. Thêm 1 ml nƣớc rồi nghiền. Cho dung dịch này vào lọ, rửa cối và chày với lƣợng nƣớc đủ để đạt thể tích 300 ml. - Hucker’s counterstain (dung dịch sẵn) Safranin O 2,5 g Ethanol 95% 100 ml Thêm 10 ml dung dịch sẵn vào 90 ml nƣớc cất. 2.3. Thuốc thử Griess [5] Griess A Acid sulfanilic: Hòa tan 0,5 g acid sulfanilic vào 30 ml acid acetic bổ sung thêm 100 ml nƣớc cất, đem lọc. Dung dịch đƣợc bảo quản trong 1 tháng. Griess B α-naphtylamin: Hòa tan 0,1 g α-naphtylamin trong 100 ml nƣớc cất đun sôi. Để nguội rồi bổ sung thêm 30 ml acid acetic, đem lọc. Bảo quản trong 1 tuần 2.4. Thuốc thử uphenmen [11] Phenol 5 % 10 ml FeCl 3 5 % 2 ml Nƣớc cất 25 ml 2.5. Thuốc thử DNS [10] 56 - Sodium potassium tartrate (hòa tan 300 g muối này vào 500 ml nƣớc). - 3,5-dinitrosalicylic acid: Hòa tan 10 g DNS vào 200 ml dung dịch NaOH 2 M. - Dinitrosalicylic dùng cho phản ứng:Trộn (1) và (2), thêm nƣớc cất cho đủ 1 lít. 2.6. Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ NaOH 0,1 N, phenolphtalein 1 % 3. Các phương pháp thực hiện 3.1. Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng Thực hiện: Định lƣợng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1 N với chất chỉ thị phenolphtalein 1 %: cho vào bình tam giác dung tích 100 ml: 10 ml dịch lên men vi khuẩn, thêm vào 2 - 3 giọt phenolphtalein và 20 ml nƣớc cất trung tính. Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững. Thực hiện mẫu đối chứng là dung dịch chƣa lên men. Hàm lƣợng acid tổng (∑ a g/l) qui về acid lactic (xem nhƣ acid lactic là acid chủ yếu đƣợc tích lũy trong dịch lên men) là: ∑a =(V t -V 0 ) x 0,1 x 90/10 =(V t -V 0 ) x 0,9 Trong đó: V t : Số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10 ml dịch lên men; V 0 : Số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10 ml dịch đối chứng (dịch chƣa lên men). 3.2. Phương pháp nhuộm Gram - Dàn mỏng vi khuẩn thành vết bôi, để khô trong không khí - Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn (tránh làm nóng quá) - Nhuộm tiêu bản bằng crystal violet (tím kết tinh) trong 1 phút - Nhuộm lugol trong 1 phút - Rửa nƣớc - Tẩy bằng cồn trong khoảng 30 giây (hoặc để nghiêng tiêu bản, nhỏ từng giọt cồn cho đến khi thấy màu vừa hết trong các giọt nƣớc chảy ra) - Rửa nƣớc - Nhuộm bổ sung trong 10 - 30 giây bằng phẩm safranin hay fuschin - Rửa nƣớc - Làm khô, soi kính với vật kính dầu 57 Kết quả: vi khuẩn bắt màu tím là Gram dƣơng (G + ). Vi khuẩn có màu hồng là Gram âm (G - ). 3.3. Phương pháp xác định đường khử - Hút 3 ml dung dịch mẫu có chứa đƣờng vào một ống nghiệm. - Thêm vào 1 ml thuốc thử DNS. - Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1 ml thuốc thử DNS vào 3 ml nƣớc cất. - Dùng một miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm, đặc vào nồi nƣớc đang sôi trong 5 phút. - Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ OD ở bƣớc sóng 540 nm. Dùng ống thử không để chuẩn độ truyền suốt về 100 %. - Dựa vào đƣờng chuẩn suy ra nồng độ đƣờng có trong dung dịch. Dựng đồ thị chuẩn + Cân chính xác 1 g glucose (dạng khô không ngậm nƣớc) hòa tan thành 200 ml với nƣớc. Sử dụng bình định mức. + Hút lần lƣợc 1, 2, 3, 4 và 5 ml dung dịch đƣờng này vào 5 bình định mức 50 ml. Thêm nƣớc cho đến vạch định mức. + Các dung dịch đƣờng mới pha này có nồng độ glucose lần lƣợc là 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mg/ml. + Thực hiện phản ứng nhƣ trên . + Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu OD 540 nm. 3.4. Phương pháp đếm khuẩn lạc - Tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mỗi huyền phù có độ đục xác định thành các độ pha loãng 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 nhƣ sau: + Chuẩn bị các ống eppendorf vô trùng chứa 0,9 ml NaCl 0,85% vô trùng đƣợc đánh số từ -1 đến -7. + Dùng pipetman và đầu tip 0,1 ml vô trùng hút 0,1 ml huyền phù tế bào vào ống - 1. Đậy nắp eppendorf, lắc kỹ. Nhƣ vậy ống -1 chứa huyền phù tế bào có độ pha loãng là 10 -1 . + Tiếp theo, dùng pipetman và đầu tip 0,1 ml vô trùng hút 0,1 ml huyền phù tế bào của ống -1 cho vào ống -2. Đậy nắp Eppendorf, lắc kỷ. Khi đó ống -2 chứa huyền phù tế bào có độ pha loãng là 10 -2 . + Thực hiện tƣơng tự để có các huyền phù tế bào với các độ pha loãng 10 -2 - 10 -7 . 