Luận văn : KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN CHI ĐEN TRAMETES VERSICOLOR L.:Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC part 3 pps

2 - 5 -2.36667 2.89126 2 - 6 -2.89667 2.89126 * 2 - 7 -1.31000 2.89126 2 - 8 -10.1033 2.89126 * 2 - 9 -3.40333 2.89126 * 2 - 10 0.49333 2.89126 3 - 4 0.70000 2.89126 3 - 5 -1.64000 2.89126 3 - 6 -2.17000 2.89126 3 - 7 -0.58333 2.89126 3 - 8 -9.37667 2.89126 * 3 - 9 -2.67667 2.89126 3 - 10 1.22000 2.89126 4 - 5 -2.34000 2.89126 4 - 6 -2.87000 2.89126 4 - 7 -1.28333 2.89126 4 - 8 -10.0767 2.89126 * 4 - 9 -3.37667 2.89126 * 4 - 10 0.52000 2.89126 5 - 6 -0.53000 2.89126 5 - 7 1.05667 2.89126 5 - 8 -7.73667 2.89126 * 5 - 9 -1.03667 2.89126 5 - 10 2.86000 2.89126 6 - 7 1.58667 2.89126 6 - 8 -7.20667 2.89126 * 6 - 9 -0.50667 2.89126 6 - 10 3.39000 2.89126 * 7 - 8 -8.79333 2.89126 * 7 - 9 -2.09333 2.89126 7 - 10 1.80333 2.89126 8 - 9 6.70000 2.89126 * 8 - 10 10.5967 2.89126 * 9 - 10 3.89667 2.89126 * * denotes a statistically significant difference.  One-Way Analysis of Variance Data: TLQTTO.ketqua Level codes: TLQTTO.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level Between groups 17.957400 1 17.957400 24.025 .0080 Within groups 2.989733 4 .747433 Total (corrected) 20.947133 5 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for TLQTTO.ketqua by TLQTTO.nt Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean to 3 11.156667 .2539247 .4991437 10.176379 12.136955 qt 3 7.696667 .6586434 .4991437 6.716379 8.676955 Total 6 9.426667 .3529479 .3529479 8.733498 10.119835 Multiple range analysis for TLQTTO.ketqua by TLQTTO.nt Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups qt 3 7.696667 X to 3 11.156667 X contrast difference limits to - qt 3.46000 1.96058 * * denotes a statistically significant difference. PHỤ LỤC 5: Thành phần các vitamin và acid amin có trong nước dừa Bảng 7.1: Hàm lượng các vitamin có trong nước dừa Vitamin Hàm lượng (μg/ml) Khoáng vi lượng Hàm lượng (μg/100ml) Acid ascorbic Acid nicotinic Acid pantothenic Acid folic Biotin Riboflavin Thiamine Pyridoxine 2200 – 3700 0,64 0,52 0,003 0,02 0,01 dạng vết (trace) dạng vết (trace) K Na Ca Mg Fe Cu S P 3,12 1,50 2,09 3,00 0,01 0,04 3,40 3,70 Bảng 7.2: Hàm lượng acid amin có trong nước dừa Acidamin % khối lượng Acidamin % khối lượng Acid cysteric Acid aspartic Acid glutamic Xerin Glycerin Threonin Alanin 3,86 2,94 12,47 3,25 7,61 1,07 1,41 Histidin Lysin Arginin Prolin Valin Leucin Phenylalanin 7,86 11,23 31,4 8,57 1,28 3,85 0,18 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Những năm gần đây, ngoài giá trị dinh dưỡng đã được biết đến từ rất lâu, nấm còn được đề cập đến như một nguồn dược liệu quý giá có khả năng chữa trị được nhiều bệnh như nấm linh chi (Ganoderma lucidium), nấm hầu thủ (Hericium enrinaceum)… Khoa học phát triển, dược tính của nấm ngày càng được phát hiện nhiều. Nó có khả năng chữa