Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

Nghiên cứu quá trình lên men lactic từ mật rỉ đường

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, nước ta có nhiều nhà máy đường tạo ra một sản lượng lớn về đường kết tinh Bên cạnh đó một lượng không nhỏ mật rỉ đường mà các nhà máy này thải ra làm ô nhiễm môi trường Với những ứng dụng Công nghệ Sinh học đã sử dụng những phế liệu mật rỉ để lên men tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị như L-lysine, acid citric, acid glutamic.v.v và đặc biệt là acid lactic được quan tâm nhiều trong những năm gần đây

Nhu cầu cung cấp acid lactic ngày càng nhiều, bởi vì chúng được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực như bảo quản và chế biến thực phẩm, trong y học, môi trường (acid polylactic thay thế các loại sản phẩm nhựa PE, PP, đĩa CD, bịch nilon), mỹ phẩm.v.v

Tổng thị trường thế giới về acid lactic 86.000 tấn vào năm 2001, 500.000 tấn vào năm 2010 Ở Việt Nam: vào năm 2006, đại diện công ti dược IIdong (Hàn Quốc) xuất khẩu một số lượng lớn chế phẩm acid lactic sang hãng MERAP phân phối dược ở Việt Nam với giá trị hợp đồng 3,7 triệu USD [38], [39], [40]

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Dưới sự hướng dẫn của Thầy Nguyễn Đức Lượng trường Đại học Bách Khoa và Thầy Phan Vĩnh Hưng Trường Cao đẳng Công

nghiệp Thực Phẩm TP.HCM Chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình lên

men lactic từ mật rỉ đường” 1.2 Mục đích của đề tài

Chọn vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic nhiều nhất để sản xuất acid lactic

1.3 Yêu cầu

- Phân lập vi khuẩn lactic

- Tuyển chọn các khuẩn lạc có khả năng lên men lactic - Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men - So sánh sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc

- Sản xuất acid lactic từ mật rỉ

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Giới thiệu về acid lactic

Acid lactic, 2-hydroxypropionic acid (CH3CHOHCOOH) là acid tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy ở người, động vật, thực vật và vi sinh vật Được phát hiện vào năm 1780 do nhà hóa học Thụy Điển Sheele ở trong sữa chua Acid lactic được chấp nhận là sản phẩm của một quá trình lên men vào năm 1847 [2], [25], [32]

Trong cấu tạo phân tử của acid lactic có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai đồng phân quang học: D - acid lactic và L - acid lactic Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái Do đó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau

Loại L - acid lactic ở dạng tinh thể Chúng có khả năng tan trong nước, tan trong cồn, tan trong eter, không tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 28o C [9] L - acid lactic được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Hầu hết các sinh

vật lên men lactic đồng hình đều tạo ra được các dạng đồng phân quang học [32] Loại D - acid lactic là dạng tinh thể, tan trong nước tan trong cồn Nhiệt độ nóng

chảy 28o C

Nếu D - acid lactic và L - acid lactic có trong một hỗn hợp theo tỉ lệ 50/50 người ta gọi là hỗn hợp Raxemic Trong quá trình lên men không khi nào có một hỗn hợp có tỉ lệ lý tưởng này mà chỉ có được hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ DL - acid lactic có khả năng tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3 [9]

2.2 Vi sinh vật trong lên men lactic

Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ các cây trồng trên thế giới bao gồm hạt

trái cây và rau [24] Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột non, ruột già và

âm đạo [21]

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, tỉ lệ G+C thấp, cầu khuẩn hay hình que Chúng sản xuất ra acid lactic như là sản phẩm lên men chính Chúng không có enzyme catalase mặc dù catalase giả có thể được tìm thấy trong những trường hợp rất hiếm vì vậy không phân giải oxi già Các thành viên của nhóm này thiếu cytochrome Tất cả các vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kị khí Tuy nhiên, không giống như những vi khuẩn kị khí, hầu hết các vi khuẩn acid lactic không nhạy cảm với oxi và cũng có thể phát triển tốt trong điều kiện có mặt oxi cũng như không có mặt oxi Vì thế chúng là vi khuẩn kị khí tùy ý (Madigan et al 2000) [30]

Sự phân chia vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất

của carbohydrate, các loài Lactobacillus có thể phân chia thành 3 nhóm [23], [19]

- Nhóm I: Lên men đồng hình bắt buộc có fructose-1,6-diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose.)

- Nhóm II: Lên men dị hình tùy ý (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic)

- Nhóm III: Lên men dị hình bắt buộc (Có phosphoketolase nhưng không có FDP

aldolase, quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình)

Bảng 2.1 Phân loại Lactobacillus (Sharpe, 1981; Kandler và Weiss, 1986)

Lên men pentose Tạo CO2 từ glucose Tạo CO2 từ gluconate Sự hiện diện FDP aldolase Sự hiện diện phosphoketolase

