Laccaza từ nấm vân chi có thể phân huỷ một phần hợp chất clo của CPC, có thể declo hoá nhiều hợp chất clophenol do đó được dùng trong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng
Trang 12.2.6 Quy trình nuôi trồng nấm [3],[12],[13]
2.2.6.1 Chọn dòng và giữ giống
Gọt sạch chất bẩn bám ở chân Rửa dung dịch
chlorine 1%
Rửa nước vô trùng
3 lần Đặt lên giấy
Lau cồn Tách đôi Tách thịt ấ
Tai nấm
Ngâm nước vô trùng 4 giờ
Cấy truyền lên môi trường thạch nghiêng hoặc thạch đĩa Petri
Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng Kiểm tra tạp nhiễm Giống gốc
Giữ giống Nhân giống cho sản xuất
Giá thể có hệ sợi
Sơ đồ 2.2: Quy trình phân lập tổng quát
Có nhiều cách để phân lập nấm để tạo giống gốc nhưng hiệu quả nhất là phân lập
từ quả thể Vì đây là phương pháp nhân giống vô tính Trong khi tách hệ sợi nấm thì
không rõ có đúng là nấm cần phân lập hay nấm mốc hoặc nấm dại khác Còn dùng bào
tử nấm cũng không đơn giản vì đây là giai đoạn sinh sản hữu tính, nên nấm hình thành
có thể thay đổi đặc tính Ngoài ra, phương pháp phân lập từ quả thể hạn chế được hiện
tượng bị lẫn hay nhiễm tạp các loại vi sinh vật khác vì sử dụng trực tiếp các mô thịt
nấm Nguyên tắc của phương pháp này là chọn tai nấm điển hình và ở giai đoạn trưởng
thành, để dễ đánh giá chất lượng giống Mô thịt nấm tách ở những vị trí kín đáo, ít tiếp
xúc với các nguồn bệnh nhất
Môi trường phân lập thường là môi trường dinh dưỡng bao gồm ba thành phần cơ
bản
9 Đường: glucose hay saccharose với liều lượng 2 – 3 %
9 Thạch: 2%
Trang 29 Chất bổ sung: nước chiết (lấy từ các nguồn tự nhiên như khoai tây, nước giá, carot…) và hóa chất (chủ yếu gồm các khoáng N, P, K, Mg…)
Khi có được giống thuần, cấy sợi nấm từ môi trường phân lập vào ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng để giữ giống Môi trường giữ giống có thể giống môi trường phân lập Khi giữ giống, bảo quản ống nghiệm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 –
10oC và mỗi tháng cấy lại một lần Ở các cơ quan giữ giống cấp nhà nước các giống nấm phải được giữ trong nitơ lỏng (-195oC) hoặc dùng phương pháp đông khô hay các phương pháp khác để bảo quản lâu dài và giữ ổn định được hoạt chất từng giống
2.2.6.2 Quy trình nhân giống cấp một và cấp hai
Giống cấp một: là các ống thạch nghiêng được cấy từ các ống nấm đã phân lập, thuần khiết và được cấy truyền sang nhiều ống để làm giàu lượng giống thuần
Giống cấp hai: là giống được cấy hệ sợi từ môi trường cấp một vào trong các chai thuỷ tinh hay các túi chất dẻo có miệng là ống nhựa có nút bằng nút bông mỡ Giống cấp hai có thể chế tạo bằng nhiều công thức khác nhau Tất cả đều là môi trường xốp với nguyên liệu chính là ngũ cốc, cám, mùn cưa và có thể bổ sung một số chất dinh dưỡng khác Bảo quản giống cấp hai được thực hiện ở nhiệt độ phòng (29 ± 2oC)
2.2.6.3 Quy trình nuôi trồng ra quả thể
Giá thể nuôi trồng nấm rất đa dạng: mùn cưa, gỗ khúc hay các nguồn phế phẩm nông nghiệp như cùi bắp, bã mía, rơm rạ…
Trang 3Mùn cưa bổ sung
dinh dưỡng
Phối trộn
Ẩm độ: 62 – 65% Chai nhựa (thủy
tinh), bao PP,PE
Phân lập
Giống gốc
MT thạch Khử trùng
Túi phôi, chai
phôi
Nhân giống Giống sản xuất
MT hạt
Cưa khúc
Gỗ khúc
Cấy giống
Cấy giống
Ủ tối 21 – 26oC Pha sợi hoàn chỉnh
Phòng tưới Nhiệt độ: 15 – 24oC
