Nội dung của bài viết trình bày về viêm gan siêu vi C - nguyên nhân chủ yếu dẫn đến xơ gan và ung thư gan, có nguy cơ gây tử tử vong cao, xác định tỉ lệ các kiểu gene và dưới týp (subtype) của siêu vi viêm gan C và mối liên quan với giới tính, nhóm tuổi, tải lượng siêu vi HCV ‐ RNA ở bệnh nhân viêm gan siêu vi C.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 TỈ LỆ PHÂN BỐ KIỂU GENE CỦA SIÊU VI VIÊM GAN C Nguyễn Hiền Minh*, Lý Khánh Vân*, Lý Văn Xn* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Viêm gan siêu vi C (HCV) là ngun nhân chủ yếu dẫn đến xơ gan và ung thư gan, có nguy cơ gây tử vong cao. Việc xác định chính xác kiểu gene (genotype) của HCV có giá trị quan trọng trong chỉ định điều trị. Về mặt kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử, ở thời điểm hiện nay các phương pháp xác định kiểu gene của HCV ở Việt Nam hầu hết vẫn dựa vào vùng 5’NC. Kỹ thuật xác định genotype này có sự nhầm lẫn giữa genotype 1 và genotype 6, đưa đến kết quả geustype 1 chiếm ưu thế. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỉ lệ các kiểu gene và dưới týp (subtype) của siêu vi viêm gan C và mối liên quan với giới tính, nhóm tuổi, tải lượng siêu vi HCV‐RNA ở bệnh nhân viêm gan siêu vi C. Phương pháp nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu cắt ngang mơ tả. Đối tượng nghiên cứu là các mẫu huyết thanh của bệnh nhân đã xác định anti‐HCV dương tính, được thực hiện tại phòng xét nghiệm sinh học phân tử ở cơng ty Nam Khoa Biotek trong thời gian từ tháng 06 năm 2012 đến tháng 1 năm 2013. Kỹ thuật xác định kiểu gene siêu vi viêm gan C bằng giải trình tự vùng NS5B. Kết quả: Trong tổng số 390 trường hợp nghiên cứu, HCV genotype 6 chiếm tỉ lệ cao nhất với 216 trường hợp (55,4%), kế đến là genotype 1 với 111 trường hợp (28,5%), genotype 2 chiếm tỉ lệ 15,6% và genotype 3 chiếm tỉ lệ thấp nhất là 0,5%.Genotype 1 có hai subtype là 1a và 1b; genotype 2 có hai subtype là 2a và 2b; genotype 3 có hai subtype 3a và 3b; genotype 6 có mười subtype là 6a, 6c, 6e, 6f, 6h, 6k, 6l, 6n, 6o, và 6p. Khơng có mối liên quan giữa các genotype HCV với giới tính và nhóm tuổi. Tải lượng siêu vi trung bình của nam giới cao hơn tải lượng siêu vi trung bình của nữ giới (P=0,036). Có mối liên quan giữa tải lượng siêu vi trung bình và các genotype HCV. Tải lượng siêu vi ngưỡng thấp chiếm ưu thế tuy nhiên khơng có sự khác biệt giữa các genotype HCV. Kết luận: Trong bốn genotype HCV được ghi nhận, genotype 6 chiếm tỉ lệ cao nhất. Khơng có mối liên quan giữa các genotype HCV với giới tính và nhóm tuổi. Có mối liên quan giữa tải lượng siêu vi trung bình với giới tính. Có mối liên quan giữa tải lượng siêu vi trung bình và các genotype HCV. Việc xác định genotype HCV ở người Việt Nam nên thực hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gene dựa trên vùng gene NS5B. Từ khóa: Viêm gan siêu vi, kiểu gen, giải trình tự vùng NS5B ABSTRACT THE DISTRIBITION PATTERN OF HEPATITIS C VIRUS GENOTYPES Nguyen Hien Minh, Ly Khanh Van, Ly Van Xuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 360 ‐ 365 Background: Hepatitis C virus (HCV) has emerged as a leading cause of chronic hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma worldwide. Genotyping and assessment of the viral load is important for designing the therapeutic strategies. HCV genotype distribution in Viet Nam has been reported. However, the identification of HCV genotype was based on 5’Non‐Coding Gene region (5’NC) but its insufficient sequence variation limits its usefulness for distinguishing certain isolates of HCV genotype 6 from isolates of genotype 1. Aims: This study was aimed to identify the distribution pattern of HCV genotypes