Luận văn : KHẢO SÁT SINH TRƯỞNG MỘT CHỦNG NẤM VÂN CHI ĐEN TRAMETES VERSICOLOR L.:Fr Pilát CÓ NGUỒN GỐC TỪ TRUNG QUỐC part 8 pps

48 Hình 4 .8: Hệ sợi lan trên các môi trường nhân giống trung gian sau 7 ngày cấy 4.4. Khảo sát môi trường nuôi trồng ra quả thể Các bịch môi trường sau khi cấy giống được ủ ở nhiệt độ phòng (29 ± 2 o C). Qua quá trình quan sát sự xuất hiện hệ sợi nấm trên các môi trường nuôi trồng nhận thấy kết quả được thể hiện ở Bảng 4.5: Bảng 4.5: Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi trên các môi trường nuôi trồng Tỉ lệ xuất hiện hệ sợi (%) Môi trường Ngày thứ 6 Ngày thứ 9 Ngày thứ 12 1 64,3 85,6 100 2 57,1 78,5 100 3 92,3 100 100 4 92,9 100 100 5 85,7 100 100 6 71,4 96,4 100 7 96,8 100 100 8 14,3 53,8 84,6 9 37,0 92,3 100 10 57,1 96 100 49 Như vậy về cơ bản đến ngày thứ 12 thì ở tất cả các môi trường thí nghiệm đều có sự hình thành hệ sợi, và tuỳ thuộc vào từng loại môi trường mà tốc độ hệ sợi lan ở mỗi nghiệm thức có sự khác nhau. Tiến hành quan sát tiếp sự phát triển của hệ sợi nấm, nhận thấy sau 1 tháng, hệ sợi đã lan đầy bịch môi trường, hệ sợi lan chậm nhất ở MT8, nhanh nhất là ở MT3. Tỉ lệ hệ sợi lan kín bịch môi trường ở các công thức là: MT1 (94%), MT2 (85,4%), MT3 (98%), MT4 (69,2%), MT5 (65,1%), MT6 (80,4%), MT7 (74,1%), MT8 (36%), MT9 (47%), MT10 (57,1%). Nhưng ở MT6, MT7 có sự xuất hiện mầm quả thể đầu tiên sau 2,5 tháng nuôi trong điều kiện sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi và nấm dược liệu TpHCM. Ba tháng sau khi cấy, tất cả môi trường đều xuất hiện mầm quả thể, trong đó tỉ lệ nảy mầm của mỗi nghiệm thức lại có sự khác biệt nhau: MT1 (26,5%), MT2 (8,6%), MT3 (15,8%), MT4 (12,1%), MT5 (5,9%), MT6 (40,5%), MT7 (26,3%), MT8 (11,1%), MT9 (0%), MT10 (10,3%). Như vậy, MT6 (Mùn cưa + Cám gạo 10%) là môi trường có sự hình thành quả thể sớm và có tỉ lệ nảy mầm cao nhất. Do giới hạn về mặt thời gian và vì đây là giống mới, có nguồn gốc từ Trung Quốc chưa thích nghi tốt với điều kiện khí hậu ở Việt Nam, lượng nấm hình thành không nhiều và không đồng đều giữa các nghiệm thức nên không thể tiến hành thu hái tai nấm và định lượng để xác định môi trường cho quả thể nhiều nhất. Thí nghiệm chỉ dừng ở mức quan sát môi trường có sự hình thành hệ sợi và xuất hiện mầm sớm nhất. 4.5. Khảo sát khả năng tạo sinh khối trên môi trường lỏng TN1: Khảo sát khả năng tạo sinh khối nấm vân chi trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau Sinh khối thu được từ 3 loại môi trường nuôi cấy lỏng được trình bày ở Bảng 4.6 Bảng 4.6: Sinh khối nấm vân chi trên môi 3 trường lỏng Sinh khối (gam) Thời gian (ngày) PS BTH CRAPEK 5 0,0195 ± 0,0068 0,0713 ± 0,0185 0,0059 ± 0,0010 10 0,1289 ± 0,0007 0,2350 ± 0,0290 0,0241 ± 0,0046 15 0,2101 ± 0,0042 0,4323 ± 0,0375 0,0459 ± 0,0047 50 0,2101 0,0459 0,4323 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 PS CRA BTH Môi trường Sinh khối (g ) 5N 10N 15N Biểu đồ 4.5: Biểu diễn sinh khối nấm vân chi được tạo ra trên 3 môi trường Ba môi trường bổ sung với các thành phần dinh dưỡng khác nhau có sự khác biệt từng đôi một về khả năng tạo sinh khối, sinh