trị các bệnh về tim mạch, ung thư, nâng cao sức đề kháng của cơ thể… Trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam rất thích hợp cho việc nuôi trồng các loại nấm, vừa tận dụng những thuận lợi có sẵn vừa tạo ra nguồn nguyên liệu phục vụ cho nhu cầu chữa bệnh trong nước. Do đó việc tìm ra phương pháp cũng như môi trường nuôi trồng thích hợp đối với từng loại nấm để đạt được hoạt tính nhiều nhất là điều cần thiết. Người ta biết đến hiệu quả chữa bệnh của nấm vân chi thông qua hai hợp chất chính trích từ nấm này là PSP (polysaccharide peptide) và PSK (polysaccharide Kureha). Các chất này được coi là có khả năng chữa trị ung thư, tăng miễn dịch cơ thể, chống các phản ứng phụ của xạ trị và hoá trị, ức chế sự nhân lên của HIV… Nhưng hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về vân chi và ngành trồng nấm vân chi lại chưa phát triển. Trong khi đó ở Nhật và các nước khác đã có rất nhiều sản phẩm thương mại từ vân chi. Các biệt dược bào chế từ nấm vân chi Trametes versicolor đứng đầu trong 10 loại thuốc chống ung thư được tiêu thụ mạnh nhất tại thị trường Nhật Bản, với doanh số năm 1991 đạt tới 358 triệu USD, vượt xa cả Tamoxifen, interferon, cis-Blastin. Những sản phẩm thương mại từ PSP và PSK chiếm 25% thị phần ở thị trường Nhật (1991). Với mong muốn phát triển hơn nữa khả năng nuôi trồng và ứng dụng nấm vân chi trong ngành dược phẩm, chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc. 2 1.2. Mục đích đề tài 9 Khảo sát môi trường nhân giống cấp một, cấp hai thích hợp cho hệ sợi nấm tăng trưởng tốt. 9 Khảo sát sự tăng sinh khối nấm trong môi trường lỏng trên các môi trường với thành phần dinh dưỡng khác nhau, thu lấy sinh khối và ly trích, định lượng hợp chất chính trong sợi nấm. 9 Khảo sát môi trường nuôi trồng quả thể và quan sát khả năng ra quả thể của nấm vân chi trong điều kiện TpHCM. 1.3. Yêu cầu 9 Tìm ra môi trường nhân giống cấp một, nhân giống cấp hai thích hợp nhất đối với sự phát triển của hệ sợi nấm vân chi. 9 Tìm ra môi trường có sinh khối phát triển mạnh nhất, kinh tế nhất và có hàm lượng dược chất nhiều nhất. 9 Xác định điều kiện, môi trường nuôi trồng quả thể thích hợp. 1.4. Hạn chế đề tài 9 Do giới hạn về trang thiết bị, hoá chất nên không xác định được hết các thành phần dược chất có trong nấm cũng như không tinh khiết được hợp chất trích mà chỉ dừng lại ở mức định lượng hợp chất thô trích từ nấm. 9 Trong quá trình nuôi trồng, chỉ thu được một số quả thể, chưa đủ để đánh giá năng suất của nấm vân chi trên các nghiệm thức nuôi trồng ra quả thể. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về nấm trồng 2.1.1. Giới thiệu sơ lược [2],[8],[17], [18], [30] Tất cả sinh vật sống đều thuộc một trong năm giới. Nấm thuộc một giới riêng gọi là giới nấm (theo hệ thống phân loại của R.H. Whitaker, 1969). Nấm bao gồm cả nấm mốc, nấm men và các loài nấm lớn có quả thể. Nấm không quang hợp được. Do đó nó bắt buộc phải sống trên những chất hữu cơ hoại mục hoặc sống nhờ các động thực vật khác. Nấm là sinh vật hoại sinh, phân huỷ các chất hữu cơ để lấy chất dinh dưỡng. Nấm dinh dưỡng bằng cách tiến hành sự hấp thụ thức ăn trên toàn bộ bề mặt của sợi nấm thông qua phương thức thẩm thấu. Trong trường hợp nấm dinh dưỡng bằng những chất hữu cơ cần thiết đã có sẵn gọi là dị dưỡng (heterotrophe); bằng những chất hữu cơ chết gọi là hoại sinh (saprophyte). Nấm sử dụng các mô sống để dinh dưỡng gọi là ký sinh (parasite). Trong tự nhiên, nấm đóng một vai trò quan trọng, là máy tái chế sơ cấp. Chúng tạo ra các enzyme để phân huỷ vật chất hữu cơ (thường là các cấu tử gỗ). Phần lớn nấm có khả năng sản sinh ra các enzyme phá huỷ nguyên liệu thực vật thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes) và nấm đảm (Basidiomycetes). Nấm cư trú trên gỗ đã chết chủ yếu phân hủy một hoặc nhiều cấu tử gỗ, gây mục mạnh. Hiện nay khoá phân loại nấm hiện đại bao gồm các ngành và ngành phụ như sau: • Ngành nấm nhày (Myxomycota) • Ngành nấm thật (Eumycota) 9 Ngành phụ Nấm tiên mao (Mastigomycotina) 9 Ngành phụ Nấm tiếp hợp (Zygomycotina) 9 Ngành phụ Nấm túi (Ascomycotina) 9 Ngành phụ Nấm đảm (Basidiomycotina) 9 Ngành phụ Nấm bất toàn (Deuteromycotina) 4 2.1.2. Giá trị của nấm [27],[29],[30],[33] Nấm từ rất lâu đã được biết đến như là một nguồn thức ăn dinh dưỡng giàu đạm, chất xơ, vitamin và tất cả những chất cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển, và sự sống của một người khoẻ mạnh. Từ hàng ngàn năm qua, ở châu Á, cả nấm ăn được và nấm không ăn được đều được sử dụng vì mục đích dinh dưỡng, bồi bổ khí huyết hoặc làm thuốc. Người ta dùng tất cả các bộ phận của nấm. Ngoài giá trị dinh dưỡng, nấm còn có khả năng phòng và trị một số bệnh. Càng ngày người ta càng phát hiện ra nhiều dược chất có tính miễn dịch từ nấm. Quá trình tìm kiếm dược phẩm miễn dịch đã diễn ra ở châu Á (nhất là các nước Trung Quốc, Nhật Bản) từ rất lâu nhưng ở Phương Tây còn chưa chú trọng lắm. Dược phẩm miễn dịch có thể được xem như là chất có hiệu quả trong liệu pháp miễn dịch khi uống vào. Có hơn 50 loài nấm được xếp vào dạng nấm dược liệu có hoạt tính chữa bệnh in vitro hay trên các mẫu động vật thí nghiệm. Một số chất trích từ nấm được phát hiện có hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch tiềm năng, hoạt tính miễn dịch chống lại tế bào ung thư hơn hẳn các hoá dược kháng ung thư. Tất cả đều không độc, hiệu quả và rất dễ dung nạp. Nổi bậc nhất có 6 nhóm chất sau: Lentinan, AHCC (trích từ nấm hương Lentinus edodes), Schizophyllan (Nấm chân chim Schizophyllum commune), Grifron-D (Nấm gà gỗ Grifola frondosa), PSP, PSK ( Nấm vân chi Trametes versicolor). Các dịch trích chủ yếu được chiết từ quả thể nấm và sinh khối từ hệ sợi (nuôi cấy lên men trong môi trường lỏng). Cả thành phần tế bào và các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của nấm đều có tác dụng