KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM ppt

Do đó, đối với một bệnh nhân có chỉ định điều trị đặc hiệu cho siêu vi viêm gan C thì trước khi bắt đầu điều trị phải làm xét nghiệm 2 yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành c

KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN

kiểu gen 2 là 13,1%( 2: 1,5%; 2a/2c: 11,6%) Chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%) Có 14 trường hợp ( 4,3% ) không xác định được kiểu gen HCV bằng

kỹ thuật LiPA, chúng tôi tiếp tục thực hiện kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để xác định kiểu gen HCV (Hệ thống Trugene, Bayer) và xác định được tất cả kiểu gen của 14 trường hợp đó: Kiểu gen 1 : 2 trường hợp; 1b: 2; 2a: 1; 2c: 1; 6a: 8 Có 229 trường hợp thực hiện định lượng siêu vi C trong máu Lượng siêu vi dao động từ 3.200 bản sao/ml (Copies/ml) đến trên 40.000.000 bản sao/ml, trung bình 6,46x106 ± 8,50x106 bản sao/ml Kiểu gen HCV 1, 2, 6 có lượng siêu

vi C trên 2x106 bản sao/ml là 91, 18, 32 trường hợp; và có lượng siêu vi C dưới 2x106 copies/ml là 46, 15, 27 trường hợp Qua đó chúng tôi nhận thấy rằng không

có sự khác nhau có ý nghĩa giữa lượng siêu vi C trong máu và kiểu gen 1, 2, 6 của siêu vi C ( p> 0,05)

Summary

PREVALENCE OF HCV GENOTYPES IN VIETNAM

Hepatitis C virus (HCV) genotypes are distributed differently depending on geography and etiology of infection We studied the spectrum of HCV genotypes

in Vietnamese patients The incidence of Hepatitis C virus isolates was found in clinical practice is of great clinical significance to the treatment of HCV infected patients as different subtypes may respond unequally to therapy In our study, we performed the LiPA to identify HCV genotype and to evaluate the prevalence of

HCV genotype in Vietnamese patients, and comparison of serum virus loads among patients infected with Hepatitis C Virus genotypes 1, 2 and 6 A total of

327 HCV RNA positive patients were enrolled (Male 57.5%, female 42.5% with mean age of patients 47.90 ± 10.58 years

) from April 2004 to January 2005 At the same time, we collected 229 random serums in this group to perform Branched DNA for HCVRNA quantification The received results were genotypes 1 and 6 were the most common genotypes, followed by type 2 and the rare genotype 3 in alone patient Genotype 1 was seen

in 58.4% (Type 1: 5.8%; 1a: 6.4%; 1a/1b: 0.3%; 1b: 45.9%) while genotype 6a in 23.9%, genotype 2 in 13.1% (Type 2: 1.5%; type 2a/2c: 11.6%) and genotype 3b was in 0.3%, fourteen samples (4.3%) were unclassified Then we performed sequencing based on 5’UT with Trugene system identified genotype 1 (2 cases), 1b (2 cases), 2a (1 case), 2c (1 case), 6a (8 cases) but not typed by LiPA 229 patients had viral loads above 3,200 copies/ml (Range: 3,200 - > 40,000,000 copies/ml, with 6,46x106 ±

8,50x106 copies/ml

) HCV genotype 1, 2, 6 which have quantity HCV RNA above 2x106 copies/ml were in 91, 18, 32 cases, and below 2x106 copies/ml were in 46, 15, 27 cases, respectively We observed that there’s no significant difference in virus load between patients infected with genotype 1, 2, 6 (P>0.05)

I Đặt vấn đề:

Viêm gan do siêu vi C (HCV) là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường mơ hồ, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường là nặng nề như: 50%-80% chuyển qua mạn tính, và có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua

xơ gan và ung thư gan 5,12,14,18,21,25,29 Do đó, chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó mới điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh, phòng ngừa sự lây lan của HCV