Độ ẩm: 85 – 95%
Ánh sáng: 100 – 25 lux
Hệ sợi lan kín
giá thể
Quả thể
Hệ sợi lan kín giá thể
Quả thể
Thu hoạch chế biến
Bảo quản
Thu hoạch chế biến
Bảo quản
Cây gỗ mềm Quả thể nấm
Sơ đồ 2.3: Quy trình nuôi trồng nấm
a Quy trình nuôi trồng trên gỗ khúc
Cây gỗ chặt hạ, bỏ cành, cưa thành khúc 80 – 120 cm, mặt cắt quét vôi, chất đóng
ủ khoảng 1 tháng Sau đó tiến hành các bước sau:
9 Cấy giống
Giống sản xuất là giống hỗn hợp mùn cưa, cám, bột bánh dầu, hạt ngũ cốc… Dùng búa hoặc khoan đột những hàng lỗ so le, đường kính 1 – 1,5 cm dọc theo khúc gỗ, cách nhau 5 cm, sâu 3 – 5 cm
Trang 4Gieo meo giống cho đầy lỗ cấy, sau đó đậy lại bằng chính miếng gỗ đục từ lõi ra Dán giấy parafin hoặc nhỏ sáp lên bao bọc kín lỗ cấy
Thao tác đột lỗ cấy và gieo meo giống nên làm kế tiếp nhau và nhanh để tránh nhiễm tạp
9 Nuôi ủ gỗ
Sau khi gieo meo giống, gỗ được ủ ở điều kiện: độ ẩm 75 – 85 %, nhiệt độ khoảng 25 – 30oC
Sau 15 – 20 ngày, kiểm tra sự lan tỏa của sợi nấm và chuyển sang ủ trong đất với cát Tưới phun giữ ẩm trong khoảng 30 ngày
9 Vùi đất
Chỉ có linh chi mới vùi đất, còn vân chi và một số nấm khác người ta đem vào nhà tưới tiếp tục tưới phun cho đến khi xuất hiện quả thể
Các khúc gỗ được cưa thành đoạn 15 – 20 cm (có thể kiểm tra thấy hệ sợi nấm lan trắng mặt gỗ) Vùi cắm các khúc gỗ xuống nền đất đã làm kỹ và khử trùng diệt mối mọt, sâu bọ,… Bên trên làm thành mái vòm che mưa nắng và ánh sáng trực xạ
Người ta thường vùi các khúc gỗ để nhô lên cỡ 5 – 7 cm
Tưới phun sương giữ ẩm độ không khí 80 – 95% và thông thoáng Sau 15 – 20 ngày sẽ có sự xuất hiện mầm quả thể, tiếp tục tưới phun và chăm sóc cẩn thận vì giai đoạn này nấm rất hay bị sâu
b Quy trình nuôi trồng trên giá thể tổng hợp
9 Phối trộn cơ chất
Tận dụng các loại phế liệu nông nghiệp (cùi bắp, rơm rạ, mùn cưa… đã được xay nhuyễn) Tỉ lệ mùn cưa khô nên đạt 30 – 60%, phần còn lại dùng rơm rạ băm nhỏ, trấu, bã trà khô, vỏ hạt bông, vỏ quả đậu phộng, cành thân cây nhỏ… Xử lý hỗn hợp
cơ chất này với nước vôi 1,5%
Nguồn dinh dưỡng bổ sung quan trọng là các loại cám ngũ cốc, tỉ lệ nên phối trộn khoảng 15 – 20% Nên cho thêm (NH4)2SO4 (0,5%), superphosphate (1 – 1,5%) và MgSO4.7H2O (0,05%) Độ ẩm sau cùng đạt 65 – 70%
Trang 59 Khử trùng giá thể
Sau khi đã nhồi cơ chất tổng hợp vào túi PP hay chai PP với lượng khoảng 0,5 – 1,5 kg, tiến hành hấp khử trùng giá thể
Khử trùng kỹ: 2 giờ trong nồi autoclave hoặc bằng hơi nước nóng ở 121oC/2 – 4 giờ Sau đó lấy ra để nguội
9 Cấy giống
Cấy giống vào giữa khối cơ chất (khoảng 3 – 5% khối lượng giống so với cơ chất) Nuôi ủ trong buồng tối, ở 25 – 30oC, sau 25 – 35 ngày hệ sợi sẽ lan hầu khắp giá thể
9 Tưới đón nấm
Hệ sợi bắt đầu bện kết sau 25 – 30 ngày Tại thời điểm này, cần chuyển túi (chai) vào nhà trồng có ánh sáng khuếch tán nhẹ, nhiệt độ hạ thấp 21oC ± 3oC Có thể vùi đất, treo, xếp trên giàn kệ, mở nút túi cho mầm nấm vươn ra dễ dàng Duy trì độ ẩm phòng nuôi cấy ở 80 – 90% Thông thoáng phòng nuôi cho quả thể lớn
Tuỳ theo loài nấm mà thời gian thu hoạch thay đổi từ 35 – 45 ngày đến vài tháng Sau cùng sẽ tiến hành thu hoạch quả thể và chế biến bảo quản
2.2.6.4 Quy trình nuôi trồng thu sinh khối