trên hệ miễn dịch của tế bào chủ và do đó có thể chữa được nhiều bệnh khác nhau. Hướng kết hợp các tác nhân có tiềm năng miễn dịch với các liệu pháp chống ung thư như giải phẫu, hoá trị, xạ trị đã đạt được bước tiến đáng kể ở Trung Quốc, Nhật Bản nơi mà nấm được xem như một nguồn kháng ung thư hàng thế kỷ qua. 2.2. Tổng quan về nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilat 2.2.1. Giới thiệu về nấm vân chi: tên gọi và vị trí phân loại Vân chi có nhiều tên gọi rất khác nhau. Tên tiếng Anh là Turkey tail (đuôi gà tây). Ở Trung Quốc, người ta gọi là “Yunzhi” có nghĩa là loại nấm có hình dạng như 5 mây. Người Nhật thì gọi là “Karawatake” do người ta hay tìm thấy chúng ở những nơi gần bờ sông. [19] , [22] Vân chi có tên khoa học phổ biến hiện nay là Trametes versicolor sau một thời gian dài được nghiên cứu và đặt tên khác nhau. Trametes versicolor (L.:Fr) Pilat, tức là loài Coriolus versicolor (L.:fr) Quél, được chính Carl von Linnaeus tìm ra và đặt tên đầu tiên: Boletus versicolor L. (1753). Sau đó Christiaan Hendrik Persoon (1805) lại xác định với tên Boletus vulutinus Pers., và Elias Magnus Fries (1821) đưa vào chi Polyporus (với hai loài: P. versicolor Fr và P. Vulutinus Fr). Lucien Quélet (1886) lại đưa vào Coriolus. Sau 50 năm, Abert Pilát (1936) đề nghị và được đa số các nhà nấm học thống nhất xếp vào chi Trametes, họ polyporacea. Các hệ thống phân loại về sau cũng phù hợp với quan điểm trên, nên hầu hết những tác giả gần đây đều sử dụng danh pháp đã chỉnh lý: Trametes versicolor.[14] Vân chi là một loại nấm lớn thuộc phân lớp Basidiomycetes gồm khoảng 22 000 loài đã biết. Nấm vân chi gây hoại sinh cây bệnh, cư trú trên gỗ đã chết, thuộc loại nấm gây mục trắng mạnh có thể phá huỷ đồng thời tất cả các cấu tử gỗ (hemicellulose, cellulose, lignin), giúp phá vỡ các gốc cây già, cây chết vì thế chất dinh dưỡng của cây sẽ trở về đất để tái sử dụng. Nấm vân chi không độc đối với người nhưng cũng không ăn được vì nó là dạng nấm gỗ. [14], [18] Vị trí phân loại nấm vân chi [1],[3],[7],[12], [17] Giới nấm : Fungi Ngành nấm thật : Eumycota Ngành phụ nấm đảm : Basidiomycotina Lớp nấm đảm : Basidiomycetes Phân lớp nấm đảm đơn bào : Holobasidiomycetidae Nhóm bộ : Hymenomycetes Bộ nấm lỗ : Aphyllophorales Họ nấm nhiều lỗ : Polyporaceae Chi : Trametes Loài : Trametes versicolor 6 2.2.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Trametes versicolor [3],[14],[19],[22], [31] Hình 2.1: Quả thể nấm vân chi Trametes versicolor Vân chi là loại nấm hàng năm, không cuống, phát triển một bên. Khi non quả thể có dạng nhiều u lồi tròn, mọc thành dạng vành với mép tán màu trắng-trắng kem. Nấm trưởng thành có dạng quả giá, chất da hoá gỗ. Quả thể hình nan quạt có nhiều vân đồng tâm, chồng chất xen kẽ nhau như ngói lợp, nhìn rất giống đuôi gà tây đang xòe. Mũ nấm mỏng, phẳng hoặc hơi quăn hình bán nguyệt, mọc thành cụm kích thước 1 – 6 x 1 – 10 