KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM ppt

KIỂU GEN CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VIỆT NAM Tóm tắt Kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C (HCV genotype) phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen HCV vượt trội riêng. Chúng tôi ứng dụng kỹ thuật LiPA để xác định tần suất các kiểu gen HCV ở người Việt Nam bị viêm gan siệu vi C mãn tính. Ngoài ra chúng tôi cũng tìm hiểu mối liên hệ giữa 2 yếu tố quan trọng trong việc tiên lượng đáp ứng điều trị đặc hiệu là kiểu gen HCV và định lượng siêu vi C bằng kỹ thuật Branched DNA. Trong thời gian từ tháng 4/2004 đến tháng 1/2005, tại phòng xét nghiệm Trung Tâm Y Khoa MEDIC, chúng tôi thực hiện LiPA cho 327 trường hợp. Trong đó, nam chiếm 57,5%, nữ chiếm 42,5% với tuổi trung bình là 47,90 ± 10,58. Chúng tôi xác định được 3 kiểu gen chính là 1, 6 và 2: kiểu gen HCV 1 chiếm 58,4%( 1: 5,8%; 1a: 6,4%; 1a/1b: 0,3%; 1b: 45,9%), tiếp theo là kiểu gen 6( toàn bộ là 6a: 23,9% ) và kiểu gen 2 là 13,1%( 2: 1,5%; 2a/2c: 11,6%). Chỉ có một trường hợp là kiểu gen 3b (0,3%). Có 14 trường hợp ( 4,3% ) không xác định được kiểu gen HCV bằng kỹ thuật LiPA, chúng tôi tiếp tục thực hiện kỹ thuật giải trình tự chuỗi (Sequencing) để xác định kiểu gen HCV (Hệ thống Trugene, Bayer) và xác định được tất cả kiểu gen của 14 trường hợp đó: Kiểu gen 1 : 2 trường hợp; 1b: 2; 2a: 1; 2c: 1; 6a: 8. Có 229 trường hợp thực hiện định lượng siêu vi C trong máu. Lượng siêu vi dao động từ 3.200 bản sao/ml (Copies/ml) đến trên 40.000.000 bản sao/ml, trung bình 6,46x106 ± 8,50x106 bản sao/ml. Kiểu gen HCV 1, 2, 6 có lượng siêu vi C trên 2x106 bản sao/ml là 91, 18, 32 trường hợp; và có lượng siêu vi C dưới 2x106 copies/ml là 46, 15, 27 trường hợp. Qua đó chúng tôi nhận thấy rằng không có sự khác nhau có ý nghĩa giữa lượng siêu vi C trong máu và kiểu gen 1, 2, 6 của siêu vi C ( p> 0,05). Summary PREVALENCE OF HCV GENOTYPES IN VIETNAM Hepatitis C virus (HCV) genotypes are distributed differently depending on geography and etiology of infection. We studied the spectrum of HCV genotypes in Vietnamese patients. The incidence of Hepatitis C virus isolates was found in clinical practice is of great clinical significance to the treatment of HCV infected patients as different subtypes may respond unequally to therapy. In our study, we performed the LiPA to identify HCV genotype and to evaluate the prevalence of HCV genotype in Vietnamese patients, and comparison of serum virus loads among patients infected with Hepatitis C Virus genotypes 1, 2 and 6. A total of 327 HCV RNA positive patients were enrolled (Male 57.5%, female 42.5% with mean age of patients 47.90 ± 10.58 years ) from April 2004 to January 2005. At the same time, we collected 229 random serums in this group to perform Branched DNA for HCVRNA quantification. The received results were genotypes 1 and 6 were the most common genotypes, followed by type 2 and the rare genotype 3 in alone patient. Genotype 1 was seen in 58.4% (Type 1: 5.8%; 1a: 6.4%; 1a/1b: 0.3%; 1b: 45.9%) while genotype 6a in 