LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm tạ: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TpHCM, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. Trân trọng cám ơn: Th.S Cổ Đức Trọng và Th.S Phan Thị Nhiều đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Thầy Lưu Phúc Lợi đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Các chị công nhân tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM Và cảm ơn: Các bạn của lớp CNSH K27 và bạn bè xung quanh đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hổ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 9 năm 2005 Nguyễn Phương Uyên iii TÓM TẮT NGUYỄN PHƯƠNG UYÊN, Đại học Nông Lâm TpHCM. Đề tài “KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN CHI ĐEN TRAMETES VERSICOLOR L.:Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC” được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM và Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường đại học Nông Lâm TpHCM trong thời gian từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Giáo viên hướng dẫn: Th.S Cổ Đức Trọng Th.S Phan Thị Nhiều Mục đích đề tài: Tìm kiếm các môi trường nuôi trồng thích hợp đối với vân chi đen Trametes versicolor. Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần. Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã thu nhận được một số kết quả như sau: Quan sát hình thái giải phẫu quả thể và hệ sợi nấm vân chi dưới kính hiển vi nhận thấy rằng: Quả thể nấm vân chi không cuống, hình quạt, cứng, mỏng xếp xen kẽ chồng chất đan xen nhau như ngói lợp, mặt trên tai nấm có nhiều đường đồng tâm có màu sắc thay đổi từ xám tro, nâu đen đến đen, mặt dưới tai nấm màu trắng hay trắng kem, có nhiều lỗ rất nhỏ, thịt nấm mỏng màu trắng. Hệ sợi nấm vân chi trong suốt có vách dày, không hoặc ít khi phân nhánh gồm 3 loại: Sợi dinh dưỡng, sợi bện và sợi cứng. Bào tử trong suốt, nhẵn, vách mỏng, thon dài hơi cong. Khảo sát môi trường nhân giống cấp một trên các môi trường PSA, BTH, CRA, PSA + Nước dừa 10%, PSA + Nước chiết giá 10%; môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ; môi trường BTH ở các pH khác nhau. Kết quả cho thấy hệ sợi lan nhanh nhất trên môi trường PSA + Nước dừa 10%, hệ sợi lan tốt ở nhiệt độ phòng (30 ± 2 o C ) và ở pH 5 – 5,5 trên môi trường BTH (khoai tây + muối khoáng). Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai với các cơ chất lúa, bắp xay, mùn cưa có bổ sung các thành phần dinh dưỡng khác nhau. Kết quả thu được có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và công thức gồm Lúa (80%), Mùn cưa (5%), Cám bắp (5%) là công thức tốt nhất thích hợp cho sự lan của hệ sợi. Thí nghiệm môi trường nuôi trồng ra quả thể vân chi trong điều kiện tại TpHCM với cơ chất mùn cưa có bổ sung cám gạo, cám bắp và các loại phân hữu cơ như Urea, DAP, SA, NPK…Qua quá trình khảo sát nhận thấy môi trường Mùn cưa + Cám gạo 10% và Mùn Cưa + Cám bắp 10% có sự hình thành quả thể sớm nhất, tương đối đồng đều và nhiều hơn cả. Thí nghiệm khả năng tạo sinh khối nấm vân chi trong môi trường nuôi cấy lỏng qua các nghiệm thức PSA, BTH, CRA, PSA + Nước chiết bắp, PSA + Nước chiết giá, PS + Nước dừa với các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy trong tất cả môi trường thí nghiệm, môi trường BTH có lượng sinh khối cao nhất. Ly trích và định lượng các hợp chất trích từ sinh khối thu được ở thí nghiệm trên bằng phương pháp chiết nóng và tủa bằng cồn 96 o . Kết quả cho thấy sinh khối từ môi trường PSA + Nước dừa 10% có tỉ lệ polysacharide thô thu được cao nhất qua các lần chiết. Khi tiến hành chiết và định lượng các hợp chất thô từ quả thể và hệ sợi trong môi trường nuôi cấy lỏng BTH cho kết quả: tỉ lệ chất chiết từ sinh khối hệ sợi cao hơn so với chiết từ quả thể nấm. iv MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt ix Danh sách các hình x Danh sách bảng xii 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. TỔNG QUAN 3 2.1. Khái quát về nấm trồng 3 2.1.1. Giới thiệu sơ lược 3 2.1.2. Giá trị của nấm 4 