- - - + -

+ - +a + +b

+ + +a- +

L delbrueckii L helveticus L salivarius

L casei L curvatus L plantarum L sake

L brevis L buchneri L fermentum L reuteri

a: Khi lên men

b: Cảm ứng khi có pentose

Một đặc điểm quan trọng dùng để phân biệt các giống vi khuẩn acid lactic là sự lên men glucose dưới các điều kiện chuẩn như: nồng độ glucose và các yếu tố tăng trưởng (các tiền chất acid amin, vitamin và acid nucleic) thì không giới hạn và giới hạn sử dụng oxi Dưới những điều kiện này, vi khuẩn acid lactic có thể phân thành hai nhóm: lên men lactic đồng hình thì chuyển hầu hết lượng glucose để tạo thành acid lactic và lên men lactic dị hình thì glucose lên men tạo thành acid lactic, ethanol, acid acetic và CO2 Thật ra việc kiểm tra sản phẩm khí từ glucose sẽ phân biệt được giữa hai nhóm này (Sharpe, 1979)

2.2.1 Vi khuẩn lactic dị hình

Khi tiến hành lên men các dung dịch đường, các vi khuẩn lactic dị hình thường tạo ra lượng acid lactic không lớn lắm Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra hàng loạt các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, CO2 [3], [9]

Một số loài vi khuẩn lactic dị hình được nghiên cứu như sau:

- Lactobacillus pasteurianus

Trực khuẩn, gram dương, kích thước rộng 0,5 – 1 μm; dài 7,0 – 35 μm Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ, không di động Có khả năng lên men được, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, mannitol, dextrin Trong quá trình lên men

tạo một số sản phẩm như CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic Nhiệt độ thích hợp 29 - 33o C, pH thích hợp 8 [9]

- Lactobacillus brevis

Thuộc trực khuẩn, gram dương, không có khả năng di động, kích thước rộng 0,7 - 1,0 μm, dài 2,0 - 4,0 μm Trong thiên nhiên chúng liên kết với nhau thành chuỗi Trong quá trình phát triển, chúng có thể sử dụng lactat canxi như nguồn cung cấp cacbon Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, fructose, galactose, maltose Chúng hiếm khi lên men mannitol, glycerol, dextrin, và tinh bột Chúng không hóa lỏng gelatin [18]

- Lactobacillus lycopessici

Trực khuẩn, gram dương, trong thiên nhiên chúng tồn tại từng đôi một, có khả năng tạo bào tử Trong quá trình lên men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2

- Streptococcus cumoris

Thuộc loài cầu khuẩn, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng chuỗi rất dài Thuộc gram dương, nhiệt độ thích hợp phát triển là 30o C, không phát triển ở nồng độ NaCl 4 % Khi lên men đường tạo ra acid acetic, diacetyl, CO2 Chúng có khả năng tạo ra những chất kháng khuẩn

- Streptolacticus lactic

Thuộc chồi cầu khuẩn, gram dương, nhiệt độ phát triển từ 10 – 45o C, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 4 % Khi lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, saccharose, mannitol, tạo ra acid lactic, acid acetic, diacetyl, CO2 Chúng không có khả năng lên men được glycerol, sorbitol

- Streptococcus faecalis

Chúng tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, gram dương Nhiệt độ tối ưu 37o C, nhiệt độ sinh trưởng 10 - 45o C, có thể phát triển duới hoặc 5o C, hiếm khi phát triển ở 50o

C Có khả năng sống sót ở 62,8o C trong 30 phút Phát triển ở pH 9,6 Chịu được nồng độ NaCl 2 %, 4 % và 6,5 % Có khả năng lên men đường glucose, maltose, lactose và luôn luôn lên men mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose, glycerol, sorbitol

[18]

- Lactobacillus bulgaricus

Chúng được tìm ra do Mesnhicov ở sữa chua Bungari [14] Thuộc loại trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành chuỗi, gram dương Chúng không có khả năng di động, có khả năng lên men các loại đường như glucose, lactose, galactose Có thể hoặc không thể lên men fructose, maltose và sucrose không lên men được xylose, mannitol, dextrin Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate [9] Quá trình lên men tạo 3,7 % acid lactic [14] Trên môi trường khoai tây, có khuẩn lạc trắng vàng [18] pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 5,2 - 5,6 [7] Nhiệt độ tối ưu 45 - 50o C Tối thiểu 22o C [20] Trong sản xuất qui mô lớn, chúng thường được chọn để lên men Whey để tạo acid lactic, sau đó dùng Ca(OH)2 để trung hòa lượng acid lactic tạo thành Nhiệt độ lên men 43o C, với nhiệt độ này đủ để ức chế các vi sinh vật

gây nhiễm mà không ức chế L bulgaricus [22]

- Lactobacillus bifidus

Trực khuẩn rất nhỏ, kích thước trung bình khoảng 4 μm, không có khả năng di động, thuộc gram dương Chúng có thể đứng riêng lẽ, cặp và chuỗi ngắn Có khả năng

lên men được các loại đường như glucose, fructose, galactose, saccharose, dextrin, tinh bột và maltose [18]

- Lactobacillus casei

Vi khuẩn được phân lập từ sữa, sản phẩm của sữa, ủ xylo- thức ăn xanh dùng trong chăn nuôi, vi khuẩn dạng hình que, kích thước 0,7 - 1,1 μm; 2,0 - 4,0 μm, trực khuẩn nhỏ thường gặp ở dạng chuỗi dài hay chuỗi ngắn [4] Chúng thuộc gram dương, không có khả năng lên men được các loại đường như glucose, fructose, galactose, maltose, lactose và mannitol; có hoặc không thể lên men sucrose Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30o C, thấp nhất 10o C Tối đa 37 - 40o C và vài chủng có thể 45o C Quá trình lên men tạo khoảng 1,5 % acid lactic [18]