Ngoài công nghệ nuôi trồng trên giá thể tổng hợp hay trên gỗ khúc, người ta còn tiến hành thu sinh khối nấm trong các nồi lên men Hiện nay nhiều xí nghiệp dược phẩm đã sản xuất sinh khối nấm vân chi theo phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men với các thông số kỹ thuật sau:
9 Môi trường sử dụng: bột khô dầu đậu tương (1%), glucose (3%), bột nấm men khô (0,2%), (NH4)2SO4 (0,25%), MgSO4 (0,05%), KH2PO4 (0,1%), dầu đậu tương để khử bọt (0,2%)
9 Lượng môi trường trong nồi lên men: 60 – 70%
9 pH trước khử trùng: 6,0
9 Lượng cấy giống vào: 0,5%
9 Áp suất nồi lên men: 0,5 kg/cm2
9 Nhiệt độ nuôi cấy: 26 – 28oC
9 Tốc độ khuấy: 180 rpm
9 Chế độ thổi khí vô trùng: 1:0,3 – 1:0,5 (V/V.min)
Trang 69 Thời gian lên men: khoảng 48 giờ
2.2.7 Giá trị dược tính của nấm vân chi [3], [19],[25], [27]
Đã có hơn 400 khảo cứu về thành phần hoá học, dược lý lâm sàng nấm vân chi công bố khắp thế giới Trong cuốn “Dược vật học” đời nhà Minh (Trung Quốc) ghi lại rằng: “Nấm vân chi đen và lục bồi bổ khí huyết, tăng năng lượng cuộc sống, và nó còn
có tác dụng làm vững gân cốt Nếu dùng vân chi trong một thời gian dài sẽ làm cho con người cảm thấy khoẻ mạnh, yêu đời, sôi nổi và sống lâu hơn” Vân chi được dùng dưới dạng trà có tác dụng hạ thấp lượng cholesterrol máu, áp suất máu, chống chứng rối loại nhịp tim, điều khiển nồng độ đường trong máu
Ở châu Á, nấm được dùng chung với các thành phần thảo mộc khác để chữa trị ung thư Các báo cáo từ những năm 1960 đã cho thấy lợi ích về sức khỏe trong điều trị
ung thư dạ dày khi uống trà “Saruno-koshikake” có chứa nấm vân chi Trametes
versicolor Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm này có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus
và kháng khối u Ngày nay, vân chi được sử dụng như một loại dược liệu trong hỗ trợ điều trị ung thư Ở Nhật, năm 1987, PSK-chất trích từ vân chi chiếm ¼ thị phần dược phẩm trị ung thư (Fukushima, 1989) Ở Trung Quốc, vân chi được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư và cũng được dùng để trị bệnh viêm gan mãn tính, viêm nhiễm đường hô hấp, viêm cơ quan bài tiết và cơ quan tiêu hoá Ngoài ra trong các bài thuốc
cổ truyền của Trung Quốc, vân chi được dùng để tăng cường hiệu quả cho hệ miễn dịch, loại bỏ độc tố cơ thể, giảm đờm, tăng năng lượng và làm tinh thần sảng khoái, kéo dài tuổi thọ, hạ nhiệt do vân chi có tính hàn, vị ngọt
Trong điều trị ung thư, khi sử dụng kết hợp PSP, PSK (hợp chất trích từ nấm) với hoá trị hay xạ trị sẽ làm tăng tỉ lệ sống còn của bệnh nhân ung thư và làm giảm các triệu chứng do hoá trị hay xạ trị gây ra Các hợp chất trích từ vân chi rất an toàn khi sử dụng, không có phản ứng phụ, không độc Chỉ tìm thấy một biểu hiện nhỏ khi sử dụng PSK là nó làm đen các đầu ngón tay ở một số rất ít bệnh nhân chịu tác dụng điều trị (khoảng 4/77 người mắc phải)
Một số biệt dược của nấm vân chi: Vân chi, Lục bảo Vân chi, (PSK) VPS – Coriolus versicolor, Coriolus-VPS® , PSK® , Yunzhi Polysaccharide peptide (Trade mark Qing Kang), PSP polysaccharide-peptide (Landford)
Trang 72.2.8 Các giá trị khác của vân chi [18]
Nấm vân chi sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, mangan peroxidaze
(MnP), lignin peroxidaze (LnP) Các enzyme này đang được nghiên cứu ứng dụng
trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose Laccaza từ nấm vân chi có thể phân huỷ một