2.2. Tổng quan về nấm vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilat 4 2.2.1. Giới thiệu về nấm vân chi: tên gọi và vị trí phân loại 4 2.2.2. Đặc điểm hình thái cấu tạo của Trametes versicolor 6 2.2.3. Đặc điểm vi học 6 2.2.4. Đặc điểm phân bố 7 2.2.5. Chu trình sống 7 2.2.6. Quy trình nuôi trồng nấm 8 2.2.6.1. Chọn dòng và giữ giống 8 2.2.6.2. Quy trình nhân giống cấp một và cấp hai 9 2.2.6.3. Quy trình nuôi trồng ra quả thể 9 a. Quy trình nuôi trồng trên gỗ khúc 10 b. Quy trình nuôi trồng trên giá thể tổng hợp 11 2.2.6.4. Quy trình nuôi trồng thu sinh khối 12 2.2.7. Giá trị dược tính của nấm vân chi 13 2.2.8. Các giá trị khác của vân chi 14 v 2.2.9. Thành phần hoá học sơ bộ nấm vân chi 14 2.3. Một số khái niệm sinh hoá 15 2.3.1. Khái niệm về polysaccharide 15 2.3.1.1. Polysaccharide đồng thể 15 2.3.1.2. Polysaccharide dị thể 16 2.3.2. Amino acid 17 2.3.3. Chuỗi liên kết ∃-D-glucan 17 2.4. Thành phần dược tính chính trích từ nấm vân chi 18 2.4.1. PSK (polysaccharide - Kureha) 19 2.4.1.1. Cấu tạo 19 2.4.1.2. Dược tính 20 2.4.2. PSP (polysaccharide-peptide) 21 2.4.2.1. Cấu tạo 21 2.4.2.2. Dược tính 21 2.4.3. So sánh giữa PSK và PSP 23 2.5. Phương pháp chiết xuất hợp chất thô từ nấm (Phương pháp trích ly) 25 2.5.1. Khái niệm 25 2.5.2. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất 25 2.5.2.1. Quá trình hoà tan 25 2.5.2.2. Quá trình khuếch tán 25 2.5.2.3. Quá trình thẩm tích 25 2.5.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất 26 2.5.3.1. Nguyên liệu 26 2.5.3.2. Dung môi 26 2.5.3.3. Kỹ thuật chiết 26 2.5.4. Các phương pháp chiết. 27 2.5.4.1. Chiết các nguyên liệu tươi 27 2.5.4.2. Phương pháp ngâm 27 2.5.4.3. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt 27 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 29 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 29 3.1.1. Thời gian 29 vi 3.1.2. Địa điểm 29 3.2. Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, hoá chất 29 3.2.1. Nguyên liệu 29 3.2.2. Hoá chất, môi trường sử dụng 29 3.2.2.1.Hoá chất 29 3.2.2.2. Các môi trường sử dụng 29 3.2.3. Dụng cụ, thiết bị 31 3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 32 3.3.1. Quan sát hình thái giải phẫu quả thể nấm vân chi 32 3.3.1.1 Hình thái cấu tạo quả thể 32 3.3.1.2. Hệ sợi tơ thứ cấp 32 3.3.1.3. Đảm và đảm bào tử 32 3.3.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 32 3.3.2.1. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau 32 3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 33 3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH 33 3.3.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai 33 3.3.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể 34 3.3.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng 35 3.3.6. Định lượng polysaccharide thô ly trích từ nấm vân chi đen Trametes versicolor 36 3.4. Phương pháp xử lý số liệu 38 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Quan sát hình thái giải phẫu 39 4.1.1. Hình thái cấu tạo quả thể 39 4.1.2. Hình thái cấu tạo hệ sợi hệ sợi thứ cấp 40 4.1.3. Đảm và bào tử đảm 41 4.2. Khảo sát đặc điểm dinh dưỡng, sinh lý của hệ sợi nấm vân chi trên môi trường thạch 42 4.2.1. Khảo sát tốc độ lan của hệ sợi trên môi trường dinh dưỡng khác nhau 42 vii 4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 43 4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH 45 4.3. Khảo sát môi trường nhân giống cấp hai (môi trường hạt) 46 4.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể 48 4.