- Lactobacillus causaciccus

Trực khuẩn ngắn, không có khả năng di động, gram dương Chúng có khả năng lên men các loại đường như glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, mannitol Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 - 55o C [9]

- Lactobacillus delbrueckii

Thường gặp chúng trên hạt đại mạch [14] Vi khuẩn chịu nhiệt, được tìm thấy ở các loài hạt ngũ cốc và tinh bột, đây là một giống vi khuẩn có khả năng đồng hóa được tinh bột Trực khuẩn dài, kích thước 0,5 - 0,8 μm; 2,0 - 9,0 μm, không di động, gram dương Quá trình lên men tạo 2,5 % acid lactic Chúng có khả năng lên men được glucose, fructose, maltose, sucrose, galactose và dextrin Chúng không có khả năng lên men xylose, lactose, tinh bột, mannitol Nhiệt độ tối ưu 45o

C [9], [18]

-Lactobacillus leichmannii

Trực khuẩn gram dương Kích thước tế bào 0,6 – 2 μm Vi khuẩn này có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, không di động, gram dương Nhiệt độ tối ưu 36o C Tối đa 40 - 46o C Chúng không có khả năng tạo nitrit từ nitrate Có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose Trong môi trường khoai tây chúng tạo 1,3 %

acid lactic [18]

- Lactobacillus helveticcus

Thuộc trực khuẩn có kích thước 0,7 - 0,9 μm; 2,0 - 6,0 μm Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tồn tại thành từng chuỗi tế bào Nhiệt độ phát triển 40 - 42o C Chúng có khả năng lên men được glucose, fructose, galactose, maltose và lactose [9]

- Lactobacillus thermophillus

Trực khuẩn, gram dương, kích thước tế bào 0,5 - 3,0 μm, không có khả năng di động Lên men được glucose, lactose, sucrose, tinh bột và dạng glycerol Không tạo acid từ mannitol Lên men được fructose, galactose, maltose và dextrin Không tạo nitrit từ nitrate Nhiệt độ tối ưu 50 - 62,8o C Nhiệt độ tối thiểu 30o C, nhiệt độ tối đa 65o C Điểm nhiệt độ chết khoảng 71o C trong 30 phút [18]

- Lactobacillus plantanrum

Trực khuẩn, gram dương, kích thước tế bào 0,7 - 1,0 μm; 3,0 - 8,0 μm Nhiệt độ tối ưu 30o C Tối thiểu 10o C, tối đa 40o C Điểm nhiệt độ chết từ 65 - 75o

C trong 15 phút Có khả năng chịu nồng độ NaCl 5,5 % Chúng có khả năng lên men glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose Tinh bột thì không lên men Không tạo được nitrit từ nitrate [18]

- Lactobacillus sporogenes

Thuộc giống Lactobacillus dựa trên các đặc tính bởi Nakayama và Yanoshi

(1967) Chúng thuộc Gram dương, có khả năng sinh bào tử, có dạng hình que, kích thước 3 – 5 μm, thuộc vi khuẩn hiếu khí, là vi khuẩn lactic đồng hình sản xuất ra axít lactic L(+) - (dextrorotraytory), phát triển ở nhiệt độ dao động từ 35 - 50o C, pH tối ưu dao động từ 5,5 - 6,5, phản ứng với catalase dương tính Tạo acid từ glucose, galactose, fructose, maltose và sucrose Không có thủy phân tinh bột hoặc casein,

không hóa lỏng gelatin phản ứng indol âm tính và không tạo khí [31]

2.3 Cơ chế tạo ra acid lactic [20]

Kluyver chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm dựa vào sản phẩm cuối của quá trình chuyển hóa glucose Quá trình này tạo acid lactic là sản phẩm chính từ lên men glucose được gọi là lên men đồng hình Số lượng acid lactic đồng hình thu được nhiều hơn lactic dị hình khoảng 2 lần Vi khuẩn lactic dị hình lên men từ hexose tạo số lượng mole lactat, CO2 và ethanol bằng nhau

Bảng 2.2 Vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình [20]

Sinh vật Dạng lactat

2.3.1 Vi khuẩn lactic dị hình [9]

Tất cả các vi khuẩn lactic dị hình thường thiếu hai loại enzym quan trọng đó là aldolase và hexose isomerase Do đó trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, chúng thường được tiến hành theo con đường hexose monophosphate hay gọi là con đường pentose phosphate (PP ) Quá trình chuyển hóa đường được trình bày như sau:

2.3.2.Vi khuẩn lactic đồng hình

Quá trình lên men lactic đồng hình nhờ có enzyme aldolase và hexose isomerase nhưng thiếu phosphoketolase Chúng sử dụng con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) để tạo 2 phân tử lactat từ 1 phân tử glucose [9], [19], [20] Quá trình chuyển hóa được trình bày như sau:

2.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng rất phức tạp, không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển được chỉ có chứa glucose và NH4+ Đa số trong chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin) và các acid amin Vì thế người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một số lượng tương đối lớn cao nấm men, dịch cà chua hoặc thậm chí máu Một số loài vi khuẩn lactic có những nhu cầu về yếu tố tăng trưởng chính xác hơn động vật hữu nhũ [25]

2.4.1.1 Nhu cầu dinh dưỡng carbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều carbohydrate như glucose, fructose, maltose, saccharose…các nguồn carbon này dùng để cung cấp năng lượng và tham gia vào hầu hết các cấu trúc của tế bào Vì vậy đây là nguồn thức ăn có ý nghĩa hàng đầu đối với sự sống của tế bào vi sinh vật [13] Nguồn carbon tốt nhất là các loại đường và ở mức độ nhỏ các đường chứa nhóm rượu, còn polysaccharide thì thực chất không thể lên men Tốc độ lên men các loại mono-, di- và oligosaccharide khác nhau đến mức có thể dùng tiêu chuẩn này để có thể phân biệt giữa các loài [2]

2.4.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Đa số vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ, chỉ có một số loài có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn vô cơ Vì vậy, để đảm bảo sự phát triển của mình, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Tuy nhiên, để sinh trưởng và phát triển bình thường thì ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ như: cao thịt, cao nấm men, pepton, casein…[13]

Bảng 2.3 Các acid amin cần thiết cho vi khuẩn lactic [34]

L-Arginine L-Isoleucine L-Threonine L-Acid aspartic L-Leucine L-Tryptophan

L-Acid glutamic L-Phenylalanine L-Valine

2.4.1.3 Nhu cầu về vitamin

Vi khuẩn lactic rất cần vitamin cho sự phát triển và các vitamin này đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của chúng Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp đƣợc vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin nhƣ: riboflavin, tiamin, biotin Bảng 2.4 Các vitamin và các yếu tố có liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn lactic [34]

Yếu tố phát triển Các sinh vật đại diện mà đòi các hợp chất cho sự phát triển

Lactobacillus arabinosus

Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Acid folic (Acid pteroylglutamic) Lactobacillus casei Streptococcus faecalis

Acid folinic (acid leucovorin, 5,6,7,8-tetrahydropteroylglutamic)

5-Formyl-Leuconostoc citrovorum

Acid lipoic (Acid thioctic, yếu tố thay thế acetat, protogen)

Lactobacillus caseiStreptococcus lactis

Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

Pantetheine hoặc pantethine Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus

Streptococcus lactis

Streptococcus lactis

Pyridoxamin phosphat Lactobacillus acidophilusLactobacillus delbrueckiiLactobacillus lactis

Lactobacillus leichmannii

2.4.1.4 Nhu cầu về các chất hữu cơ

Ngoài các nguồn dinh dưỡng trên, vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của chúng như purine, pyrimidine Acid hữu cơ như acid acetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác Tween 80 là một dẫn xuất của acid oleic, là một loại acid hữu cơ quan trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn lactic Ngoài ra các acid béo cũng ảnh hưởng lên sinh trưởng của các vi khuẩn lactic nhưng cơ chế còn chưa được biết rõ [2]

2.4.1.5 Nhu cầu các muối vô cơ

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ Phosphat là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu Các muối amôn không thể được dùng làm nguồn nitơ duy nhất song hình như chúng gây một ảnh hưởng nhất định lên sự chuyển hóa một số acid amin Đối với

Lactobacillus thì Mn2+, Fe2+, Mg2+ có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sinh ra acid lactic [13] Sự vắng mặt glucose thì Mg2+ không ảnh hưởng đến sự ổn định của

Lactobacillus delbrueckii nhưng khi có glucose thì nó làm ổn định quá trình thủy phân

(Rees và Pirt, 1979) Cơ chế của sự ổn định này chưa được xác định, nhưng tất cả các các trình tự thủy phân của kinase xem Mg2+ như là đồng nhân tố Sự đòi hỏi Mg2+ bởi

Lactobacillus delbrueckii không thể thay thế bằng Mn2+ [23]

2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

Trong nghiên cứu vi khuẩn lactic thì thường sử dụng môi trường: MRS (de Man, Rogosa and Sharpe), môi trường cà chua, môi trường cao nấm men, môi trường rau cải, môi trường cà chua - Tween 80, môi trường nấm men - glucose, môi trường nhũ thanh, môi trường sữa Tùy theo từng loại và thành phần môi trường mà áp dụng phương pháp xử lý cho thích hợp Thiết bị lên men dùng để lên men trong phòng thí nghiệm là bình erlen hoặc fermentor cỡ nhỏ có gắn các thiết bị kiểm soát các thông số có liên quan Dù ta sử dụng môi trường, thiết bị lên men nào cũng phải đảm bảo điều kiện vô trùng, công đoạn này quyết định hiệu quả của quá trình lên men

2.4.2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài Để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon

(chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các nguyên tố vi lượng Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men

2.4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới sinh trưởng Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng manh