58 + Ứng với các huyền phù đƣợc pha loãng từ huyền phù ban đầu có OD 610 nm là 0,1 (hoặc xấp xỉ 0,1), dùng pipetman và đầu tip 0,1 ml vô trùng hút 0,1 ml các huyền phù có độ pha loãng 10 -5 , 10 -6 , 10 -7 tuần tự vào 3 hộp petri môi trƣờng MRS agar đƣợc ghi chú độ pha loãng và mẫu huyền phù ban đầu (OD 610 nm 0,1). + Thực hiện tƣơng tự cho các mẫu huỵền phù ban đầu có OD 610 nm là 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. + Thao tác vô trùng dùng que cấy trang trải đều dịch chứa tế bào lên bề mặt môi trƣờng. Để khô, ủ 37 o C trong 24 giờ. - Tính mật độ tế bào tƣơng ứng với các độ đục khác nhau. + Đếm số khuẩn lạc xuất hiện ở mỗi hộp petri. Sử dụng số liệu của độ pha loãng sao cho có 20 - 300 khuẩn lạc/hộp. Tính số tế bào (N) có trong 1 ml huyền phù ở mỗi độ đục từ số liệu của mỗi độ pha loãng nhƣ sau: N di = A x 10 x di (tế bào/ ml mẫu) A: Số khuẩn lạc đếm đƣợc trên đĩa. d: Số lần pha loãng i. + Tính mật độ tế bào trung bình ứng với mỗi độ đục từ các số liệu N di 3.5. Một số đặc điểm sinh hóa 3.5.1. Thử phản ứng catalase - Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính sạch và khô, sau đó nhỏ H 2 O 2 30 % lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả khoảng 15 giây. - Kết quả + Catalase dƣơng tính: Có hiện tƣợng sủi bọt + Catalase âm tính : Không có hiện tƣợng sủi bọt. 3.5.2. Kiểm tra khả năng sinh indol - Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trƣờng NB nuôi cấy ở 37 o C trong 24 giờ, sau đó nhỏ vài giọt thuốc thử Kowac’s vào môi trƣờng. - Kết quả + Phản ứng dƣơng tính: Lớp mặt môi trƣờng có màu đỏ. + Phản ứng âm tính: Lớp mặt có màu vàng. 3.5.3. Xem khả năng di động 59 - Cách tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn và cấy nhẹ nhàng từ trên xuống dƣới môi trƣờng NB (cách ống nghiệm khoảng 1 cm thì dừng lại) cho vào tủ ấm ở 37 o C trong 24 giờ. - Kết quả: + Phản ứng dƣơng tính vi khuẩn mọc lan ra khỏi đƣờng cấy + Phản ứng âm tính vi khuẩn chỉ mọc trên đƣờng cấy 3.5.4. Khả năng khử nitrate - Cách tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sau vào trong môi trƣờng thạch nitrate bán lỏng, nuôi ở 37 o C trong 24 giờ, nhỏ vào môi trƣờng 2 - 3 giọt Griess A, sau đó nhỏ tiếp 2 - 3 giọt Griess B. - Kết quả + Phản ứng dƣơng tính chuyển sang màu hồng + Phản ứng âm tính không đổi màu 3.5.5. Khả năng phân giải gelatin - Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trƣờng canh NB đã có bổ sung 10 % gelatin, nuôi ở 37 o C trong 24 giờ. Sau đó để ống nghiệm vào ngăn mát tủ lạnh. - Kết quả: + Phản ứng dƣơng tính ở nhiệt độ < 20 o C gelatin vẫn lỏng. + Phản ứng âm tính ở nhiệt độ < 20 o C gelatin đông đặc 3.5.6. Khả năng đông tụ sữa - Cách tiến hành: Lấy 10 % giống vi khuẩn cho vào 10 ml sữa, ủ ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ. - Kết quả + Phản ứng dƣơng tính có đông vón + Phản ứng âm tính không có đông vón 3.5.7.Khả năng lên men nguồn carbohydrate - Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn carbohydrate của vi khuẩn thƣờng không giống nhau. Đây là một trong những đặc tính quan trọng dùng để định danh vi 60 khuẩn. Sự khác nhau về khả năng sử dụng các nguồn thức ăn này phản ánh sự khác nhau về vật liệu di truyền của vi khuẩn qua việc tạo thành enzyme giúp cho quá trình đồng hóa thức ăn. - Pha chế môi trƣờng chứa các nguồn carbohydrate khác nhau: glucose, fructose, maltose, lactose, saccharose, mannitol, sorbitol, dextrin, glycerol với chỉ thị phenol red. - Cách tiến hành Cấy từng loại vi khuẩn vào các ống nghiêm chứa những môi trƣờng có các nguồn carbohydrate này. Nuôi cấy 4 ngày ở nhiệt độ 37 o C. Môi trƣờng trƣớc khi cấy có màu đỏ. Sau khi nuôi cấy môi trƣờng ngả sang vàng tức là pH thay đổi nghiêng về phía acid, chứng tỏ sự lên men bởi vi khuẩn lactic đã xảy ra. . symposium on the lactic acid bacteria 1 36. http://www.dsmz.de/media/med011.htm 52 37. http://141.150.157.11 7:8 080/prokPUB/chaphtm/2 56/ COMPLETE.htm 38. http://www.nld.com.vn/tintuc/kinh-te/tin-the-gioi/9 761 5.asp. mẫu đối chứng là dung dịch chƣa lên men. Hàm lƣợng acid tổng (∑ a g/l) qui về acid lactic (xem nhƣ acid lactic là acid chủ yếu đƣợc tích lũy trong dịch lên men) l : ∑a =(V t -V 0 ) x 0,1 x 90/10. =(V t -V 0 ) x 0,9 Trong đ : V t : Số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10 ml dịch lên men; V 0 : Số ml dung dịch NaOH dùng trung hòa 10 ml dịch đối chứng (dịch chƣa lên men) . 3.2. Phương pháp