23.9%, genotype 2 in 13.1% (Type 2: 1.5%; type 2a/2c: 11.6%) and genotype 3b was in 0.3%, fourteen samples (4.3%) were unclassified. Then we performed sequencing based on 5’UT with Trugene system identified genotype 1 (2 cases), 1b (2 cases), 2a (1 case), 2c (1 case), 6a (8 cases) but not typed by LiPA. 229 patients had viral loads above 3,200 copies/ml (Range: 3,200 - > 40,000,000 copies/ml, with 6,46x106 ± 8,50x106 copies/ml ). HCV genotype 1, 2, 6 which have quantity HCV RNA above 2x106 copies/ml were in 91, 18, 32 cases, and below 2x106 copies/ml were in 46, 15, 27 cases, respectively. We observed that there’s no significant difference in virus load between patients infected with genotype 1, 2, 6 (P>0.05). I. Đặt vấn đề: Viêm gan do siêu vi C (HCV) là một bệnh nguy hiểm vì triệu chứng lâm sàng thường mơ hồ, trong khi đó hậu quả của bệnh để lại thường là nặng nề như: 50%- 80% chuyển qua mạn tính, và có tới 20%-25% bệnh nhân mạn tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan 5,12,14,18,21,25,29. Do đó, chẩn đoán chính xác tác nhân HCV là một mục tiêu quan tâm hàng đầu của các bác sĩ, từ đó mới điều trị, theo dõi diễn tiến và biến chứng của bệnh, phòng ngừa sự lây lan của HCV. Cho đến nay, vấn đề điều trị đặc hiệu siêu vi gây viêm gan C vẫn còn nhiều khó khăn cũng như tốn kém về mặt thời gian và tiền bạc. Đồng thời gần như chỉ có một lựa chọn duy nhất của thuốc đặc trị là Interferon, mà tùy theo mỗi thế hệ của thuốc sẽ làm cho bệnh nhân phải gánh chịu thêm một số khó khăn trong dùng thuốc chích cũng như tác dụng phụ của thuốc1,6,18,19,21,27. Do đó, đối với một bệnh nhân có chỉ định điều trị đặc hiệu cho siêu vi viêm gan C thì trước khi bắt đầu điều trị phải làm xét nghiệm 2 yếu tố quan trọng có vai trò tiên lượng cho thành công cũng như thời gian cần thiết của điều trị là kiểu gen của siêu vi gây viêm gan C ( HCV genotype) và định lượng siêu vi trong máu5,11,14,25; Và một vài chỉ số khác như SGOT, SGPT, siêu âm, … Kiểu gen HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước có những kiểu gen HCV vượt trội riêng4,5,7,8,10,12,15,27. Do đó, chúng tôi sử dụng kỹ thuật LiPA ( Là một kỹ thuật sinh học phân tử) để xác định kiểu gen HCV ở người Việt Nam với mục đích phục vụ cho việc điều trị đặc hiệu cũng như khảo sát kiểu gen nào của HCV chiếm chủ yếu ở người Việt Nam. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng ứng dụng kỹ thuật bDNA để định lượng HCV trong máu và thử tìm mối liên hệ giữa kiểu gen của HCV và số lượng siêu vi C trong máu: Có hay không sự khác nhau của số lượng siêu vi C giữa các kiểu gen khác nhau1,3,7,9. Mục tiêu của nghiên cứu này là: (1) Xác định kiểu gen của HCV ở người Việt Nam; (2) Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật LiPA trong việc xác định kiểu gen HCV ở người Việt Nam; (3) Khảo sát mối liên hệ giữa kiểu gen HCV và số lượng siêu vi C trong máu. II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 1. Đối tượng nghiên cứu. Các bệnh nhân Việt Nam đã được chẩn đoán nhiễm HCV đến thực hiện kiểu gen HCV và định lượng HCV tại trung tâm y khoa MEDIC, từ tháng 04/2004 