11 - Đối với vi khuẩn Acetobacter Schuitzenbachi phát triển tốt ở nhiệt độ lớn nhất 29 0 C. - Đối với vi khuẩn Acetobacter Kutzingianum lại phát triển tốt trong khoảng 35-37 0 C. Nhìn chung khoảng nhiệt độ để các vi khuẩn giấm tồn tại và phát triển tốt khá rộng từ 15-34 0 C. Tuy nhiên cần lưu ý nếu nhiệt độ quá thấp thì tốc độ quá trình lên men sẽ chậm. Ngược lại, khi nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất do bay hơi rượu, acid acetic. Do đó nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất giấm là 30-34 0 C. 1.3.3.3 Nồng độ acid acetic và nồng độ rượu a. Nồng độ acid acetic: Môi trường acid (pH=3) là điều kiện thuận lợi đối với vi khuẩn giấm. Acid acetic tích tụ trong môi trường đến một mức độ nào đó sẽ ức chế hoạt động của chính vi khuẩn. Khi dung dịch tích tụ được 8% acid acetic thì hoạt động của các vi khuẩn trở nên ngày càng giảm dần và ngừng họat động khi lượng acid đạt được 12-14%. b. Nồng độ rượu: Tùy từng loài mà chúng có khả năng tồn tại, thường người ta sử dụng nồng độ rượu từ 6-14%. Nếu trong môi trường không còn rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để tiếp tục thu năng lượng dùng trong sự sống. Vì thế đây là một quá trình có hại. Trong sản xuất người ta thường để lại trong môi trường sau lên men độ rượu 0,3-0,5%. Dires (1973) cho rằng lượng rượu sót trong giấm có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối axetat. 1.3.3.4 Các chất dinh dưỡng: Trong cơ thể vi sinh vật có khoảng 40 hợp chất khoáng khác nhau có thể ở dạng tự do hay liên kết hữu cơ cao phân tử, thông thường tổng hàm lượng khoáng trong vi sinh vật chiếm 5-8% trọng lượng chất khô. Các chất khoáng chia làm 2 loại: 12 Khoáng đa lượng: S, P, K, Na, Fe, Mg, Cu, … Khoáng vi lượng: Cl, Br, I, As, Pb, Zn, Mn, … Do đó, để cho vi khuẩn giấm phát triển tốt, khi sản xuất giấm ngoài các chất: nước, acid, rượu, cần đưa vào môi trường lên men các muối tan có chứa các nguyên tố khoáng cần thiết. Nếu sản xuất giấm từ rượu vang, bia, nước ép trái cây, thì trong dịch lên men đã có đủ các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng không cần bổ sung. Nếu sản xuất giấm từ dịch cồn pha loãng để lên men giấm thì cần bổ sung các nguyên tố khoáng đa lượng cần thiết nhờ các muối vô cơ dễ tan. Ngoài các nguyên tố vi lượng vô cơ, các nguyên tố vi lượng hữu cơ cũng rất cần thiết và quan trọng trong quá trình lên men, tuy sử dụng với nồng độ cực nhỏ cũng có hiệu quả rõ rệt. Thông thường các nguyên tố vi lượng đã có mặt trong những nguyên liệu tự nhiên ban đầu khi đưa vào lên men như dịch trái cây, nước chiết malt, nấm men, dịch thủy phân. Sau đây là một số môi trường để sản xuất giấm, với thành phần các chất dinh dưỡng được xem là có lợi nhất: Môi trường dinh dưỡng cho một lít rượu khan như sau: Glucoza 0,7g Diphotphat amon 1,25g Diphotphat Kali 0,5g Sunphat magic 0,2g Môi trường dinh dưỡng cho một hectolit rượu khan (100l): Glucoza kỹ thuật hay đường tinh bột 500g Sunpho photphat 25g Sunphat amon 25g Cacbonat Kali 0,9g 13 Trong đó: Photphat có vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học. Vì thế photphat cần thiết trong thành phần dung dịch lên men, nó được đưa vào môi trường ở dạng muối vô cơ như photphat Kali hay photphat amon. Nồng độ photphat thường nằm trong khoảng 0,1-0,5%. Nitơ là cấu tạo quan trọng trong thành phần protein và acid nucleic là thành phần rất cần thiết cho sự sống của vi sinh vật. Nitơ được đưa vào môi trường dưới dạng muối vô cơ như nitrat, muối amon, urê,…. Glucoze đóng vai trò như nguồn cung cấp glucid để cung cấp năng lượng bổ sung cho cơ thể vi sinh