and subtypes in chronic * Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Hiền Minh 360 ĐT: 0908445498 Email: nguyenhienminh177@yahoo.com Chuyên Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học hepatitis patients and their association with the viral load, gender and age. Methods: This is a cross‐sectional descriptive study. Anti‐HCV positive serum samples were collected at Nam Khoa Biotek Co. from June 2012 to January 2013. The Non‐Structural 5B (NS5B) region of the positive samples were subsequently amplified by RT‐PCR followed by direct sequencing and phylogenetic analysis. Results: Among three hundred and ninety HCV‐RNA positive samples, nucleotide sequencing of the NS5B showed that genotype 6 was the most prevalent genotype in this study (55.4%), followed by genotype 1 (28.5%), genotype 2 (15.6%) and genotype 3 (0.5%). Multiple HCV subtypes were successfully characterized as 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 6a, 6c, 6e, 6f, 6h, 6k, 6l, 6n, 6o, 6p. As a whole, the viral loads in male patients were higher than in female (P=0.036) and the levels of mean viral loads in most serum samples are low viral load (HCV – RNA 400.000 90 (81,1) 21 (18,9) p PR (KTC 95%) 0,61 54 (88,5) (11,5) (0,27 – 1,34) 0,469 Không xác (100,0) định 1,05 173 (80,1) 43 (19,9) (0,66 – 1,68) Nhận xét: Tải lượng siêu vi HCV – RNA trung bình là 399248,2 ± 488826 IU/mL. Giá trị trung bình của tải lượng siêu vi HCV genotype 2 cao nhất so với các genotype còn lại. Sự khác nhau về tải lượng siêu vi trung bình của các loại genotype là có ý nghĩa thống kê (p400.000 Subtype 6a 80 (89,9) (10,1) Genotype Subtype 6e 69 (72,6) 26 (27,4) Subtype khác 24 (75,0) (25,0) p PR (KTC 95%) 2,71 0,010 (1,34 – 5,45) 2,47 (1,04 – 5,86) Nhận xét: Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa phân bố tải lượng siêu vi với subtype 6a, 6e, và các subtype khác của genotype 6 (p=0,010). Subtype 6e có tải lượng siêu vi cao (>400.000UI/ml) nhiều gấp 2,71 lần subtype 6a và các subtype 6 còn lại cũng có tải lượng siêu vi cao nhiều gấp 2,47 lần subtype 6a. BÀN LUẬN Về tỉ lệ genotype HCV Tỉ lệ genotype HCV của các nghiên cứu được ghi nhận như sau: Bảng 9 Tác giả Kỹ thuật định genotype Hồ T.Đạt (2006) Hồ T Đạt (2012) Nguyễn T Bảo (2009) Trịnh H Tình (2010) Phương T Hà (2011) INNOLipa 5’NC Sequencing 5’NC Sequencing 5’NC RT Realtime PCR 5’NC RT Realtime PCR 5’NC Nhiễm 58,4% 59,98% 71% 55% 66,23% Tỉ lệ genotype HCV 13,1% 0,3% 23,9% 15,82% 0,05% 24,15% 10,3% 0,05% 18,6% 7.5% 0% 37,5% 2,19% 0% 30,7% Genotype khác 4,3%* 0,05% (4a) 0,88%* 363 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Tác giả Kỹ thuật định genotype Vũ T.T Vân (2011) Cao M Nga (2011) Phạm Đ Anh (2009) Phạm H Vân (2011) Dunfort L (2012) Chúng (2012-2013) RT Realtime PCR 5’NC RT Realtime PCR 5’NC Sequencing NS5B core Sequencing NS5B Sequencing NS5B core/E1 Sequencing NS5B 63,26% 65,6% 48,9% 30,4% 60% 28,5% Tỉ lệ genotype HCV 7,14% 0% 29,6% 15,8% 0% 15,8% 0% 5,2% 45,9% 15,2% 0% 54,4% 0,4% 1,8% 37,8% 15,6% 0,5% 55,4% Genotype khác 0,8%* * không xác định được genotype Kết quả nghiên cứu 390 trường hợp, chúng tôi ghi nhận tỉ lệ genotype 1 là 28,5% và tỉ lệ genotype 6 là 55,4% khác với kết quả nghiên cứu trước đây của các tác giả. Trong khi nghiên cứu của các tác giả khác cho thấy tỉ lệ genotype 1 dao động từ 55% đến 71%, cao hơn từ 2 đến 3 lần so với tỉ lệ của genotype 6. Sự khác biệt này có thể giải thích do kỹ thuật xác định genotype HCV của chúng tơi khác so với các nghiên cứu trước đây. Việc xác định genotype HCV trước đây thường dựa vào sự khác biệt về trình tự vùng 5’NC, tức là vùng khơng mã hóa trên bộ gene của HCV, do đó đều cho kết quả genotype 1 