Cho đến nay, vấn đề điều trị đặc hiệu siêu vi gây viêm gan C vẫn còn nhiều khó khăn cũng như tốn kém về mặt thời gian và tiền bạc Đồng thời gần như chỉ có một lựa chọn duy nhất của thuốc đặc trị là Interferon, mà tùy theo mỗi thế hệ của thuốc sẽ làm cho bệnh nhân phải gánh chịu thêm một số khó khăn trong dùng thuốc chích cũng như tác dụng phụ của thuốc1,6,18,19,21,27 Do đó, đối với một bệnh nhân có chỉ định điều trị đặc hiệu cho siêu vi viêm gan C thì trước khi bắt đầu điều trị phải làm xét nghiệm 2 yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian cần thiết của điều trị là kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C ( HCV genotype) và định lượng siêu vi trong máu5,11,14,25; Và một vài chỉ số khác như SGOT, SGPT, siêu âm, …

Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen HCV vượt trội riêng4,5,7,8,10,12,15,27 Do đó, chúng tôi

sử dụng kỹ thuật LiPA ( Là một kỹ thuật sinh học phân tử) để xác định kiểu gen

HCV ở người Việt Nam với mục đích phục vụ cho việc điều trị đặc hiệu cũng như khảo sát kiểu gen nào của HCV chiếm chủ yếu ở người Việt Nam Bên cạnh đó, chúng tôi cũng ứng dụng kỹ thuật bDNA để định lượng HCV trong máu và thử tìm mối liên hệ giữa kiểu gen của HCV và số lượng siêu vi C trong máu: Có hay không sự khác nhau của số lượng siêu vi C giữa các kiểu gen khác nhau1,3,7,9

Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HCV ở người Việt Nam; (2) Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật LiPA trong việc xác định kiểu gen HCV

ở người Việt Nam; (3) Khảo sát mối liên hệ giữa kiểu gen HCV và số lượng siêu

vi C trong máu

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

1 Đối tượng nghiên cứu

Các bệnh nhân Việt Nam đã được chẩn đoán nhiễm HCV đến thực hiện kiểu gen HCV và định lượng HCV tại trung tâm y khoa MEDIC, từ tháng 04/2004 đến 1/2005

Có HCVRNA dương tính

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Thực hiện LiPA

Xác định HCVRNA: Kỹ thuật nested PCR (Khếch đại DNA đích bằng PCR tổ)

Ly trích RNA dựa theo qui trình Chomozynski: Ly trích RNA bằng Phenol– chloroform Thực hiện tổng hợp cDNA trên máy luân nhiệt của Bio-Rad, theo chương trình sau: 25oC/5 phút, 42oC/30 phút, 85oC/5 phút, Sau đó tiến hành phản ứng nested PCR trên máy luân nhiệt ( Bio-Rad), theo chu kỳ nhiệt sau : 95oC/5 phút; 94oC/ 30 giây, 70oC/30 giây, 20 chu kỳ; 94oC/30 giây, 55oC/30 giây, 72oC/

1 phút, 40 chu kỳ; 72oC cho 10 phút; Sau đó giữ ở 4oC Chúng tôi sử dụng các hóa chất và thuốc thử sau đây để thực hiện RT và PCR: Enzym Reverse Transcriptase (Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia), dNTP (Pharmacia), Primer NP & OP ( Trên vùng 5’UT của HCV, Bayer), MgCL2, MnCL2 Điện di phân tích kết quả trên thạch agarose 2%, kích thước sản phẩm PCR dài 240 cặp base (bp), chụp hình bằng hệ thống Gel Doc của Bio-Rad

Thực hiện quá trình lai các sản phẩm PCR đã có ( Với Primer NP & OP có gắn Biotin của Bayer) với các que (strip) của bộ thuốc thử LiPA Trên các que có các vạch gắn sẵn các đoạn dò (Probes) chuyên biệt cho từng kiểu gen của HCV, sau khi lai sẽ đọc kết quả theo bảng hướng dẫn được cung cấp bởi nhà sản xuất (Bayer)