đến 1/2005. Có HCVRNA dương tính. 2. Phương pháp nghiên cứu. 2.1. Thực hiện LiPA. Xác định HCVRNA: Kỹ thuật nested PCR (Khếch đại DNA đích bằng PCR tổ). Ly trích RNA dựa theo qui trình Chomozynski: Ly trích RNA bằng Phenol– chloroform. Thực hiện tổng hợp cDNA trên máy luân nhiệt của Bio-Rad, theo chương trình sau: 25oC/5 phút, 42oC/30 phút, 85oC/5 phút, Sau đó tiến hành phản ứng nested PCR trên máy luân nhiệt ( Bio-Rad), theo chu kỳ nhiệt sau : 95oC/5 phút; 94oC/ 30 giây, 70oC/30 giây, 20 chu kỳ; 94oC/30 giây, 55oC/30 giây, 72oC/ 1 phút, 40 chu kỳ; 72oC cho 10 phút; Sau đó giữ ở 4oC. Chúng tôi sử dụng các hóa chất và thuốc thử sau đây để thực hiện RT và PCR: Enzym Reverse Transcriptase (Pharmacia), Enzym Taq polymerase (Pharmacia), dNTP (Pharmacia), Primer NP & OP ( Trên vùng 5’UT của HCV, Bayer), MgCL2, MnCL2. Điện di phân tích kết quả trên thạch agarose 2%, kích thước sản phẩm PCR dài 240 cặp base (bp), chụp hình bằng hệ thống Gel Doc của Bio-Rad. Thực hiện quá trình lai các sản phẩm PCR đã có ( Với Primer NP & OP có gắn Biotin của Bayer) với các que (strip) của bộ thuốc thử LiPA . Trên các que có các vạch gắn sẵn các đoạn dò (Probes) chuyên biệt cho từng kiểu gen của HCV, sau khi lai sẽ đọc kết quả theo bảng hướng dẫn được cung cấp bởi nhà sản xuất (Bayer). 2.2. Định lượng HCV. Kỹ thuật: Branched DNA( Khếch đại tín hiệu). Thuốc thử dùng cho kỹ thuật là của Bayer, thế hệ 3. Thực hiện trên máy System 340 bDNA Analyzer, Bayer. 2.3. Men gan: SGOT, SGPT. Kỹ thuật thực hiện theo phương pháp động học (Kinetic), đo ở bước sóng l=360 nm. Thuốc thử của hãng Waco, Nhật. Thực hiện trên máy Hitachi 747. 2.4. Phương pháp nghiên cứu: Tiền cứu cắt ngang. 3. Thống kê: Phần mềm SPSS for Win, Ver. 7.5. III. Kết quả: 1. Tổng số có 327 trường hợp thực hiện LiPA để xác định kiểu gen HCV. Tuổi nhỏ nhất là 19, lớn nhất là 79 với độ tuổi trung bình là 47,90±10,58. Nam có 188 trường hợp ( 57,5%) với độ tuổi trung bình là 47,22±11,35; nữ có 139 trường hợp ( 42,5%) với độ tuổi trung bình là 48,81±9,39. 2. Kiểu gen của HCV trong 327 trường hợp của bệnh nhân Việt Nam. Bảng 1. Ki ểu gen HCV 1 1a 1a/1b 1b 2 2a/2c 3b 6a Không đ ịnh kiểu gen được Tổng Số lượng 19 21 1 150 5 38 1 78 14 327 Phần trăm 5,8% 6,4% 0,3% 45,9% 1,5% 11,6% 0,3% 23,9% 4,3% 100% 3. Khảo sát sự thay đổi men gan trong 327 trường hợp nhiễm HCV có HCVRNA(+). Sự thay đổi của SGOT: Nhỏ nhất là 13, lớn nhất là 308 U/L, với giá trị trung bình là 53,95±45,56 U/L. Sự thay đổi của SGPT: Nhỏ nhất là 10, lớn nhất là 390 U/L, với giá trị trung bình là 53,31±51,15 U/L. Bảng 2. Kiểu gen 1 Kiểu gen 2 Kiểu gen 3 Kiểu gen 6 Không định kiểu gen được SGOT 61±52 U/L 42±34 U/L 121 U/L 45±32 U/L 36±18 U/L SGPT 60±58 U/L 41±41 U/L 115 U/L 46±38 U/L 35±23 U/L 4. Tổng cộng có 229 trường hợp thực hiện đồng thời kiểu gen HCV và định lượng siêu vi C trong máu. Tuổi nhỏ nhất là 19, lớn nhất là 77 với độ tuổi trung bình 47,92±10,56. Nam có 135 trường hợp (59%) với độ tuổi trung bình 47,49±11,44. Nữ có 94 trường hợp (41%) với độ tuổi trung bình 48,54±9,18. Bảng 3. ³ 2x106 bản sao/ml < 2x106 bản sao/ml P Kiểu