2.4.2.3 Ảnh hưởng của pH môi trường

Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giới hạn pH nhất định của môi trường nuôi cấy Với vi khuẩn lên men lactic đồng hình, pH môi trường thường không ảnh hưởng đến các sản phẩm đặc trưng của quá trình lên men, còn đối với vi khuẩn lactic dị hình, pH môi trường có ảnh hưởng đến việc tạo thành các sản phẩm lên men Khi pH môi trường cao thì sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic, còn khi pH môi trường thấp thì ngoài acid lactic còn có thêm acid acetic và nhiều sản phẩm phụ khác

Acid mới tạo thành phải được trung hòa liên tục Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nằm giữa 5,5 và 6,0 Lên men bị ức chế mạnh ở pH = 5 và sẽ dừng lại ở các pH dưới 5 [2] Khi acid lactic được hình thành và nồng độ tăng dần trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm và nồng độ acid lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức chế vi khuẩn lactic [15]

2.4.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày càng một nhiều sẽ ức chế chúng Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng tạo ra ức chế, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3

2.4.2.5 Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Trong quá trình lên men tạo sinh khối thường dựa trên cơ sở nuôi cấy một chủng thuần khiết, vì vậy việc đảm bảo cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ giữ giống trong ống nghiệm, nhân giống trong bình erlen…đều phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối

Hệ vi sinh vật tạp mhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành các sản phẩm lên men

2.5 Ứng dụng của vi khuẩn lactic và acid lactic

Vi khuẩn lactic và acid lactic ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong bảo quản và chế biến thực phẩm, y học, môi trường, mỹ phẩm.v.v Nhưng nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm…

2.5.1 Trong bảo quản và chế biến thực phẩm [17] [19]

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu nhận acid lactic Acid lactic sản xuất công nghiệp được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Do vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản, một lượng lớn acid lactic được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm Acid lactic được sử dụng như là một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt, sirô Ngoài ra, acid lactic còn được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, acid hóa dịch đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu mạnh và để sản xuất bột chua trong ngành bánh mì

- Ứng dụng để sản xuất dưa chua

Quá trình muối chua rau, quả chính là quá trình hoạt động sống của vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic Trong quá trình phát triển của chúng, trong rau quả, khi lên men sẽ tạo ra acid lactic và acid acetic cùng một số loạt acid hữu cơ khác Các acid hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại hiện tượng gây thối rau, quả Mặt khác nhờ có lượng acid hữu cơ được tạo thành sẽ làm tăng hương vị của khối ủ chua rau, quả là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản [9]

- Ứng dụng để làm chua quả

Trước đây, người ta thường sử dụng acid acetic để ngâm chua quả Sau này người ta sử dụng acid lactic để ngâm chua quả Phương pháp thay thế này tỏ ra hiệu quả vì chúng ít làm thay đổi màu tự nhiên của quả và vẫn đảm bảo chất lượng quả ngâm chua

- Ứng dụng trong sản xuất tương

Sản xuất tương theo phương pháp của miền Bắc (Việt Nam) có giai đoạn ngả nước đậu sau khi rang Quá trình ngả nước đậu xảy ra nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau, trong đó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị cho sản phẩm

- Ứng dụng trong sản xuất đậu phụ

Trong sản xuất đậu phụ có giai đoạn kết tủa protein của đậu Phương pháp truyền thống thường làm là dùng nước chua (chứa vi khuẩn lactic) để tạo kết tủa (nhờ pH giảm đến điểm đẳng điện của protein đậu nành)

- Ứng dụng để sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa

Trong sản xuất các loại sữa chua đều có sử dụng quá trình lên men lactic Nhờ có quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic mà casein được kết tủa và tạo cho sản phẩm hương vị đặc trưng Hippocrates, người được xem là cha đẻ của ngành y đã cho rằng “Whey”, loại nước xuất hiện khi tách bơ ra khỏi sữa chính là một dạng huyết thanh của sữa Trong “Whey” chiếm khoảng 4,5% đường sữa Trong ruột chất đường này biến thành acid lactic, một chất hỗ trợ cho loại vi khuẩn lành mạnh trong ruột phát triển [28]

- Ứng dụng để ủ thức ăn gia súc

Về nguyên tắc, ủ các loại cỏ và lá cây làm thực phẩm gia súc cũng giống như công nghệ sản xuất dưa chua Quá trình lên men lactic xảy ra làm gia tăng giá trị dinh dưỡng và khả năng bảo quản cỏ, lá cây cho gia súc

2.5.2 Trong y học

- Ứng dụng vi khuẩn lactic để chữa bệnh đường ruột

Thực ra việc ứng dụng này đã được Việt Nam ứng dụng từ lâu Khi người ta bị tiêu chảy, thầy thuốc khuyên hàng ngày uống 1 - 2 chén nước dưa chua Phương pháp này tỏ ra rất hiệu nghiệm trong điều kiện ngành dược chưa phát triển

Dựa vào hiệu quả sử dụng vi khuẩn lactic trong việc chữa trị tiêu chảy, Pháp đã sản xuất và đưa ra thị trường từ hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên là Biolactyl Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng nhiều vi khuẩn lactic