cm. Mặt trên tai nấm có lớp lông mịn, mền như nhung, có màu sắc rất khác nhau tùy chủng từ đen, nâu, xám, xanh đến đo đỏ, trắng hay vàng nhạt. Màu sắc các chủng vân chi phụ thuộc vào môi trường và hệ di truyền. Mặt dưới tai nấm màu trắng, màu kem hay hơi xám có hàng ngàn ống nhỏ. Tất cả các chủng vân chi đều có các ống nhỏ ở mặt dưới, đây là đặc điểm giúp phân biệt vân chi với nấm Stereum hissutum. Các ống này rất nhỏ khoảng 4 – 5 ống/mm, có vách ngăn ngang dày. Miệng ống tròn hay hơi tròn. Các ống này giúp gia tăng diện tích mang bào tử. Thịt nấm màu trắng hoặc trắng kem, gồm nhiều sợi dày 0,6 – 2,5 mm. 2.2.3. Đặc điểm vi học [14], [21] Hệ sợi kiểu trimitic, sợi dinh dưỡng trong suốt, có vách mỏng, có khoá rõ ràng, đường kính cỡ 2,5 – 3 µm; sợi cứng ở vùng thịt nấm có vách rất dày, không thấy có vách ngăn tế bào, đường kính tới 4 – 6 µm, rất hiếm khi thấy phân nhánh; sợi bện cũng có vách ngăn ngang, đường kính sợi nhỏ hơn (2 – 4 µm). Không thấy có liệt bào, song 7 có thấy cystidioles dạng fusoid, kích thước 15 – 20 x 4 – 5 µm, có khoá ở phần gốc. Đảm bào hình chùy có bốn tiểu bính (nơi đính của bốn bào tử), có khoá ở phần gốc. Bào tử đảm hình trụ, hơi cong hình quả dưa gang, trong suốt, nhẵn, kích thước 5 – 6 x 1,5 – 2 µm. 2.2.4. Đặc điểm phân bố [19],[22], [25], [34] Vân chi là loại nấm phá gỗ, mọc hoang, thường mọc trên các cây thân gỗ đã chết hoặc khô, đặc biệt là gỗ sồi, dễ dàng tìm thấy ở nhiều nơi trên thế giới. Vân chi thích hợp đối với những nơi có nhiều mưa, ẩm ướt, gần bờ sông… ở vùng ôn đới Bắc Mỹ, châu Á, châu Âu và là loại nấm sinh sản nhiều nhất ở Bắc Bán Cầu. Ở Việt Nam cũng tìm thấy nấm này, nhất là vào mùa mưa. Nhật, Trung Quốc và một vài nước khác đang trồng và chiết xuất PSP, PSK từ vân chi. Ở Việt Nam, TS Lê Xuân Thám (Trung tâm kỹ thuật hạt nhân TpHCM) đã mang một giống chuẩn từ Nhật về, đây là loại mặt trên tai nấm có những vân đồng tâm nâu đen đến đen. Hiện nay giống này đang được trồng thử trên Đà Lạt và cũng được Trung tâm nghiên cứu linh chi và nấm dược liệu TpHCM trồng thử nghiệm trong điều kiện khí hậu của thành phố, đã ra quả thể (tai nấm) tại TpHCM. 2.2.5. Chu trình sống [3] Tầng đảm Đảm Kết hợp nhân ở đảm Hình thành bào tử đảm Quả thể Sợi nấm song hạch Bào tử đảm nảy mầm Sự kết hợp sơ cấp Sơ đồ 2.1: Chu trình phát triển của nấm vân chi . tên khác nhau. Trametes versicolor (L. :Fr) Pilat, tức l loài Coriolus versicolor (L. :fr) Qu l, được chính Carl von Linnaeus tìm ra và đặt tên đầu tiên: Boletus versicolor L. (17 53) . Sau đó Christiaan. hiện đề tài: Khảo sát sinh trưởng một chủng nấm vân chi đen Trametes versicolor có nguồn gốc từ Trung Quốc. 2 1.2. Mục đích đề tài 9 Khảo sát môi trường nhân giống cấp một, cấp hai. Ngành phụ nấm đảm : Basidiomycotina L p nấm đảm : Basidiomycetes Phân l p nấm đảm đơn bào : Holobasidiomycetidae Nhóm bộ : Hymenomycetes Bộ nấm l : Aphyllophorales Họ nấm nhiều l : Polyporaceae