vật. Ngoài ra, còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào. Theo Enber và Hromatka (1949 – 1953) acid acetic được tạo thành bởi các tế bào sinh sản. Do vậy tác động quan trọng nhất đối với quá trình lên men giấm là thành phần môi trường, nhiệt độ và chế độ thông khí, sự thay đổi chế độ nuôi cấy làm thay đổi các thông số: Tốc độ sinh sản Sinh khối (%) Nồng độ sản phẩm giấm. 1.3.3.5 Các kim loại nặng và các chất gây độc hại Có 5 Kim loại nặng như: Pb, Cu, Fe, Zn, Sn trong dịch lên men sẽ làm giảm hiệu suất lên men, người ta đã thử nghiệm và tìm ra ngưỡng độc hại của 5 kim loại nặng trên tương ứng là 10:15:20:100 và lớn hơn 100ppm. Các chất gây độc hại và ức chế: các chất như tinh dầu lignin, tanin (có trong gỗ)…và một số hợp chất khác có mặt trong môi trường lên men với nồng độ vượt quá ngưỡng giới hạn cho phép đều có tác dụng gây độc hại đến 14 vi sinh vật. Vì thế khi chọn vật liệu chế tạo thiết bị cần lưu ý đến những vấn đề này. Mặt khác, chất lượng nước khoáng: chất lượng nước pha loãng cũng có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men giấm. Yếu tố quan trọng nhất là nước pha loãng có độ sạch sinh học cao (vô trùng) và hàm lượng Clo thấp. Nói chung, nước pha loãng tốt là nước có độ sạch sinh học cao, hàm lượng Clo, các kim loại nặng, các chất rắn thấp, có đủ các nguyên tố vi lượng. 1.3.4 Vật liệu chế tạo thiết bị lên men acid acetic Do acid acetic là một acid có tính ăn mòn kim loại và hợp kim. Tốc độ ăn mòn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ, nhiệt độ, vận tốc chuyển động của acid,… cho nên khi chọn vật liệu chế tạo thiết bị sản xuất phải hết sức thận trọng. Mặt khác, quá trình sản xuất giấm là quá trình có vi sinh vật tham gia nên năm kim loại nặng như: Pb, Cu, Fe, Sn, Zn có tác dụng độc hại đối với vi khuẩn giấm không được dùng làm thiết bị sản xuất giấm bằng phương pháp sinh học nhưng vẫn có thể sử dụng chúng nếu sử dụng những phương pháp khác. Trong hệ thống sản xuất giấm bằng phương pháp sinh học có thể dùng các kim loại đó để chế tạo thiết bị ở những khâu khác như: thùng bảo quản, thiết bị chưng cất,… nhưng các khâu nối với bộ phận lên men thì không được dùng. Vật liệu chế tạo thiết bị để sản xuất giấm bằng phương pháp sinh hóa tốt nhất là thép hợp kim, nhôm, gỗ (những loại gỗ chứa ít tinh dầu tanin,lignin, … và các chất độc hại cho vi khuẩn giấm) và ngày nay thì ngành nhựa phát triển nên có thể sử dụng để chế tạo thiết bị lên men. 1.4 Các phương pháp sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men Yếu tố quan trọng nhất quyết định năng suất và hiệu suất của một phương pháp sản xuất giấm đó chính là bề mặt tiếp xúc giữa oxy của không khí và hợp chất. Từ đó con người không ngừng cải tiến, hoàn thiện các phương pháp cũ, tìm ra các phương pháp mới để sản xuất giấm có hiệu quả và 15 kinh tế hơn. Đến thời điểm hiện tại, đã có 4 phương pháp sản xuất acid bằng cách lên men: - Phương pháp chậm - Phương pháp nhanh - Phương pháp chìm - Phương pháp hỗn hợp 1.4.1 Phương pháp chậm (phương pháp Pháp) Đây là phương pháp thủ công đã có từ lâu đời, quá trình lên men giấm diễn ra ở bề mặt tiếp xúc pha giữa khối dịch lên men và không khí (bề mặt thoáng) trong thùng lên men đặt nằm ngang. Rượu vang được acid hóa bằng acid acetic, dịch sản xuất phải đảm bảo 2% acid acetic và 4% rượu hay 3% acid acetic và 3% rượu. Người ta đóng các thùng lên men bằng gỗ có dung tích khoảng 250 l – 300 l bằng gỗ sồi hình tang trống (giống các thùng sản xuất bia và rượu vang). Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho. Giống vi khuẩn được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse. (theo Nguyễn Đức Lượng, 2002) Hình 1.1 Thiết bị lên men acid aceti theo phương pháp chậm Để tiến hành sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta làm như sau: đổ vào thùng 1/5 thể tích giấm tươi chất lượng cao để acid hóa, sau đó đổ thêm dịch lên men vào cho đến khoảng ½ thể tích thùng. Tiếp theo cứ mỗi 16 chu kỳ đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy. Khi nào nhận thấy rượu đã được oxy hóa gần hết (còn lại 0,3-0,5% rượu) thì lấy giấm ra để đem chế biến và bảo quản, đồng thời cho tiếp dịch lên men vào để lên men tiếp. Khi lên men, vi khuẩn giấm phát triển tạo thành màng vi sinh vật trên bề mặt thoáng, khi bị chấn động (do va chạm hay do quá trình đổ dịch lên men vào và tháo sản phẩm ra) nó sẽ bị phá vỡ, chìm xuống tiêu thụ cơ chất mà không tạo thành acid acetic. Dần dần trên mặt thoáng lại hình thành màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men tiếp tục. Do hạn chế của bề mặt thoáng nên phương pháp này có nhược điểm: - Thời gian lên men dài - Nồng độ acid thấp - Năng suất thấp - Thiết bị cồng kềnh Nhưng bù lại phương pháp này có ưu điểm là giấm thơm ngon, thiết bị đơn giản dễ chế tạo. 1.4.2 Phương pháp nhanh (phương pháp Đức) Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa lỏng và khí lớn nhờ bổ sung vật liệu bám trong thiết bị lên men nên năng suất và hiệu suất cao hơn. Đã khắc phục được nhược điểm của phương pháp lên men chậm do người Pháp thực hiện. Người ta thiết kế những thùng lên men rất lớn, hình trụ, thường có kich thước như sau: Chiều cao thùng 2,5 – 6m. Có dường kính đáy thùng d = 1,2 -3m. Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất. Trong thùng được chất đầy phôi bào hay lõi ngô (bắp). Phôi bào hay lõi ngô được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men. Nhờ đó 17 mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị người ta lắp một hệ thống phân phối không khí đưa từ dưới lên. Môi trường lên men được đưa từ trên xuống. Toàn bộ thiết bị được thiết kế như hình 1.2. Hình 1.2 Thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh Ở phương pháp này, người ta tưới dịch lên men từ trên xuống qua hệ thống phân phối lỏng như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi trường sẽ được phân phối đều và chảy chậm qua thùng lên men (gọi là generator) bên trong có đổ đầy vật liệu bám có màng vi khuẩn ở trên bề mặt, cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn. Cùng lúc đó, không khí đi ngược chiều từ dưới lên trên và oxyl thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn, dịch lên men được chuyển hóa nhanh nhờ vi khuẩn. Nếu generator đủ cao, điều kiện vận hành được khống chế tốt thì chỉ cần cho dịch lên men qua tháp một lần là có thể thu được giấm đặc ở đáy. Tuy nhiên, vì thổi khí từ dưới lên nên xảy ra quá trình làm mất rượu etylic và acid acetic trong quá trình lên men. Ưu điểm của phương pháp: - Thời gian lên men ngắn - Thiết bị tương đối đơn giản, năng suất cao, ổn định 18 - Giấm thu được có nồng độ cao (có thể đến 10 – 11%) Nhược điểm của phương pháp: - Hiệu suất không cao do mất mát rượu và axit - Dùng vật liệu bám phải phù hợp 1.4.3 Phương pháp chìm (phương pháp sục khí): Cho không khí sục qua khối dịch lên men mãnh liệt sẽ tạo thành một thể huyền phù có pha rắn là các vi khuẩn giấm, pha lỏng là dịch lên men trong các thiết bị lên men có tên là acetator, dịch rượu được chuyển hóa thành giấm rất nhanh. Hình 1.3 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chìm Phương pháp này có hiệu suất cao, tối thiểu là 91 – 92%, nếu khống chế tốt ở điều kiện vận hành có thể đạt 