gen 1 91 46 Kiểu gen 2 18 15 Kiểu gen 6 32 27 P= 0,183 Số lượng siêu vi viêm gan C ( Bản sao/ml) trong các kiểu gen 1, 2 và 6. Bảng 4. Kiểu gen 1 Kiểu gen 2 Kiểu gen 6 Tổng cộng Trung bình 7,058x106 7,145x106 4,701x106 6,463x106 SD 9,075x106 9,805x106 5,779x106 8,497x106 Tổng cộng 137 33 59 229 IV. Bàn luận: 1. Kiểu gen HCV. Có 2 cách để xác định loại HCV: Phương pháp gián tiếp là phương pháp miễn dịch, nghĩa là qua phản ứng kháng nguyên kháng thể ta sẽ xác định được kiểu của kháng thể, từ đó biết được type huyết thanh của siêu vi C (HCV serotype); Và phương pháp trực tiếp dựa trên sự phân tích trực tiếp trên gen của siêu vi C để xác định kiểu gen của siêu vi C (HCV genotype)2,15. Trước đây, tại phòng xét nghiệm của chúng tôi có thực hiện kỹ thuật miễn dịch trong xác định type huyết thanh siêu vi C. Ưu điểm của kỹ thuật này là đơn giản, không sợ nguy cơ ngoại nhiễm và có thể thực hiện hoàn toàn trên máy tự động. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn ít nhiều nhược điểm như không định được chi kiểu (subtype), không biết được tình trạng bệnh nhân có hay không có HCVRNA (Tình trạng siêu vi đang tăng sinh để điều trị đặc hiệu), ở bệnh nhân bị ức chế hay suy giảm miễn dịch sẽ không có anti HCV từ đó không xác định được loại HCV, không phân biệt được giữa anti HCV nhiễm trước đây còn tồn tại và loại HCV đang nhiễm…1,3,4,7Và một điều cực kỳ quan trọng là sự phù hợp giữa type huyết thanh và kiểu gen vẫn còn nhiều khác [...]... và kết quả x c định kiểu gen bằng LiPA không phù hợp nhau, điều này c ng đã đư c nhiều nghiên c u trư c đó x c nhận2,7,23 2 Đánh giá hiệu quả c a kỹ thuật LiPA trong vi c x c định kiểu gen HCV ở người Vi t Nam Đoạn gen để phân tích kiểu gen HCV là 5’ UT: C phù hợp ở Vi t Nam không? Cho đến nay, để th c hiện chính x c kiểu gen HCV là phải phân tích trên đoạn Core ho c NS5B c a bộ gen HCV4,15,16 Vì... đích để phân tích kiểu gen c a kỹ thuật LiPA) sẽ c như c điểm là không x c định đư c một số kiểu gen HCV mới như kiểu gen 7, 8, 9 Và trong kỹ thuật LiPA thì c c kiểu gen mới này ( Kiểu gen 7, 8, 9), là những kiểu gen hay gặp ở c c nư c vùng Đông Nam Á, sẽ bị phân loại lầm ( Misclassify) thành kiểu gen 1b4,8,15,16 Đây c thể xem là như c điểm lớn nhất c a LiPA trong x c định kiểu gen HCV ở người Vi t... PCR tổ cao nhờ sử dụng 2 c p mồi đ c hiệu để khuếch đại); Và nhờ vi c dùng 2 c p mồi một l c cùng với điều kiện lai nghiêm ngặt nên kỹ thuật này c độ đ c hiệu rất cao5,24.Ngoài ra, LiPA x c định đư c c c kiểu gen và chi kiểu thường gặp c a HCV; M c kh c trang thiết bị c a kỹ thuật này giống như c a một phòng xét nghiệm cho PCR bình thường, và bộ thu c thử c ng c sẵn cho nên rất thuận tiện cho c c. .. theo c c nhóm t c giả kh c nhau2,23 Do đó, chúng tôi đã tiến hành th c hiện kỹ thuật LiPA như một xét nghiệm thường qui trong x c định kiểu gen c a siêu vi viêm gan C Cho đến nay, LiPA vẫn là một trong những kỹ thuật sinh h c phân tử đư c sử dụng rộng rãi trên thế giới trong vi c x c định kiểu gen c a siêu vi viêm gan C5 ,10,15 Kỹ thuật này đạt đư c độ nhạy cao nhờ ứng dụng kỹ thuật PCR tổ ( Độ nhạy c a. .. 