chiếm ưu thế. Tuy nhiên gần đây các cơng trình nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh là xét nghiệm xác định genotype HCV dựa trên sự khác biệt trình tự vùng 5’NC là khơng đủ khả năng để phân biệt được nhiều subtype của genotype 6 với genotype 1, vì vậy sẽ có khá nhiều trường hợp được xác định genotype 1 nhưng thật ra là genotype 6. Sự nhầm lẫn này có thế lên đến 40‐60%, do đó các tác giả đã khuyến cáo sử dụng giải trình tự đoạn NS5B để phân loại genotype của HCV. Do cùng thực hiện kỹ thuật giải trình tự trên vùng NS5B nên kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với cơng trình nghiên cứu của Phạm Hùng Vân với tỉ lệ HCV genotype 6 chiếm ưu thế là 55,4% ‐ kế đến là HCV genotype 1 có tỉ lệ là 28,5%. Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tơi có xác định được tỉ lệ genotype 3 là 0,5%, điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác về sự hiện diện với tỉ lệ rất thấp của HCV genotype 3 trong bệnh nhân VGSVC ở Việt Nam. 364 Về mối liên quan giữa các genotype với giới tính và nhóm tuổi Về giới tính, kết quả nghiên cứu của chúng tơi cũng như các tác giả khác đều ghi nhận khơng có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa các genetype HCV với giới tính. Về nhóm tuổi, nghiên cứu của chúng tơi ghi nhận bệnh nhân trong nhóm tuổi 40‐59 chiếm đa số (tỉ lệ 61%). Tỉ lệ nhiễm HCV nhóm tuổi 40‐59 ở genotype 1,2 và 6 là 61,3%, 64% và 60,6%. Điều này cho thấy HCV tồn tại lâu dài do có khả năng rất cao để thốt khỏi sự kiểm sốt của hệ thống miễn dịch. Hầu hết các số liệu được công bố trên thế giới cũng cho thấy rằng tần số của anti‐HCV tăng theo tuổi. Tuy nhiên chúng tôi ghi nhận khơng có mối liên quan giữa các genotype HCV và nhóm tuổi (p=0,073). Về mối liên quan giữa các genotype HCV và tải lượng siêu vi Tải lượng siêu vi HCV‐RNA trung bình trong nghiên cứu của chúng tơi là 399248 ± 488826 IU/mL. Giá trị trung bình định lượng HCV‐RNA của genotype 2 là cao nhất 6,26 x105 IU/mL, kế đến là genotype 6 (3,96 x105 IU/mL) và genotype 1 (2,67 x105 IU/mL); genotype 3 có tải lượng siêu vi trung bình thấp nhất (0,37 x105 IU/mL). Sự khác nhau về tải lượng siêu vi trung bình của các loại genotype là có ý nghĩa thống kê (p=0,037). Kết quả nghiên cứu tải lượng siêu vi theo ngưỡng cao/thấp ở genotype 1, genotype 2, genotype 3 và genotype 6 cho thấy tải lượng siêu vi thấp chiếm ưu thế (trên 80%). Chúng tơi ghi nhận khơng có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa phân bố tải lượng siêu vi cao/thấp Chun Đề Nội Khoa Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 và các genotype HCV (p=0,469). TÀI LIỆU THAM KHẢO Tuy nhiên, đối với genotype 6, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa phân bố tải lượng siêu vi ngưỡng cao/thấp và các subtype (bảng 8). Subtype 6e có tải lượng siêu vi cao nhiều gấp 2,71 lần subtype 6a. Các subtype 6 khác có tải lượng siêu vi cao nhiều gấp 2,47 lần subtype 6a. Như vậy dự đốn khả năng đáp ứng với điều trị của bệnh nhân có subtype 6a sẽ tốt hơn so với các subtype khác của genotype 6, nhất là genotype 6e. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 390 trường hợp về tỉ lệ phân bố kiểu gene siêu vi viêm gan C bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene NS5B cho thấy: ‐ Trong bốn genotype HCV được ghi nhận, genotype 6 chiếm tỉ lệ cao nhất. ‐ Genotype 1 có hai subtype là 1a và 1b với tỉ lệ tương ứng là 54,1% và 45,9%.Genotype 2 có hai subtype là 2a và 2b với tỉ lệ tương ứng là 96,7% và 3,3%.Genotype 3 có một subtype 3a và một subtype 3b.Genotype 6 có mười subtype là 6a, 6c, 6e, 6f, 6h, 6k, 6l, 6n, 6o, và 6p trong đó chiếm tỉ lệ cao là subtype 6e (44%), subtype 6a (41,2%), và subtype 6l (6%); các