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng 49 4.6. Khảo sát tỉ lệ ly trích hợp chất thô từ sinh khối nấm vân chi 52 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 7. PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PSK : polysaccharide Kureha PSP : polysacharide peptide IL : interleukin INF : yếu tố gây hoại tử CPA : cyclophosphamine PLB : tế bào lympho máu ngoại vi ALS : huyết thanh bạch cầu MCM : mytomycin-M LD : lethal dose (Liều chết trung bình) CD : kháng nguyên biểu hiện bên ngoài của tế bào T ITF : int erferon BTH : môi trường bán tổng hợp TLPT : trọng lượng phân tử ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Quả thể nấm vân chi Trametes versicolor 6 Sơ đồ 2.1: Chu trình phát triển của nấm vân chi 7 Sơ đồ 2.2 Quy trình phân lập tổng quát 8 Sơ đồ 2.3 Quy trình nuôi trồng nấm 10 Hình 2.2: Cấu trúc chuỗi beta-glucan trích từ nấm 18 Sơ đồ 3.2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi 37 Hình 4.1: Quả thể nấm Vân chi đen Trametes versicolor (theo chiều từ trên xuống, trái qua phải: Hình 4.1a, Hình 4.1b, Hình 4.1c, Hình 4.1d ) 39 Hình 4.2: Hệ sợi trích từ quả thể nấm vân chi 40 Hình 4.3: Hệ sợi vân chi lấy từ môi trường thạch 41 Hình 4.4: Bào tử nấm vân chi 42 Hình 4.5: Đường kính hệ sợi tăng trưởng trên năm môi trường dinh dưỡng sau 4 ngày cấy 43 Hình 4.6: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở 27 o C và 30 o C vào ngày thứ 4 45 Hình 4.7: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH vào ngày thứ 4 46 Hình 4 .8 : Hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống trung gian sau 7 ngày cấy 48 Hình 4.9: Sinh khối nấm Vân chi trong 3 môi trường lỏng 50 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường dinh dưỡng theo thời gian 42 Biểu đồ 4.2: Biểu diễn đường kính hệ sợi nấm vân chi lan trên môi trường BTH ở nhiệt độ 27 o C và 30 o C theo thời gian 44 Biểu đồ 4.3: Biểu diễn đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 45 Biểu đồ 4.4: Biểu diễn chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai 47 Biểu đồ 4.5: Biểu diễn sinh khối nấm vân chi được tạo ra trên 3 môi trường 50 x Biểu đồ 4.6: Biểu diễn sinh khối nấm trong các môi trường có bổ sung thành phần dinh dưỡng tự nhiên 51 Biểu đồ 4.7 : Biểu diễn tỉ lệ hợp chất polysccharide thô chiết từ sinh khối thu được trên 3 môi trường lỏng 53 Biểu đồ 4.8: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô chiết từ sinh khối hệ sợi nấm vân chi thu được trên 10 môi trường lỏng 54 Biểu đồ 4.9: Biểu diễn khối lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường 55 Biểu đồ 4.10: Biểu diễn tỉ lệ chất trích từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau 56 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật 14 Bảng 2.2: So sánh giữa PSK và PSP 23 Bảng 3.1: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong mùn cưa (%) 31 Bảng 3.2: Hàm lượng khoáng đa lượng cơ bản trong các loại bột (%) 31 Bảng 3.3: Hàm lượng khoáng trong nước dừa 31 Bảng 4.1: Đường kính hệ sợi lan trên 5 môi trường đinh dưỡng theo thời gian 42 Bảng 4.2: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở hai mức nhiệt độ theo thời gian 44 Bảng 4.3: Đường kính hệ sợi lan trên môi trường BTH ở các pH khác nhau theo thời gian 45 Bảng 4.4: Chiều dài hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống cấp hai 46 Bảng 4.5: Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng 48 Bảng 4.6: Sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trường lỏng 49 Bảng 4.7: Sinh khối vân chi trên các môi trường bổ sung dinh dưỡng tự nhiên 51 Bảng 4.8: Tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trường lỏng 53 Bảng 4.9: Tỉ lệ hợp chất polysaccharide thô trích từ sinh khối thu hoạch trên 10 môi trường lỏng 53 Bảng 4.10: Khối lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường 55 Bảng 4.11: Tỉ lệ chất trích từ các nguồn nguyên liệu khác nhau 56 xii . beta-glucan trích từ nấm 18 Sơ đồ 3. 2: Quy trình ly trích hợp chất thô từ nấm vân chi 37 Hình 4. 1: Quả thể nấm Vân chi đen Trametes versicolor (theo chi u từ trên xuống, trái qua phải: Hình 4.1a,. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. TỔNG QUAN 3 2 .1. Khái quát về nấm trồng 3 2 .1. 1. Giới thiệu sơ l ợc 3 2 .1. 2. Giá trị của nấm 4 2.2. Tổng quan về nấm vân chi Trametes versicolor (L. :Fr) Pilat 4 2.2 .1. . TRAMETES VERSICOLOR L. :Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC” được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM và Bộ môn Công Nghệ Sinh Học trường đại học Nông L m TpHCM