- Ứng dụng acid lactic theo phương pháp chữa vi lượng đồng cân (homeopathy) Trong quá trình vận động của cơ thể, mô cơ hoạt động mạnh và trong một thời gian dài sẽ gây hiện tượng mệt mỏi Hiện tượng mệt mỏi này xuất hiện do các phản ứng sinh hóa xảy ra trong mô cơ, tạo acid lactic

Các thầy thuốc đã tạo ra một vị thuốc bao gồm acid lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi và có khả năng làm việc và hoạt động liên tục trong thời gian dài

- Ứng dụng acid lactic trong phẫu thuật chỉnh hình

Trong phẫu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng loại vật liệu có tên là purasorb Purasorb là một hợp chất cao phân tử được sản xuất từ acid lactic Thành phần của purasorb bao gồm: lactides, glycolide, polylactides, polyglycolide, lactide/glycolide copolyme Purasorb được sử dụng như những định ghim, gắn phần xương lại với nhau; khi xương định hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy [9] Một loại thanh dẫn có thể mang 20 lớp thuốc khác nhau vừa được các chuyên gia Singapore sáng chế Đây là loại thanh dẫn tự tiêu đầu tiên trên thế giới giúp người bệnh tim mau chóng bình phục đồng thời giảm thiểu nguy cơ nhiễm trùng và phát bệnh trở lại Các nhà phát minh thuộc Đại học Công nghệ Nanyang cho rằng, với loại thanh dẫn này, bác sĩ có thể kết hợp nhiều loại thuốc phù hợp với từng loại bệnh trạng của từng người để tăng hiệu quả điều trị Khi được đưa vào cơ thể, thanh dẫn sẽ nhả thuốc vào từng thời điểm khác nhau kéo dài trong nhiều tháng Khi hết thuốc nó sẽ tự hủy hoàn toàn Thanh dẫn được chế tạo bằng PLA và PLGA, khi vào cơ thể sẽ chuyển hóa thành acid lactic và có thể hấp thụ vào máu Không chỉ được sử dụng trong động mạch vành tim, loại thanh dẫn tự hủy này có thể được cấy trong não, phôi, đường niệu hoặc bất kì cơ quan nào bị nghẽn mạch máu Được biết, các loại thanh dẫn hiện nay đều làm bằng kim loại và chỉ mang được một loại thuốc duy nhất, có thể gây tụ huyết khối và làm mạch máu tắc nghẽn trở lại [26]

- Ứng dụng acid lactic trong nha khoa [9], [22]

Trong nha khoa có hai chế phẩm được sử dụng nhiều đó là Puramex và puracal Puramex bao gồm các thành phần sau: amulinium lactat, Fe-lactat (được sử dụng để điều trị thiếu máu), Mg-lactat, Mn-lactat, Zn-lactat còn puracal chỉ có lactat canxi Các chế phẩm này thường làm răng khỏe hơn

- Ứng dụng để sản xuất vật liệu sinh học (Biomaterials)

Các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic Các copolyme này có tính năng rất giống những bộ khung xương động vật Hướng này đang được nghiên cứu và người ta hy vọng trong tương lai nó sẽ được ứng dụng nhiều

- Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi

Người ta thường bổ sung lactat canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng để tăng lượng canxi cho cơ thể [9] Thiếu calci lại ảnh hưởng đến

hoạt động của cơ tim, tới sự tạo huyết và đông máu, là nguyên nhân của bệnh còi xương ở trẻ em và giòn xương xốp xương ở người già [27]

2.5.3 Trong môi trường

Các phòng thí nghiệm đang nghiên cứu loại chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo củ khó phân hủy Chất dẻo mới này là một loại polyme được gọi là poly acid lactic (PLA) Đó là sản phẩm tạo ra từ phản ứng trùng hợp acid lactic Người ta hy vọng trong tương lai nó sẽ thay thế chất dẻo được sản xuất từ dầu mỏ vì tính chất dễ phân

hủy của nó có ý nghĩa rất lớn trong bảo vệ môi trường [9]

2.5.4 Trong mỹ phẩm [9][22]

Các loại lactat kim loại (chẳng hạng như lactat natri) được sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal và của hãng mỹ phẩm Punac Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và làm sáng da [9]

2.6 Sản xuất acid lactic

2.6.1 Mật rỉ đường [1], [8], [12]

Là phế liệu chứa nhiều đường không kết tinh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Thông thường tỉ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm khoảng 3 – 5 % trọng lượng mía Tùy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ sản xuất đường.v.v

Thành phần rỉ đường dao động như sau: Nước chiếm 15 – 20 %; chất khô chiếm 80 – 85 % Trong chất khô có 60 % là đường (40 % là đường saccharose và 20 % là fructose và glucose) và 40 % chất khô còn lại là chất không phải là đường (phi đường) Trong thành phần phi đường có khoảng 30 – 32 % hợp chất hữu cơ và 6 – 10 % hợp chất vô cơ Trong hợp chất vô cơ, theo Mắc-Dinit, gồm có K2O: 3,5 %; Fe2O3: 0,2 %; MgO: 0,1 %; sulfat: 1,6 %; CaO: 1,5 %; SiO2: 0,5 %; P2O5: 0,5 %; Clorit: 0,4 %