2.2 Định lượng HCV

Kỹ thuật: Branched DNA( Khếch đại tín hiệu) Thuốc thử dùng cho kỹ thuật là của Bayer, thế hệ 3 Thực hiện trên máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer

2.3 Men gan: SGOT, SGPT

Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp động học (Kinetic), đo ở bước sóng l=360

nm Thuốc thử của hãng Waco, Nhật Thực hiện trên máy Hitachi 747

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

Tiền cứu cắt ngang

3 Thống kê: Phần mềm SPSS for Win, Ver 7.5

III Kết quả:

1 Tổng số có 327 trường hợp thực hiện LiPA để xác định kiểu gen HCV

Tuổi nhỏ nhất là 19, lớn nhất là 79 với độ tuổi trung bình là 47,90±10,58

Nam có 188 trường hợp ( 57,5%) với độ tuổi trung bình là 47,22±11,35; nữ có 139 trường hợp ( 42,5%) với độ tuổi trung bình là 48,81±9,39

2 Kiểu gen của HCV trong 327 trường hợp của bệnh nhân Việt Nam

Số lượng 19 21 1 150 5 38 1 78 14 327 Phần trăm 5,8% 6,4% 0,3% 45,9% 1,5% 11,6% 0,3% 23,9% 4,3% 100%

3 Khảo sát sự thay đổi men gan trong 327 trường hợp nhiễm HCV có HCVRNA(+)

Sự thay đổi của SGOT: Nhỏ nhất là 13, lớn nhất là 308 U/L, với giá trị trung bình

SGPT 60±58 U/L 41±41 U/L 115 U/L 46±38 U/L 35±23 U/L

4 Tổng cộng có 229 trường hợp thực hiện đồng thời kiểu gen HCV và định lượng siêu vi C trong máu

Tuổi nhỏ nhất là 19, lớn nhất là 77 với độ tuổi trung bình 47,92±10,56 Nam có 135 trường hợp (59%) với độ tuổi trung bình 47,49±11,44

Nữ có 94 trường hợp (41%) với độ tuổi trung bình 48,54±9,18

vi C Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCVRNA (Tình trạng siêu vi đang tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm…1,3,4,7Và một điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn nhiều khác

nhau theo các nhóm tác giả khác nhau2,23 Do đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện kỹ thuật LiPA như một xét nghiệm thường qui trong xác định kiểu gen của siêu vi viêm gan C

Cho đến nay, LiPA vẫn là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi trên thế giới trong việc xác định kiểu gen của siêu vi viêm gan C5,10,15 Kỹ thuật này đạt được độ nhạy cao nhờ ứng dụng kỹ thuật PCR tổ ( Độ nhạy của PCR tổ cao nhờ sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại); Và nhờ việc dùng 2 cặp mồi một lúc cùng với điều kiện lai nghiêm ngặt nên kỹ thuật này có độ đặc hiệu rất cao5,24.Ngoài ra, LiPA xác định được các kiểu gen và chi kiểu thường gặp của HCV; Mặc khác trang thiết bị của kỹ thuật này giống như của một phòng xét nghiệm cho PCR bình thường, và bộ thuốc thử cũng có sẵn cho nên rất thuận tiện cho các phòng xét nghiệm lâm sàng thực hiện như một kỹ thuật thường qui

Kỹ thuật LiPA xác định được 6 kiểu gen và 16 chi kiểu thường gặp của HCV12,24 Trong thời gian từ tháng 04/2004 đến tháng 1/2005 chúng tôi thực hiện kiểu gen HCV cho 327 trường hợp bệnh nhân người Việt Nam Kết quả bảng

1 cho thấy kiểu gen HCV chủ yếu ở người Việt Nam là kiểu gen 1 ( Chiếm 58,4%), tiếp theo là kiểu gen 6 (23,9%), và kiểu gen 2 (13,1%) Nếu phân loại ở mức độ chi kiểu thì chiếm chủ yếu ở Việt Nam là kiểu gen 1b (45,9 %) Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây về kiểu gen HCV ở bệnh nhân là người Việt Nam4,15,17,20,26 ( Xem bảng so sánh)

