41 Qua các khảo sát về một số đặc điểm để phân loại của các khuẩn lạc mà chúng tôi phân lập đƣợc, chúng tôi chỉ xác định đƣợc loài của 2 khuẩn lạc A, B mà phân lập từ chế phẩm, đối với khuẩn lạc D phân lập từ Đại mạch, vì không có điều kiện nên chỉ xác định tới giống. - Khuẩn lạc A + Họ: Lactobacillaceae + Tộc: Lactobacilleae + Giống: Lactobacillus + Loài: Lactobacillus acidophilus - Khuẩn lạc B + Họ: Lactobacillaceae + Tộc: Lactobacilleae + Giống: Lactobacillus + Loài: Lactobacillus bulgaricus - Khuẩn lạc D + Họ: Lactobacillaceae + Tộc: Streptococceae + Giống: Diplococcus 4.4. So sánh về sự tạo acid tổng của L. acidophilus, L. bulgaricus và giống Diplococcus Từ việc khảo sát các điều kiện tối ƣu cho 3 khuẩn lạc chúng tôi tiếp tục so sánh trên 3 môi trƣờng cấp 1, cấp 2 và môi trƣờng sản xuất chúng tôi thu đƣợc một số kết quả sau: - Môi trƣờng cấp 1 Bảng 4.18: So sánh lƣợng acid tổng đƣợc tạo bởi L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus. Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ ( o C) Môi trƣờng cấp 1 (ml) Giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 10 MRS 10 24 10,41 L. bulgaricus 6 45 10 MRS 10 24 7,8 Diplococcus 5 37 10 MRS 10 24 13,26 42 Qua bảng 4.18 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng đƣợc tạo ra bởi Diplococcus nhiều nhất, kế đến L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus - Môi trƣờng cấp 2 Bảng 4.19: So sánh lƣợng acid tổng đƣợc tạo ra bởi L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ ( o C) Môi trƣờng cấp 2 (50 ml) Giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 45 MRS+ 5 mật rỉ 10 24 12,24 L. bulgaricus 6 45 45 MRS+ 5 mật rỉ 10 24 6,75 Diplococcus 5 37 45 MRS + 5 mật rỉ 10 24 13,02 Qua bảng 4.19 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng đƣợc tạo bởi Diplococcus nhiều nhất, kế đến L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus. - Môi trƣờng sản xuất Bảng 4.20: So sánh lƣợng acid tổng đƣợc tạo ra bởi L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus Các yếu tố Các khuẩn lạc pH Nhiệt độ ( o C) Môi trƣờng sản xuất (50 ml) Giống (%) Thời gian (giờ) Acid tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 22,2 L. bulgaricus 6 45 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 5,28 Diplococcus 5 37 5 MRS +45 mật rỉ 10 24 23,5 Từ bảng 4.20 chúng tôi thấy lƣợng acid tổng tạo bởi Diplococcus nhiều nhất, rồi tới L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus. 43 0 5 10 15 20 25 Cấp 1 Cấp 2 Sản xuất Môi trƣờng Acid tổng ( g/l ) L. acidophilus L. bulgaricus Diplococcus Biểu đồ: 4.7. So sánh lƣợng acid tổng tạo thành của 3 khuẩn lạc trên 3 môi trƣờng Qua biểu đồ 4.7 chúng tôi thấy Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất trên cả 3 môi trƣờng, tới L. acidophilus và cuối cùng L. bulgaricus. L. bulgaricus tạo acid tổng giảm dần từ môi trƣờng cấp 1 cho đến môi trƣờng sản xuất, môi trƣờng có chứa mật rỉ càng nhiều thì khả năng tạo acid tổng càng giảm, nên môi trƣờng mật rỉ không phù hợp, có thể môi trƣờng sữa phù hợp cho L. bulgaricus tạo acid hơn. Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất, tuy nhiên chƣa định danh đƣợc loài của nó nên không chọn để sản xuất acid lactic. L. acidophilus tạo acid tổng tăng nhiều từ môi trƣờng cấp 1 cho đến môi trƣờng sản xuất. Lƣợng acid tổng tạo thành cao hơn L. bulgaricus rất nhiều và chỉ thấp so với Diplococcus với số lƣợng nhỏ, hơn thế nó là vi khuẩn lactic đồng hình tạo acid lactic là chủ yếu từ quá trình lên men đƣờng. Chúng tôi thấy L. acidophilus phù hợp để lên men lactic nên chọn để sản xuất acid lactic. 4.5. Sản xuất acid lactic từ mật rỉ 4.5.1 Xác định đường khử - Thực hiện nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tôi dựng đƣợc đồ thị tƣơng quan giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu OD 540 nm. 44 Bảng 4.21: Nồng độ glucose tƣơng ứng OD 540 nm Nồng độ glucose (mg/ml) OD 540 nm 0 0 0,1 0,172 0,2 0,475 0,3 0,791 0,4 1,037 0,5 1,308 Từ kết quả trên ta có đồ thị nhƣ sau: y=-0,0936+2,834x 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Nồng độ glucose (mg/ml) OD 540 nm Đồ thị 4. 1: Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa OD 540 nm và nồng độ glucose (mg/ml) - Dựa vào đồ thị chúng tôi đo đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của các mẫu nhƣ sau: + Mẫu mật rỉ chƣa xử lý có đƣờng khử: 176 mg/ml + Mẫu mật rỉ đã xử lý bằng H 2 SO 4 có đƣờng khử : 244 mg/ml + Mẫu sau lên men có đƣờng khử : 198 mg/ml Lƣợng đƣờng khử trong mật rỉ ban đầu là 176 mg/ml. Sau khi xử lý mật rỉ lƣợng đƣờng khử là 244 mg/ml. Lƣợng đƣờng khử tăng là do H 2 SO 4 biến đƣờng saccharose thành đƣờng glucose và fructose. Sau khi lên men lƣợng đƣờng khử còn 198 mg/ml. R 2 = 0,998 45 4.5.2. Định lượng vi sinh vật Các bƣớc tiến hành nhƣ phần phƣơng pháp, chúng tôi dựng đƣợc đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ hấp thu ở bƣớc sóng 610 nm. Bảng 4.22: Mật độ tế bào tƣơng ứng với OD 610 nm của khuẩn lạc L. acidophilus OD 610 nm Mật độ tế bào (N/ml) Log (N/ml) 0 0x10 6 0 0,1 32,2x10 6 7,508 0,2 61,9x10 6 7,792 0,3 110,4x10 6 8,043 0,4 175,7x10 6 8,245 0,5 321,9x10 6 8,508 Từ kết quả trên ta có đồ thị nhƣ sau: y=7,2833+2,453x 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 OD 610 nm Log (N/ml) Đồ thị 4.2: Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa OD 610 nm và mật độ tế bào của khuẩn lạc L. acidophilus. - Dựa vào đồ thị ta xác định đƣợc số lƣợng vi sinh vật + Số lƣợng vi sinh vật trƣớc khi lên men : 2877,5 x 10 6 tế bào/ml + Số lƣợng vi sinh vật sau khi lên men : 40,25 x 10 6 tế bào/ml R 2 = 0,997 46 - Tiến hành lên men Hình 4.15: Quá trình lên men lactic + Kết quả của quá trình lên men lactic từ mât rỉ đƣờng Lƣợng đƣờng khử cho vào lên men: 244 g/l, lƣợng đƣờng khử sau khi lên men: 198 g/l. Vậy hiệu suất chuyển hóa đƣờng khử: 18,85 %. Lƣợng giống cho vào lên men: 2877,5 x 10 6 tế bào/ml, lƣợng giống sau khi lên men: 40,25 x 10 6 tế bào/ml. Hiệu suất chuyển hóa đƣờng khử thấp và số lƣợng giống giảm do thiết bị lên men không có cánh khuấy làm cho quá trình trao đổi chất giữa L. acidophilus và đƣờng diễn ra chậm và bị ức chế nên L. acidophilus dễ tiến đến phase suy tàn và lƣợng đƣờng còn lại nhiều. Sau khi lên men thu đƣợc lƣợng acid lactic: 9,7 g. Lƣợng acid lactic thu đƣợc thấp do không có cánh khuấy làm giảm tiếp xúc giữa chất dinh dƣỡng và tế bào vi sinh vật. Cho nên khả năng trao đổi chất xảy ra chậm nên lƣợng acid lactic tạo thấp. Theo sơ đồ chuyển hóa acid lactic từ 1 phân tử glucose hoặc fructose chuyển hóa theo con đƣờng EMP cho ra 2 phân tử acid lactic, 180 g đƣờng glucose hoặc fructose tạo ra 180 g acid lactic vậy 