phần hợp chất clo của CPC, có thể declo hoá nhiều hợp chất clophenol do đó được
dùng trong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng
2.2.9 Thành phần hoá học sơ bộ nấm vân chi [20]
Bảng 2.1: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật
Acid hữu cơ +
Triterpenoid tư do +
Coumarin +
Flavonoid - -
Tinh dầu -
Polyphenol +
Ghi chú: +: dương tính; -: âm tính
Trong thành phần nấm vân chi có acid hữu cơ, alcaloid, chất khử, triterpenoid,
coumarin, saponin, tanin, polyphenol, hợp chất uronic, acid amin và polysaccharide
Trong đó polysaccharide là thành phần dược tính được quan tâm, nghiên cứu nhiều
nhất
Trang 82.3 Một số khái niệm sinh hoá
2.3.1 Khái niệm về polysaccharide [10],[15]
Các glucid thuộc nhóm polysaccharide là các hợp chất cao phân tử khác nhau bởi thành phần monosaccharide, độ dài của chuỗi và mức độ phân nhánh Trong phân tử polysaccharide, các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết glycosid, vì vậy các polysaccharide rất dễ bị thủy phân thành các loại đường đơn Công thức tổng quát
là (C6H10O5)n Tuỳ theo thành phần của monosaccharide mà polysaccharide được chia làm 2 nhóm: polysaccharide đồng thể (homopolysaccharide) và polysaccharide dị thể (heteropolysaccharide)
2.3.1.1 Polysaccharide đồng thể là các polymer cấu tạo bởi nhiều
monosaccharide giống nhau gồm có:
- Tinh bột: Là sản phẩm quang hợp của thực vật, là chất dự trữ quan trọng tích lũy trong củ, quả, hạt và là hợp chất hữu cơ được tạo thành bởi nhiều phân tử glucose liên kết với nhau theo liên kết glycosidic 1-4 gồm có 2 dạng:
• Amylose: tan trong nước, cho phản ứng màu xanh với iod, mạch thẳng, là chuỗi không phân nhánh của gốc α-D-glucopyranose gắn nhau bởi liên kết glycosidic 1-4
• Amylopectin: cho phản ứng màu tím đỏ với iod, có cấu trúc phân nhánh được cấu tạo bởi nhiều phân tử glucose nối với nhau bởi liên kết glycosidic 1-4 và 1-6
- Glycogen: có nhiều mạch phân nhánh, TLPT 400 000 – 4 000 000 gồm khoảng 2 400 – 24 000 gốc glucose
- Cellulose: là thành phần chủ yếu của vách tế bào, thường liên kết với các chất khác như lignin, hemicellulose, pectin, không tan trong nước, tan trong dung dịch amoniac của hydroxyd đồng Cellulose là chuỗi dài không phân nhánh với số gốc glucose từ hàng nghìn đến hàng chục triệu, các gốc này liên kết nhau bằng liên kết β-glycosidic 1-4
- Chitin: có cấu trúc gần giống với cellulose, chúng được thành lập từ các dẫn xuất của glucose là N-acetyl glucosamine, chúng nối với nhau bằng liên kết glycosidic 1-4 Chitin có nhiều trong nấm men và ở động vật không xương sống
Trang 92.3.1.2 Polysaccharide dị thể: là những polymer được cấu tạo bởi nhiều monosaccharide khác nhau
- Hemicellulose: là polysaccharide có nhiều trong rơm, rạ, gỗ… chúng không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm, trong thành phần cấu tạo thường gặp glucose, fructose, mannose, arabinose, xilose và galactose
- Peptidoglycan: là những polysaccharide mạch thẳng cấu tạo nên thành tế bào vi khuẩn, gồm các chuỗi disaccharide lập lại
- Glucosaminoglycan: là thành phần của matrix ngoài tế bào, là những glucid phức tạp đặc trưng bởi các chuỗi disacharide lập lại gồm có đường amin và acid uronic Các glucosaminoglycan quan trọng:
9 Acid hyaluronic: cấu tạo bởi chuỗi disaccharide lập lại bao gồm acid D-glucoronic và N-acetylglucosamin Nó có TLPT trên 1 triệu, tạo thành dung dịch trong nhớt có tác dụng làm trơn hoạt dịch của các khớp và thủy tinh dịch của mắt, giúp cho sự vận động và ngăn chặn sự xâm nhập của nhiều chất độc đối với cơ thể Acid hyaluronic còn là thành phần chính của matrix ngoài tế bào, của sụn và gân làm tăng tính co giãn của các tổ chức này Enzyme hyaluronidase xúc tác sự thuỷ phân liên kết glucosid của hyaluronat và có hoạt tính mạnh trong tinh dịch, nọc rắn và một số vi khuẩn
9 Condrotin sulfat: là một glucosaminoglycan gồm acid glucuronic và N-acetyl galacyosamin sulfat Nó có nhiều trong tố chức sụn, tổ chức liên kết (gân, da, van tim và thành động mạch)
9 Heparin: là glucosaminoglycan gồm acid iduronic và glucosamin gắn sulfat Nó ngăn chặn chuyển hoá prothrombin thành thrombin do đó có tác dụng chống đông máu, còn giải phóng lipoproteinase từ tổ chức vào huyết tương Enzyme này xúc tác sự phân hủy các phức hợp lipoprotein trong quá trình vận chuyển và chuyển hoá lipid
- Proteoglycan: (thành phần matrix ngoài tế bào) là polysaccharide tạp gồm một chuỗi hyaluronat rất dài liên kết không cộng trị với nhiều phân tử protein lõi Mỗi phân tử lõi lại gắn liên kết không cộng trị với nhiều phân tử glycosaminoglycan ngắn hơn (condroitin sulfat, keratan sulfat, heparin sulfat) bằng các cầu glycosid nối các gốc đường với nhóm OH của serin hoặc threonin trong phân tử protein (liên kết
Trang 10O-glycosid) Các proteoglycan đóng vai trò cấu tạo đối với cơ thể (tạo tính co giãn, tính nhớt, độ trơn tại các khớp, tổ chức liên kết, mô nâng đỡ và các dịch che phủ các cơ quan)
- Glycoprotein và glycolipid: màng tế bào động vật chứa khoảng 5% glycid dưới dạng glycoprotein và glycolipid Đó là những hợp chất có cấu trúc mạch thẳng có từ 1 đến
15 gốc đường trong đó nhiều protein và một số lipid của màng tế bào gắn với các olygosaccharide bằng liên kết cộng hoá trị
2.3.2 Amino acid [10],[20]
Là đơn vị cấu tạo của protein, là dẫn xuất từ acid carboxylic trong đó có một hoặc hai nguyên tử hydrogen của gốc ankyl được thay thế bởi nhóm amine (NH2) ở vị trí carbon alpha so với nhóm carboxyl (COOH) nên gọi là α-amino acid
H - CαH – COOH
R
+ NH2 H2N - CαH – COOH
R
Acid amin có các tính chất sau:
• Tính hoạt quang: đó là khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng
• Tính lưỡng tính: acid amin thể hiện đồng thời cả tính acid và tính base Tùy điều kiện môi trường acid amin có thể tồn tại dưới dạng cation, anion hoặc muối nội trung hoà điện (ion lưỡng cực)
Phản ứng tạo màu của acid amin với thuốc thử ninhydrin và các chất khác được dùng làm phản ứng phát hiện trong các phương pháp phân tích acid amin
Trong nấm vân chi có các acid amin chủ yếu như: glutamic, aspartic và một số acid amin dạng trung hoà
2.3.3 Chuỗi liên kết β-D-glucan [27] [32]
Các proteoglycan trích từ nấm vân chi chủ yếu là liên kết D-glucan Cấu trúc β-D-glucan là một cấu trúc lập lại, gồm nhiều phân tử D-glucose nối với nhau bằng các nối β tạo dạng mạch thẳng Các nối β được tạo từ vị trí C1 của vòng saccharide đứng trước với vị trí C3 của vòng kế tiếp (β1-3), từ C1 đến C4 (β1-4), hoặc từ C1 đến C6