Tác giả- Địa

điểm

Số trường hợp

Kiểu gen 1

Kiểu gen 1b

Kiểu gen 6a

Không định kiểu gen được

36% là type 7,8 Type 9:

1 (37,28%), có 10,65% là type huyết thanh 2, tỷ lệ không xác định được type huyết thanh là 5,92% và không xác định được các chi kiểu Tỷ lệ phân loại của HCV giữa type huyết thanh và kết quả xác định kiểu gen bằng LiPA không phù hợp nhau, điều này cũng đã được nhiều nghiên cứu trước đó xác nhận2,7,23

2 Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật LiPA trong việc xác định kiểu gen HCV ở người Việt Nam

Đoạn gen để phân tích kiểu gen HCV là 5’ UT: Có phù hợp ở Việt Nam không? Cho đến nay, để thực hiện chính xác kiểu gen HCV là phải phân tích trên đoạn Core hoặc NS5B của bộ gen HCV4,15,16 Vì trên đoạn 5’UT ( Là vùng DNA đích

để phân tích kiểu gen của kỹ thuật LiPA) sẽ có nhược điểm là không xác định được một số kiểu gen HCV mới như kiểu gen 7, 8, 9 Và trong kỹ thuật LiPA thì các kiểu gen mới này ( Kiểu gen 7, 8, 9), là những kiểu gen hay gặp ở các nước

vùng Đông Nam Á, sẽ bị phân loại lầm ( Misclassify) thành kiểu gen 1b4,8,15,16 Đây có thể xem là nhược điểm lớn nhất của LiPA trong xác định kiểu gen HCV ở người Việt Nam cũng như của vùng Đông Nam Á Do đó, trong tương lai, chúng tôi sẽ tiến hành thực hiện LiPA với thế hệ mới ( Nếu có, phân tích trên đoạn NS5B), hoặc thực hiện kỹ thuật xác định trình tự chuỗi ( Sequencing) để xác định chính xác hơn kiểu gen HCV nhằm đáp ứng tốt hơn nhu cầu điều trị đặc hiệu HCV

Theo Anouk T.Dev et al (Úc, 2002) và Mindie H Nguyễn (Mỹ, 2004): Kết quả kiểu gen HCV 7, 8, 9 sẽ là 1b khi dùng kỹ thuật LiPA và đáp ứng điều trị kiểu gen 1b của bệnh nhân vùng Đông Nam Á tốt hơn bệnh nhân da trắng Đồng thời, đáp ứng điều trị của các kiểu gen 7, 8, 9 thì tốt hơn kiểu gen 1b4,15 Tuy nhiên, vấn đề kiểu gen mới và đáp ứng điều trị đặc hiệu của nó cần phải nghiên cứu thêm

, đặc biệt là bệnh nhân người Việt Nam

Trong 327 trường hợp thực hiện LiPA của chúng tôi, có 14 trường hợp (4,3%) không xác định được kiểu gen HCV5 Mẫu của các trường hợp đó được tiếp tục thực hiện giải trình tự chuỗi của HCV trên hệ thống Trugene ( Bayer) để xác định kiểu gen HCV, và tất cả đều xác định được kiểu gen với kỹ thuật giải trình tự chuỗi: 2 trường hợp kiểu gen 1; 2 trường hợp kiểu gen 1b; 1 trường hợp kiểu gen 2a; 1 trường hợp kiểu gen 2c; 8 trường hợp kiểu gen 6a Như vậy, kỹ thuật giải trình tự chuỗi có thể thích hợp hơn cho xác định kiểu gen HCV, nhưng do số liệu

còn hạn chế nên vấn đề này cần phải có thời gian để nghiên cứu số liệu nhiều hơn cũng như giá thành của trang thiết bị cho thực hiện giải trình tự như một xét nghiệm thường qui