46 g đƣờng glucose hoặc fructose chuyển hóa thành 46 g acid lactic. Hiệu suất chuyển hóa thành acid lactic: 21,1 %. Theo (Hui H. Y và ctv, 1994) cho rằng vi khuẩn lactic đồng hình chuyển hóa đƣờng tạo thành 90 % acid lactic. Lƣợng acid lactic thu đƣợc và hiệu suất của nó cao có thể do thiết bị lên men tốt (thiết bị có cánh khuấy) hay giống có chất lƣợng cao và thiết bị tách acid lactic bằng phƣơng pháp hiện đại. Nên quá trình trao đổi chất giữa vi sinh vật và cơ chất diễn ra mạnh hơn, bên cạnh đó chất lƣợng giống tốt làm cho quá trình lên men diễn ra nhanh hơn và cho năng suất cao hơn. Trong quá trình tách acid lactic, nếu tách acid lactic bằng thiết bị hiện đại thì giảm hao hụt acid lactic. 47 Đối với hiệu suất acid lactic của chúng tôi thu đƣợc thấp hơn của tác giả trên do thiết bị lên men không có cánh khuấy làm hạn chế khả năng tiếp xúc giữa L. acidophilus và cơ chất nên lƣợng acid lactic thu đƣợc thấp và có thể do quá trình tách và lọc acid lactic không đƣợc tốt nên lƣợng acid lactic thu đƣợc bị hao hụt. 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: - Phân lập và định danh đƣợc 3 dạng khuẩn lạc: L. acidophilus, L. bulgaricus và Diplococcus từ Antibio, Biolactyl và Đại mạch. - Đã khảo sát các điều kiện tối ƣu cho: + L. acidophilus: nhiệt độ tối ƣu 37 o C, pH tối ƣu = 6, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % và thời gian 24 giờ. + L. bulgaricus: nhiệt độ tối ƣu 45 o C, pH tối ƣu = 6, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % và thời gian 24 giờ. + Diplococcus: nhiệt độ tối ƣu 37 o C, pH tối ƣu = 5, tỉ lệ mật rỉ = 10 %, tỉ lệ giống = 10 % và thời gian 24 giờ. - Diplococcus tạo acid tổng nhiều nhất, kế đến L. acidophilus và cuối cùng là L. bulgaricus trên 3 môi trƣờng cấp 1, cấp 2 và sản xuất. - Chọn L. acidophilus sản xuất acid lactic. 5.2. Đề nghị - Phân lập thêm nhiều khuẩn lạc tự nhiên để tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo acid lactic nhiều để phục vụ cho qui mô công nghiệp - Thiết kế bồn lên men mang tính qui mô công nghiệp - Hƣớng ứng dụng của sản phẩm acid lactic thu đƣợc: + Bảo quản và chế biến thực phẩm (dùng sản xuất dƣa chua, ủ chua rau quả, sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa.v.v.) + Y học (trong phẩu thuật chỉnh hình, trong nha khoa.v.v.) + Mỹ phẩm + Môi trƣờng 49 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Ái, 2003. Công nghệ lên men ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 9-11. 2. Kiều Hữu Anh, 1999. Giáo trình vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 113-118. 3. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty, 2000. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Giáo Dục, trang 141-160, 221-229. 4. Nguyễn Thị Nam Định, 2000. Phân lập-nhân giống vi khuẩn lactic từ dưa chua dùng cho sản phẩm lên men. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, trang 5-8. 5. Vƣơng Thị Việt Hoa, 2002-2003. Thực tập vi sinh đại cương. Tủ sách Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 7-14, 39-49. 6. Dƣ Lý Thùy Hƣơng, 2000. Chọn và khảo sát vài đặc tính của vi khuẩn lactic để muối chua nấm rơm, măng, đậu. Luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh, trang 13-17. 7. Lý Thành Kiệt và Huỳnh Văn Thuận, 2002. Bước đầu nghiên cứu phân lập và nhân giống hai khuẩn lạc vi khuẩn lactic streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus để cung cấp giống cho chế biến yogurt ở quy mô nhỏ. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 7-8. 8. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001. Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 278-280. 9. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ vi sinh, tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 322-336. 10. Nguyễn Đức Lƣợng và Cao Cƣờng, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 1, thí nghiệm Hóa sinh. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 33-34. 11. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 72-73, 414-434, 450-461. 12. Nguyễn Đức Lƣợng và Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, 2003. Công nghệ sinh học môi trường, tập 2, Xử lý chất thải hữu cơ. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh, trang 195-209. 50 13. Bùi Thị Ngọc Phƣơng và Lê Thị Thủy, 2003. Thử nghiệm sản xuất bột giống vi khuẩn lactic streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus dùng trong chế biến yaourt. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thực phẩm, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 6-10. 14. Lê Xuân Phƣơng, 2001. Vi sinh vật công nghiệp. Nhà xuất bản Xây dựng, trang 157-161. 15. Trần Minh Tâm, 2000. Công nghệ vi sinh ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 111-115. 16. Trần Linh Thƣớc, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phƣợng Trang và Phạm Thị Hồng Tƣơi, 2001. Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 52-56. 17.Lê Thị Hồng Tuyết, 2004. Nghiên cứu Bacteriocin sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus NRRL B-2092. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành vi sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.Hồ Chí Minh, trang 4-9. TIẾNG ANH 18. Breed S. Robert, Murray D. G. E, and Hitchens Parker. A, 1948. Bergey ’ s manual determinative bacteriology. Sixth edition, The Williams &Wilkins Company. p. 305- 331, 349-361. 19. Hui H. Y, and Khachatourians G. George, 1994. Food Biotechnology Microorganisms. p. 249-254. 20. Jay M. James, 1996. Modern Food Microbiology. Fifth edition, ITP International Thomson Publishing. p.131-145. 21. Klein Harley Prescott, 1996. Microbiology. Third Edition, volumne two. p.124- 126. 22. Pelczar J. Michael, Chan E. C. S. Jr, and Krieg R. Noel, 1993. Microbiology concepts and applications. p. 873-874. 23. Salminen Seppo, 1961. Lactic Acid Bacteria, microbiology and functional Aspects. p. 4-15, 22-29. 24. Somogyi P. L, Ramaswamy S. H, and Hui H. Y, 1958. Biology, Principles and Applications. 25. Stanier Y. Roger, Doudoroff Michael, and Adelberg A. Edward, 1957. The Microbial World. p. 225-229. . L. acidophilus 6 37 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 22,2 L. bulgaricus 6 45 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 5, 28 Diplococcus 5 37 5 MRS + 45 mật rỉ 10 24 23 ,5 Từ bảng 4.20 chúng tôi thấy. tổng (g/l) L. acidophilus 6 37 45 MRS+ 5 mật rỉ 10 24 12,24 L. bulgaricus 6 45 45 MRS+ 5 mật rỉ 10 24 6, 75 Diplococcus 5 37 45 MRS + 5 mật rỉ 10 24 13,02 Qua bảng 4.19. men : 2877 ,5 x 10 6 tế bào/ml + Số lƣợng vi sinh vật sau khi lên men : 40, 25 x 10 6 tế bào/ml R 2 = 0,997 46 - Tiến hành lên men Hình 4.1 5: Quá trình lên men lactic