2 (13,1%) Nếu phân loại ở m c độ chi kiểu thì chiếm chủ yếu ở Vi t Nam là kiểu gen 1b (45,9 %) Kết quả này c ng phù hợp với c c nghiên c u trư c đây về kiểu gen HCV ở bệnh nhân là người Vi t Nam4 ,15,17,20,26 ( Xem bảng so sánh) T c giả- Địa Số điểm Kiểu Kiểu Kiểu Không Ghi chú trường gen 1 gen 1b gen 6a định kiểu gen hợp đư c T.K.Anh TP 42 47,6% 23,8% o 9,6% Primer-Specific HCM N.T.Hảo Hà 123 69,8%... kiểu gen 1b c a bệnh nhân vùng Đông Nam Á tốt hơn bệnh nhân da trắng Đồng thời, đáp ứng điều trị c a c c kiểu gen 7, 8, 9 thì tốt hơn kiểu gen 1b4,15 Tuy nhiên, vấn đề kiểu gen mới và đáp ứng điều trị đ c hiệu c a nó c n phải nghiên c u thêm , đ c biệt là bệnh nhân người Vi t Nam Trong 327 trường hợp th c hiện LiPA c a chúng tôi, c 14 trường hợp (4,3%) không x c định đư c kiểu gen HCV5 Mẫu c a c c. .. nhiên, c n nghiên c u thêm về c c kiểu gen 7, 8, 9 là những kiểu gen mới hay gặp ở Đông Nam Á c ng như đáp ứng với điều trị đ c hiệu Trong nghiên c u c a chúng tôi chưa thấy c mối liên quan giữa số lượng siêu vi C và kiểu gen HCV Với kỹ thuật LiPA: 4,3% không định đư c kiểu gen HCV, và tất c c c trường hợp đó đều x c định đư c kiểu gen bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi, do đó c thể giải trình tự chuỗi... hợp đó đư c tiếp t c th c hiện giải trình tự chuỗi c a HCV trên hệ thống Trugene ( Bayer) để x c định kiểu gen HCV, và tất c đều x c định đư c kiểu gen với kỹ thuật giải trình tự chuỗi: 2 trường hợp kiểu gen 1; 2 trường hợp kiểu gen 1b; 1 trường hợp kiểu gen 2a; 1 trường hợp kiểu gen 2c; 8 trường hợp kiểu gen 6a Như vậy, kỹ thuật giải trình tự chuỗi c thể thích hợp hơn cho x c định kiểu gen HCV, nhưng... nghiệm lâm sàng th c hiện như một kỹ thuật thường qui Kỹ thuật LiPA x c định đư c 6 kiểu gen và 16 chi kiểu thường gặp c a HCV12,24 Trong thời gian từ tháng 04/2004 đến tháng 1/2005 chúng tôi th c hiện kiểu gen HCV cho 327 trường hợp bệnh nhân người Vi t Nam Kết quả bảng 1 cho thấy kiểu gen HCV chủ yếu ở người Vi t Nam là kiểu gen 1 ( Chiếm 58,4%), tiếp theo là kiểu gen 6 (23,9%), và kiểu gen 2 (13,1%)... c a lượng siêu vi tùy thu c vào kiểu gen HCV không c ý nghĩa thống kê (P >0.05): Kiểu gen 1 không c nghĩa là luợng siêu vi C nhiều hơn ở kiểu gen 2 & 6 và ngư c lại7,9 Qua bảng 4 c ng cho ta thấy trị số trung bình c ng như độ lệch chuẩn (SD) c a số lượng siêu vi C giữa c c kiểu gen 1, 2 và 6 không c sự kh c biệt rõ rệt 4 Sự thay đổi c a men gan ( SGOT, SGPT) Tăng men gan ( SGOT, SGPT) thường là dấu . KIỂU GEN C A SIÊU VI VIÊM GAN C Ở VI T NAM Tóm tắt Kiểu gen c a siêu vi gây vi m gan C (HCV genotype) phân bố kh c nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu l c hay mỗi nư c có những kiểu gen. kiểu gen HCV ở người Vi t Nam với m c đích ph c vụ cho vi c điều trị đ c hiệu c ng như khảo sát kiểu gen nào c a HCV chiếm chủ yếu ở người Vi t Nam. Bên c nh đó, chúng tôi c ng ứng dụng kỹ thuật. nghiên c u này là: (1) X c định kiểu gen c a HCV ở người Vi t Nam; (2) Đánh giá hiệu quả c a kỹ thuật LiPA trong vi c x c định kiểu gen HCV ở người Vi t Nam; (3) Khảo sát mối liên hệ giữa kiểu gen