3 Số lượng siêu vi C và kiểu gen HCV

Trong điều trị đặc hiệu cho HCV, số lượng siêu vi C trong máu và kiểu gen là 2 yếu tố quan trọng nhất trong việc tiên lượng khả năng thành công cao hay thấp của điều trị cũng như thời gian cần thiết cho điều trị Ở kiểu gen 1 thì thường khó đáp ứng với điều trị so với kiểu gen 2, 3 và cả kiểu gen 6, do đó chúng tôi thử tìm có hay không mối liên quan giữa số lượng siêu vi C trong máu và kiểu gen HCV1,3,9,22,28 Trong nghiên cứu này, chúng tôi ứng dụng kỹ thuật bDNA (Khuếch đại tín hiệu) để định lượng siêu vi C trong máu Ưu điểm của kỹ thuật này là tín hiệu nhận được sẽ tuyến tính với số lượng siêu vi C trong mẫu, từ đó giúp cho việc định lượng chính xác hơn, tuy nhiên lại có một nhược điểm là độ nhạy thấp nên sẽ có một số trường hợp dưới ngưỡng định lượng được (3200 bản sao/ml ) mà siêu vi C vẫn còn hoạt động nên vẫn lây nhiễm Theo bảng 3, có 91 trường hợp kiểu gen 1 có lượng siêu vi C cao hơn 2x106 bản sao/ml (Là ngưỡng

để đánh giá lượng siêu vi C trong máu cao hay thấp1,5,6,28), và ở kiểu gen 2, 6 là

18, 32 trường hợp Trong nhóm lượng siêu vi C nhỏ hơn 2x106 bản sao/ml ở kiểu gen 1, 2 và 6 lần lượt là 46, 15, 27 trường hợp Tuy ở kiểu gen 1 số trường hợp nhiều hơn 2x106 bản sao/ml chiếm cao gần gấp đôi so với số trường hợp nhỏ hơn 2x106 bản sao/ml ( 91/46), và ở kiểu gen 2 (18/15), ở kiểu gen 6 (32/27), nhưng

theo phép tính Chi-Square thì sự khác biệt của lượng siêu vi tùy thuộc vào kiểu gen HCV không có ý nghĩa thống kê (P >0.05): Kiểu gen 1 không có nghĩa là luợng siêu vi C nhiều hơn ở kiểu gen 2 & 6 và ngược lại7,9 Qua bảng 4 cũng cho

ta thấy trị số trung bình cũng như độ lệch chuẩn (SD) của số lượng siêu vi C giữa các kiểu gen 1, 2 và 6 không có sự khác biệt rõ rệt

4 Sự thay đổi của men gan ( SGOT, SGPT)

Tăng men gan ( SGOT, SGPT) thường là dấu hiệu sự tổn thương và hoại tử của tế bào gan Sự thay đổi của men gan trong nhiễm HCV thường không nhiều6,12,18,21, đa số ở trong giới hạn bình thường làm cho chúng ta không lưu tâm và bỏ sót bệnh nếu không nghĩ đến nhiễm HCV Qua nghiên cứu 327 trường hợp nhiễm HCV, chúng tôi ghi nhận giá trị SGOT là 53,95±45,56 U/L và SGPT là 53,31±51,15 U/L

V Kết luận:

Kiểu gen HCV 1 chiếm nhiều nhất, thứ 2 là kiểu gen 6 ở Việt Nam Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm về các kiểu gen 7, 8, 9 là những kiểu gen mới hay gặp ở Đông Nam Á cũng như đáp ứng với điều trị đặc hiệu Trong nghiên cứu của chúng tôi chưa thấy có mối liên quan giữa số lượng siêu vi C và kiểu gen HCV Với kỹ thuật LiPA: 4,3% không định được kiểu gen HCV, và tất cả các trường hợp đó đều xác định được kiểu gen bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi, do đó có thể giải trình tự chuỗi có hiệu quả hơn trong việc xác định kiểu gen HCV