subtype khác chiếm tỉ lệ rất thấp (dưới 3%). ‐ Khơng có mối liên quan giữa các genotype HCV với giới tính và nhóm tuổi. 10 11 Nghiên cứu Y học European Association for the Study of the Liver (2011). EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology, 50(2), pp.245‐264. Retrieved from http://www.easl.eu/_clinical‐practice‐guideline Hisada M, Chatterjee N, Zhang M, Battjes RJ, Goedert JJ (2003). ʺIncreased hepatitis C virus load among injection drug users infected with human immunodeficiency virus and human T lymphotropic virus type IIʺ. J Infect Dis., 188(6), pp.891‐897. Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Thanh Tòng và cs (2006). ʺKiểu gen của siêu vi viêm gan C ở Việt Namʺ. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 10(1), tr.28‐34. Nguyen MH, Trinh HN, Ruel Garcia, et al. (2008). ʺHigher rate of sustained virologic response in chronic hepatitis C genotype 6 treated with 48 weeks versus 24 weeks of peginterferon plus ribavirinʺ. Am. J. Gastroenterol, 103(5), pp.1131‐1135. Nguyễn Thanh Bảo, Phạm Hùng Vân. (2009). ʺÁp dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT Realtime‐PCR vùng 5ʹNC để làm xét nghiệm định kiểu gen HCVʺ. Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 13(1), tr.242‐ 247. Phạm DA, Leuangwutivong P, Jittmittraphap A (2009). ʺHigh prevalence of Hepatits C Virus genotype 6 in Viet Namʺ. AsianPac. J. Allergy Immunol, 27(2), pp.153‐160. Phạm Hồng Phiệt, Đơng Thị Hồi An, Lý Trần Thụy Vi (2012). ʺỞ phía Nam Việt Nam, phần lớn HCV‐GT1 xác định bằng vùng 5ʹUTR thực ra là thuộc HCV‐GT6 khi xác định vùng NS5Bʺ. Tạp chí Gan mật Việt Nam, Số 20, tr.7‐12. Phạm Hùng Vân, Võ Đức Xuyên An (2012). ʺCập nhật khả năng các xét nghiệm sinh học phân tử trong viêm gan siêu vi mạn tínhʺ. Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, Tập 16(3), tr.8‐19. Phạm Thị Thu Thủy, Hồ Tấn Đạt (2011). ʺThời gian điều trị tối ưu đối với bệnh nhân viem gan siêu vi C mạn tính genotype 6ʺ. Tạp chí Gan mật Việt Nam, Số 16, tr.38‐39. Phương Thị Hà (2011). Xác định kiểu gen virus viêm gan C trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan C bằng kỹ thuật sinh học phân tử Realtime‐PCR. Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội: Luận văn Thạc sĩ Vi sinh vật học. Trương Thái Phương (2008). Nghiên cứu đặc điểm nhiễm virus viêm gan C ở bệnh nhân chạy thận nhân tạo tại Bệnh viện Bạch Mai. Đại học Y Hà Nội: Luận văn Thạc sĩ Y học. Pham HV, Nguyen HDP, Ho PT, et al (2011). ʺVery high prevalence of Hepatitis C Virus Genotype 6 Variants in Southern Viet Nam: large scale survey based on sequence determinationʺ. Jpn. J. Infect. Dis, 64, pp.537‐539. ‐ Có mối liên quan giữa tải lượng siêu vi trung bình với giới tính và với các genotype HCV. 12 ‐ Có mối liên quan giữa tải lượng siêu vi theo ngưỡng cao/thấp với các subtype của genotype 6: tỉ lệ subtype 6e và các subtype 6 khác có tải lượng siêu vi ngưỡng cao nhiều hơn so với subtype 6a. Ngày nhận bài báo: 18/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014 Nhiễm 365 ... Sau hơn 20 năm kể từ khi siêu vi vi m gan C (Hepatits C virus = HCV) đư c khám phá, bệnh vi m gan siêu vi C (VGSVC) trở thành vấn đề y tế tồn c u và là ngun nhân hàng đầu c a c c bệnh về gan. Hiện nay vi c điều trị bệnh VGSVC ... giảm bớt chi phí điều trị c ng như c c t c dụng phụ c a thu c, góp phần nâng cao chất lượng cu c sống c a bệnh nhân VGSVC. M c tiêu nghiên c u M c tiêu tổng qt X c định tỉ lệ c c kiểu gene c a siêu vi vi m ... X c định tỉ lệ c c kiểu gene c a siêu vi vi m gan C và mối liên quan với giới tính, nhóm tuổi, tải lượng siêu vi HCV‐RNA. M c tiêu c thể ‐ X c định tỉ lệ phân bố c c genotype HCV c a bệnh nhân VGSVC