Trong những hợp chất hữu cơ gồm có hợp chất có chứa nitơ và không chứa nitơ ở dạng amin như: acid aspactic, acid glutamic, leuxin, isoleuxin [2]

Ngoài ra trong rỉ đường có một số vitamin (tính theo μ/g mật rỉ đường ) như sau:

Bảng 2.5 Thành phần vitamin trong rỉ đường

Các vitamin Số lượng (μg/g) Thiamin

Riboflavin Acid nicotinic Acid folic Pyridoxin Biotin

Acid pantotenic

8,3 2,5 21,0 0,038

6,5 12,0 21,4

2.6.2 Qui trình sản xuất acid lactic [14]

Acid lactic tinh thể Mật rỉ

H2SO4

Kết tinhCô đặc

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1 Thời gian

Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005

3.1.2 Địa điểm

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Chế phẩm Biolactyl của Pháp - Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc

- Đại mạch của trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp HCM

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36] - Môi trường MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar)

- Môi trường YGC agar (Yeast extract Glucose Calcium carbonat) [37] - Môi trường thử khả năng lên men đường [11]

- Môi trường thạch nitrate bán lỏng

- Môi trường thử khả năng phân giải gelatin - Môi trường thạch bán lỏng di động

- Môi trường thử khả năng sinh indol

Thành phần và tỉ lệ môi trường nuôi cấy được trình bày ở mục 1 phần phụ lục

3.2.5.Thuốc nhuộm và thuốc thử

- Dung dịch thuốc nhuộm Bromocresol Purple 0,2% [11] - Thuốc nhuộm Gram [11]

- Thuốc thử uphenmen [11] - Thuốc thử DNS [10]

- Thuốc thử và hóa chất dùng chuẩn độ

Thành phần và tỉ lệ của thuốc nhuộm và thuốc thử được trình bày ở mục 2 phần phụ lục

3.3 Phương pháp thí nghiệm 3.3.1 Phân lập và sơ chọn giống

3.3.1.1 Quan sát đại thể

- Môi trường MRS agar và YGC agar

+ Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các khuẩn lạc Giống phân lập trên môi trường YGC agar, CaCO3 sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh khuẩn lạc

+ Thực hiện

* Pha loãng mẫu trong nước cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau

* Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trường MRS agar Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ

* Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trường YGC agar Nuôi cấy ở nhiệt độ 37o C Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều

+ Lấy 5 ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen Quan sát sự đổi màu Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng:

+ Ống 1: 5 ml môi trường MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3 ml thuốc thử uphenmen

+ Ống 2: 5 ml acid lactic tinh khiết, thêm 3 ml thuốc thử uphenmen

3.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng [11]

- Nguyên tắc: Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng được bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein

- Ảnh hưởng nhiệt độ

Sau khi chọn được pH thích hợp cho các khuẩn lạc, khảo sát ở nhiệt độ phòng, 37o C, 45o C, 50o C Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trường (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm men) Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dich nuôi cấy tương ứng

- Ảnh hưởng tỉ lệ mật rỉ

Chọn được pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %, 10 %, 15 %, 20 % Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trường (gồm có tỉ lệ mật rỉ như trên và 0,5 % nấm men) Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dịch nuôi cấy tương ứng

- Ảnh hưởng tỉ lệ giống

Chọn được pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ Khảo sát tỉ lệ giống: 5 %, 10 %, 15 %, 20 % Lấy tỉ lệ giống như trên cho vào 10 ml môi trường (gồm có tỉ lệ mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men) Sau 24 giờ, xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dịch nuôi cấy tương ứng

- Ảnh hưởng thời gian

Chọn được pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào 10 ml môi trường (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men) Đem khảo sát ở các thời

điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ Xác định lượng acid tổng tích lũy được trong dịch nuôi cấy tương ứng

3.3.4.2 Đặc điểm sinh hóa

- Thử phản ứng catalase - Kiểm tra khả năng sinh indol - Xem khả năng di động - Khả năng khử nitrate - Khả năng phân giải gelatin - Khả năng đông vón sữa

- Khả năng lên men nguồn carbohydrate

Cách tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem mục 3.5 phần phụ lục)

3.3.5 So sánh về sự tạo acid tổng của các khuẩn lạc: A, B, D

- Môi trường cấp 1

Với các điều kiện đã khảo sát như pH, nhiệt độ tối ưu cho từng khuẩn lạc Cho 10 % giống vào 10 ml môi trường MRS (môi trường cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ

+ Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm Như vậy, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số lượng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy

+ Tương quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ được suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau khi đo ở bước sóng 610 nm

* Dựng đồ thị tương quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục

của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x)

3.3.6.3 Qui trình sản xuất

Mật rỉ Xử lý Lên men

Trung hòa Lactat canxi

Lọc Dung dịch H2SO4

- Chuẩn bị môi trường lên men

Trước tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H2SO4 vào với tỉ lệ 3,5 ml H2SO4 trong 1000 ml mật rỉ Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu được phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5 % cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ưu của khuẩn lạc đem sản xuất acid lactic)

- Giai đoạn lên men

+ Chuẩn bị giống để lên men * Giống cấp 1

Với các điều kiện đã khảo sát như pH, nhiệt độ tối ưu cho từng khuẩn lạc Cho 10 % giống vào 10 ml môi trường MRS (môi trường cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ

* Giống cấp 2

Cho 10 % giống từ môi trường cấp 1 vào 50 ml môi trường gồm 5 ml mật rỉ và 45 ml MRS (gọi là môi trường cấp 2) Đem ủ ở các điều kiện thích hợp của chúng trong 24 giờ

* Giống sản xuất

Cho 10 % giống từ môi trường cấp 2 vào 50 ml môi trường gồm 45 ml mật rỉ và 5 ml MRS (môi trường sản xuất) Đem ủ các điều kiện thích hợp của chúng, trong 24 giờ

+ Cho 10 % giống sản xuất vào môi trường chuẩn bị lên men, tiến hành lên men ở pH, nhiệt độ tối ưu trong thời gian 7 ngày

- Giai đoạn tạo lactat canxi

Trong thời gian lên men, lượng acid tạo ra liên tục nên ta phải trung hòa bằng CaCO3 để cho pH ổn định cho khuẩn lạc đó Sau khi kết thúc quá trình lên men, loại bỏ dịch trên, thu được phần lactat canxi Đem trung hòa lượng lactat canxi bằng H2SO4, thu được phần dịch, đem lọc bằng than hoạt tính thu được dung dịch acid lactic

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và sơ chọn giống

4.1.1 Quan sát đại thể

4.1.1.1 Môi trường MRS agar và YGC agar

Từ các nguồn: Biolactyl, Antibio, Đại mạch, quá trình phân lập và làm thuần được 3 dạng khuẩn lạc sinh acid Ký hiệu A, B, D Khuẩn lạc A phân lập từ Antibio, khuẩn lạc B từ Biolactyl và khuẩn lạc D từ Đại mạch

Các khuẩn lạc trên được phân biệt dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích thước của khuẩn lạc

- Trên môi trường MRS agar

+ Khuẩn lạc A: Được ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc như sau: màu trắng sữa, bóng ướt, bề mặt phẳng, hơi nhô lên, đường kính khuẩn lạc 1,1 mm

Hình 4 1: Hình dạng khuẩn lạc A

+ Khuẩn lạc B: Được ủ 48 giờ ở 50o C đặc điểm khuẩn lạc như sau: tròn, bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, láng bóng, vun tròn và mép khuẩn lạc có bề phẳng và nhẵn bóng, đường kính khuẩn lạc 1,4 mm

Hình 4 2: Hình dạng khuẩn lạc B

+ Khuẩn lạc D: Được ủ 48 giờ ở 37o C đặc điểm khuẩn lạc như sau: tròn, màu trắng sữa, bóng ướt, đường kính khuẩn lạc 0,5 mm

Hình 4 3: Hình dạng khuẩn lạc D - Trên môi trường YGC agar

Khả năng tạo acid làm tan CaCO3 của 3 khuẩn lạc như sau:

Hình 4 4: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc A

Hình 4 5: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc B

Hình 4 6: Khả năng làm tan CaCO3 của khuẩn lạc D

Từ hình 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vòng trong suốt rộng nhất, kế đến khuẩn lạc D, cuối cùng khuẩn lạc B Do khuẩn lạc A, B và D có khả năng chuyển hóa đường thành acid nên phân giải CaCO3 trong môi trường tạo nên vòng trong suốt Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều

4.1.1.2 Môi trường MRS broth

Sau khi nuôi vi khuẩn trên môi trường MRS dịch thể chúng tôi thu được kết quả sau:

Hình 4 7: Khả năng phát triển trong môi trường MRS dịch thể của các khuẩn lạc A, B và D

Từ hình 4.7 chúng tôi thấy:

Khuẩn lạc A: Làm đục môi trường, lắng nhiều sinh khối ở đáy, không tạo váng Khuẩn lạc B: Làm đục môi trường, lắng ít sinh khối ở đáy, không tạo váng Khuẩn lạc D: Làm đục môi trường, lắng rất ít sinh khối ở đáy, không tạo váng Do khuẩn lạc A thích nghi nhanh trên môi trường MRS, phát triển tốt cho nên tạo

sinh khối nhiều hơn khuẩn lạc B và D

+ Khuẩn lạc B: Tế bào hình que, tạo chuỗi dài, Gram dương, không sinh bào tử

Hình 4 9: Nhuộm Gram của khuẩn lạc B, xem ở vật kính x 100

+ Khuẩn lạc D: Tế bào hình cầu, đơn hoặc đôi, Gram dương, không sinh bào tử

Hình 4 10: Nhuộm Gram của khuẩn lạc D, xem ở vật kính x 100

4.2 Chọn giống có khả năng sinh acid lactic

Sau khi tiến hành định tính acid lactic bằng thuốc thử uphenmen chúng tôi thu được kết quả như sau:

Hình 4 11: Khả năng sinh acid lactic, làm đổi màu thuốc thử uphenmen Từ hình 4.11 chúng tôi thấy màu của khuẩn lạc A, B và D giống với màu của acid lactic tinh khiết, khác với màu của môi trường là do cả 3 khuẩn lạc đều có khả năng tạo acid lactic, khi kết hợp với thuốc thử uphenmen thì chuyển từ màu xanh dương đậm sang vàng