khối nấm phát triển mạnh nhất ở môi trường khoai tây có bổ sung hoá chất tổng hợp (BTH), trên môi trường Crapek (gồm toàn hoá chất tổng hợp không có nguồn dinh dưỡng tự nhiên) hệ sợi tăng trưởng chậm nhất, sinh khối tạo ra ít, không thích hợp để nuôi lấy sinh khối. Vậy để tạo lượng sinh khối lớn trong sản xuất, có thể sử dụng môi trường BTH (nước chiết khoai tây + khoáng tổng hợp). Hình 4.9: Sinh khối nấm vân chi trong 3 môi trường lỏng 51 TN2: Thử nghiệm khả năng tạo sinh khối trên các môi trường dinh dưỡng tự nhiên Lượng sinh khối thu được từ 10 môi trường trong TN2 được trình bày ở Bảng 4.7 Bảng 4.7: Sinh khối vân chi trên các môi trường bổ sung dinh dưỡng tự nhiên Sinh khối nấm vân chi (gam) Môi trường 5 ngày 10 ngày 15 ngày 1 0,0274 ± 0,0173 0,1153 ± 0,0115 0,1581 ± 0,0092 2 0,0259 ± 0,0066 0,1330 ± 0,0226 0,2276 ± 0,0188 3 0,0361 ± 0,0101 0,1419 ± 0,0161 0,2433 ± 0,0156 4 0,0359 ± 0,0046 0,1141 ± 0,0089 0,1973 ± 0,0173 5 0,0338 ± 0,0050 0,1204 ± 0,0138 0,2047 ± 0,0181 6 0,0290 ± 0,0040 0,1474 ± 0,0030 0,2074 ± 0,0133 7 0,2074 ± 0,0133 0,1234 ± 0,0029 0,3402 ± 0,0156 8 0,0142 ± 0,0049 0,1293 ± 0,0083 0,2332 ± 0,0164 9 0,0320 ± 0,0040 0,1248 ± 0,0155 0,2289 ± 0,0130 10 0,0713 ± 0,0185 0,2348 ± 0,0290 0,4323 ± 0,0375 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 12345678910 Môi trường gam 5N 10N 15N Biểu đồ 4.6: Biểu diễn lượng sinh khối trong các môi trường có bổ sung thành phần dinh dưỡng tự nhiên 52 Kết quả cho thấy sự tích luỹ sinh khối có sự khác nhau trên các môi trường thí nghiệm. Trong tất cả các ngày thu hoạch (5, 10, 15 ngày), sinh khối tạo ra trên MT10 (môi trường khoai tây + muối khoáng) đều cao nhất (vào ngày thứ 15, lượng sinh khối thu được trên MT10 lớn hơn MT3 1,78 lần; cao hơn MT6 2,08 lần; hơn MT7 1,27 lần). Từ kết quả thu nhận cho thấy lượng hoá chất tổng hợp bổ sung (KH 2 PO 4 , MgSO 4 , Peptone) có tác dụng tích cực thúc đẩy quá trình tăng trưởng hệ sợi hơn các nguồn dinh dưỡng bổ sung tự nhiên (nước chiết bắp, nước chiết giá đậu, nước dừa). Khi xét đến hiệu quả của từng nguồn dinh dưỡng bổ sung, nhận thấy có kết quả như sau: sinh khối tạo ra trong môi trường PS có bổ sung nước bắp với các nồng độ khác nhau có sự sai khác có ý nghĩa, môi trường có bổ sung nước chiết bắp 15% có sinh khối cao hơn các nồng độ bổ sung khác (5% và 10%), như vậy lượng nước bắp bổ sung có ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo ra, nồng độ bổ sung càng cao cho lượng sinh khối tạo ra càng nhiều. Môi trường PS có bổ sung nước chiết giá đậu với các nồng độ khác nhau (5%, 10%, 15%) cho lượng sinh khối tạo ra không có sự khác biệt về mặt thống kê, do vậy nồng độ nước chiết giá bổ sung không ảnh hưởng đến lượng sinh khối tạo ra. Trong khi môi trường PS có bổ sung nước dừa có sự khác biệt rõ rệt giữa các nồng độ bổ sung. Lượng nước dừa bổ sung ở nồng độ 5% cho lượng sinh khối cao nhất, khác biết có ý nghĩa so với hai nồng độ bổ sung 10% và 15%. Sinh khối thu được từ hai môi trường có bổ sung 10% và 15% nước dừa thì tương đương nhau, không có sự sai khác. Như vậy, MT10 – môi trường BTH (khoai tây muối khoáng) là môi trường thích hợp nhất được sử dụng trong nuôi cấy để thu nhận sinh khối nấm vân chi. 4.6. Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ hệ sợi nấm vân chi TN1: Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trên 3 môi trường PS, BTH, CRAPEK Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trưởng lỏng được trình bày ở Bảng 4.8. Bảng 4.8: Tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường PS(%) BTH (%) CRA (%) Lần 1 10,89 11,38 0 Lần 2 11,03 10,65 0 Lần 3 10,43 11,44 0 Tỉ lệ TB 10,76 11,16 0 53 10,78 11,16 0 0 2 4 6 8 10 12 PS BTH CRA Môi trường % polysaccharide th ô Biểu đồ 4.7 : Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên 3 môi trường lỏng Vì lượng sinh khối thu được từ môi trường Crapek rất ít nên không tiến hành trích và định lượng. Lượng polysaccharide thô trích từ sinh khối thu được trên môi trường PS và BTH cho tỉ lệ tương đương nhau, khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Về mặt kinh tế, nếu sử dụng sinh khối cho mục đích ly trích polysaccharide thô thì môi trường BTH là môi trường thích hợp nhất dùng trong nuôi cấy chìm hệ sợi. TN2: Định lượng hợp chất polysaccharide thô trích từ các môi trường PSA có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Kết quả trích ly lượng polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng được thể hiện ở Bảng 4.9 Bảng 4.9: Tỉ lệ hợp chất polysacharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trong 10 môi trường nuôi cấy lỏng Môi trường Tỉ lệ polysaccharide thô (%) 1 11,16 ± 0,63 2 11,65 ± 0,12 3 12,38 ± 0,43 4 11,68 ± 1,87 5 14,02 ± 1,53 6 14,55 ± 0,68 7 12,96 ± 1,86 8 21,75 ± 3,35 9 15,05 ± 2,62 10 11,16 ± 0,44 54 11,16 11,65 12,38 11,68 14,02 14,55 12,96 21,75 15,05 11,16 0 5 10 15 20 25 12345678910 Môi trường % polysaccharide th ô Biểu đồ 4.8: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô trích từ sinh khối hệ sợi nấm vân chi thu được trên 10 môi trường lỏng Trên sơ đồ biểu diễn, dễ dàng nhận thấy MT8 có tỉ lệ polysaccharide thô cao nhất, cao hơn môi trường đối chứng 1,95 lần, còn các môi trường còn lại tỉ lệ polysaccharide thô chiết được không sai khác hay mức độ sai khác không đáng kể. Trên môi trường PS có bổ sung nước chiết bắp với các nồng độ khác nhau cho tỉ lệ chiết không có khác biệt nhau, nhưng lượng nước chiết bắp bổ sung càng nhiều thì tỉ lệ polysaccharide thô chiết được càng cao. Trên môi trường có bổ sung nước giá, tỉ lệ polysaccharide thô thu được cao nhất là trong môi trường PS có bổ sung 15%, tuy nhiên tỉ lệ này không có sự sai khác so với nồng độ 10% nhưng sai khác với nồng độ 5%, vậy ở mức bổ sung 15% nước chiết giá cho tỉ lệ polysaccharide thô cao nhất và tỉ lệ không tăng nữa khi bổ sung nồng độ cao hơn. Môi trường PS bổ sung nước dừa với các nồng độ khác nhau có sự sai khác từng đôi một. Lượng polysaccharide thô cao nhất thu được từ sinh khối MT8. Trong khi MT10 (môi trường đối chứng), tuy có lượng sinh khối tạo ra cao nhưng tỉ lệ polysaccharide thô ly trích lại không cao hơn những công thức khác. Nếu tính ra khối lượng polysacchride thô thu được trong 1 lít môi trường nuôi cấy theo công thức: sinh khối ngày thứ 15 x tỉ lệ trích x (1000ml/50ml), thì lượng polysaccharide thô thu nhận được thể hiện trong Bảng 4.10 55 Bảng 4.10: Khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường Môi trường Khối lượng polysaccharide thô (mg/l) 1 353 2 530 3 602 4 461 5 574 6 603 7 882 8 1014 9 689 10 965 353 530 602 461 574 603 882 1014 689 965 0 200 400 600 800 1000 1200 12345678910 Môi trường polysaccharide thô (mg/l ) Biểu đồ 4.9: Biểu diễn khối lượng polysaccharide thô trích được từ sinh khối nấm trong 1 lít môi trường Qua bảng phân tích, ta nhận thấy MT1, MT2, MT3 có sự gia tăng khối lượng polysacharide thô tỉ lệ thuận với nồng độ nước chiết bắp bổ sung. MT4, MT5, MT6 cũng có sự gia tăng khối lượng polysaccharide tỉ lệ thuận với nồng độ nước chiết bắp 56 bổ sung nhưng sự gia tăng này không đáng kể, do vậy nồng độ bổ sung 15% nước chiết giá được coi là tối ưu đối với các môi trường có bổ sung nước chiết giá dùng trong nuôi cấy lấy sinh khối ly trích hợp chất polysaccharide thô. Ở các môi trường có bổ sung nước dừa (MT7, MT8, MT9), có sự gia tăng khối lượng polysaccharide thô từ MT7 sang MT8 nhưng ở MT9 khối lượng có sự suy giảm, vậy môi trường có nồng độ bổ sung 10% nước dừa (MT8) là môi trường tối ưu cho khối lượng polysaccharide thô cao nhất (1014mg/l), cao hơn môi trường đối chứng – MT10 (965mg/l). Tuy lượng polysaccharide thô thu nhận từ MT8 cao hơn MT10 không nhiều, nhưng so về giá thành để tạo 1lít MT8 và 1lít MT10 thì MT8 là môi trường tốt nhất, thích hợp nhất được sử dụng với mục đích lấy hợp chất polysaccharide làm chất chống ung thư. TN3: Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trích Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ quả thể và hệ sợi nấm vân chi được trình bày ở Bảng 4.10 Bảng 4.11: Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ các nguồn nguyên liệu khác nhau (%) QUẢ THỂ HỆ SỢI Lần1 7,36 11,38 Lần 2 7,92 10,65 Lần 3 7,78 11,44 Tỉ lệ TB (%) 7,69 11,16 7,69 11,16 0 2 4 6 8 10 12 Qth ể Hs ợ i Nguyên liệu %polysaccharide th ô Biểu đồ 4.10: Biểu diễn tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ hai nguồn nguyên liệu khác nhau 57 Tỉ lệ polysaccharide thô chiết được từ quả thể nấm thấp hơn rất nhiều so với tỉ lệ từ hệ sợi. Do quả thể có vách tế bào cứng rắn và dày hơn, mức độ chia nhỏ nguyên liệu thấp hơn hệ sợi nên quá trình chiết xảy ra chậm và mức độ lôi kéo các chất chiết ra dung môi thấp do vậy tỉ lệ polysaccharide thô thu được từ quả thể thấp hơn hệ sợi. . chất polysaccharide thô trích từ sinh khối nấm vân chi thu được trên 3 môi trường PS, BTH, CRAPEK Kết quả trích ly hợp chất polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi trên 3 môi trưởng l ng. năng tạo sinh khối trên môi trường l ng TN 1: Khảo sát khả năng tạo sinh khối nấm vân chi trên 3 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau Sinh khối thu được từ 3 loại môi trường nuôi cấy l ng được. sợi. TN 2: Định l ợng hợp chất polysaccharide thô trích từ các môi trường PSA có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau. Kết quả trích ly l ợng polysaccharide thô từ sinh khối nấm vân chi thu