98 – 99%. Nó được ra đời từ những kết quả của phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất thuốc kháng sinh, sản xuất men bánh mì. Tuy có được ưu điểm lớn nhưng mãi đến gần đây, phương pháp này mới được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, nguyên nhân là do nhu cầu phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao và quan trọng là yêu cầu nghiêm ngặt về việc cấp oxy liên tục. 19 1.4.4 Phương pháp hỗn hợp (phương pháp lai): Đây là phương pháp lai giữa hai phương pháp nhanh và chìm. Hệ thống lên men để sản xuất được thiết kế như sau: Hình 1.4 Thiết bị lên men acid theo phương pháp tổ hợp Phần trên như generator có đổ đầy đệm, hoạt động theo nguyên tắc lên men nhanh. Ở giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống. Phần cuối cùng là hệ thống thổi khí mạnh tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như một acetator của phương pháp chìm. Phương pháp kết hợp này có rất nhiều ưu điểm, trong đó ưu điểm nhất là hiệu suất lên men rất cao, nồng độ acid acetic thu được thường nằm trong khoảng 10 – 12%. Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp nhanh và chìm, nhưng thiết bị yêu cầu quá phức tạp, cồng kềnh, giống vi khuẩn phải phù hợp với cả hai phương pháp. 20 1.5 Chọn chủng vi khuẩn acid acetic: Hiện nay người ta đã tìm ra hơn 20 loài vi khuẩn acid acetic. Gọi chung là Acetobacter là trực khuẩn khá lớn thuộc loài hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp là 30 – 40 0 C. Trong tự nhiên chúng phân bố rất rộng rãi trong không khí và rau quả, nhiều trường hợp có thể phát triển đồng thời cùng với nấm men trên cơ chất thực vật có nhiều đường. Vi khuẩn acetic thuộc loại giống Acetobacter (chu mao) và Acetomonas (tiêm mao ở một đầu). Nhiều loài khi phát triển lâu trên môi trường dễ dàng sinh ra những dạng có hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài, có thể phân nhánh) Việc nghiên cứu vi khuẩn do Pasteur thực hiện từ năm 1862 khi ông dùng kính hiển vi quan sát màng mỏng xuất hiện trên rượu vang chua. Một số chủng Acetobacter điển hình: Acetobacter aceti: là trực khuẩn ngắn, xếp thành chuỗi, không di động nhuộm màu vàng với dung dịch iot, có khả năng phát triển ở nồng độ rượu khá cao 11% và có khả năng tích lũy được khoảng 6% acid acetic. Nhiệt độ thích hợp nhất ở 34%. Acetobacter pasteurianum: tế bào hình que, có khi xếp liên tiếp thành hình sợi dài, tạo thành lớp váng khô nhăn nheo, nhuộm màu xanh với Iod. Có thể tạo được 6,2% acid acetic. Acetobacter orleaneuse: tế bào hình que nhỏ, đôi khi dị dạng (nhiệt độ cao), không di động, trên cơ chất tạo váng dày trong, có khả năng phát triển ở nồng độ rượu khá cao 10 – 12% và có khả năng tích lũy 9,5% acid acetic. Acetobacter xylinum: tế bào hình que, không di động, tạo thành váng dày trên cơ chất, nhuộm bằng Iod và acid sunfuric sẽ có màu xanh, có khả năng tạo được 4,5% acid acetic. Acetobacter Shuitzenbachii: trực khuẩn dài, khi già mới tạo thành váng dày không bền, có khả năng tích lũy 11,5% acid acetic. . Phương pháp hỗn hợp (phương pháp lai ): Đây là phương pháp lai giữa hai phương pháp nhanh và chìm. Hệ thống lên men để sản xuất được thiết kế như sau: Hình 1.4 Thiết bị lên men acid theo. các phương pháp cũ, tìm ra các phương pháp mới để sản xuất giấm có hiệu quả và 15 kinh tế hơn. Đến thời điểm hiện tại, đã có 4 phương pháp sản xuất acid bằng cách lên men: - Phương pháp. chế tạo thiết bị lên men. 1.4 Các phương pháp sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men Yếu tố quan trọng nhất quyết định năng suất và hiệu suất của một phương pháp sản xuất giấm đó chính