Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển háo đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú

Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển háo đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

-♣♣♣ -

PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN

NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM TRONG BÙN ĐÁY

Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản nước Mặn, Lợ

Mã số: 62 62 70 05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Cần Thơ, 2012

Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Thủy Sinh học Ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp

PGS TS Trương Quốc Phú

Phản biện 1: TS LƯU HỒNG MẪN

Phản biện 2: TS LÊ HỒNG PHƯỚC

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn cấp Nhà nước, họp tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc: giờ ngày tháng năm 2012

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Trung tâm Học liệu Trường Đại học Cần Thơ

- Thư viện Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của đề tài

Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng nuôi tăng nhanh

nhất trong hoạt động nuôi thủy sản trên thế giới Sự phát triển nhanh của nghề nuôi tôm biển đã mang lại việc làm cho người dân và tạo nguồn thu nhập ngoại tệ của nhiều quốc gia Tuy nhiên, hệ lụy của tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp đã dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh, do vậy nghề nuôi tôm biển đã gặp những trở ngại lớn Sản lượng tôm nuôi của nhiều quốc gia suy giảm, ảnh hưởng lớn đến đời sống kinh tế của nhiều dân cư Để giải quyết vấn đề này chất hoá học và kháng sinh đã được sử dụng trong hoạt động nuôi tôm

(Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund và Bengtsson, 2001) Việc

sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến sự kháng thuốc (Weston, 1996) Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất khẩu không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật và vi sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim

và ctv., 2006)

Chính vì vậy giải pháp trong phòng trị bệnh đã và đang được đặt ra bao gồm việc quản lý bệnh, địch hại tổng hợp (Li, 2008), đặc biệt là việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích (probiotic) nhằm cải thiện môi trường nuôi và tăng năng suất vật nuôi Đây là một giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng để quản lý vi sinh trong ao nuôi thâm canh, hạn chế tối đa thuốc kháng sinh để bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, hạn chế đáng kể lượng chất hữu cơ thải ra môi trường góp phần phát triển nghề nuôi thủy sản một cách bền vững Việc nghiên cứu chọn lựa các dòng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao trong giai đoạn hiện

nay nhằm nâng cao hiệu quả nuôi thủy sản, hạn chế sự ô nhiễm môi trường thúc đẩy và tăng cường sự bền vững của

nghề nuôi Từ những nguyên nhân trên mà đề tài "Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm trong bùn đáy ao nuôi

tôm sú (Penaeus monodon)” đã được thực hiện

2 Mục tiêu của đề tài

Nghiên cứu thành lập bộ chủng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc từ các ao nuôi tôm sú thâm canh nhằm bổ sung bộ sưu tập

vi khuẩn làm cơ sở khoa học trong việc chọn lựa các dòng vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm vi sinh

3 Nội dung của luận án

- Sưu tập và định danh các nhóm vi khuẩn phân hủy hữu

cơ, chuyển hoá đạm phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh qua một chu kỳ nuôi

- Xác định biến động các yếu tố môi trường và yếu tố vi sinh vật qua một chu kỳ nuôi

- Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của nhóm vi phân lập và vai trò của chúng trong ương nuôi tôm trong bể ở qui mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Luận án đã bổ sung bộ sưu tập những dòng vi khuẩn hữu ích có hiệu quả xử lý nước tốt trong nuôi tôm và những kết luận khoa học về ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn này lên sự thay đổi các chỉ tiêu chất lượng nước và tăng trưởng của tôm

sú vào nguồn cơ sở dữ liệu khoa học chung về ứng dụng vi khuẩn hữu ích, làm cơ sở để phục vụ cho nghề nuôi tôm sú phát triển bền vững

5 Những điểm mới của luận án

- Luận án đã chọn lọc, định danh và đánh giá được hiệu quả cải thiện chất lượng nước của một số loài vi khuẩn hữu ích từ

ao nuôi tôm sú thâm canh

- Luận án đã đi sâu tìm hiểu động thái của quần thể vi khuẩn trong ao, cũng như các biến động chất lượng môi trường trong ao nuôi thâm canh thông qua một chu kỳ nuôi

- Luận án đã xác định loài vi khuẩn B cereus là loài có

nguồn gốc trong ao và không phải là loài có trong chế phẩm vi

sinh (B subtilis và B licheniformis)

- 6 loài vi khuẩn là B subtilis (B41), B cereus (B8, B9, B37, B38) và B amyloliquefaciens (B67) có thể được sử dụng

sản xuất chế phẩm vi sinh

6 Bố cục của luận án

Chương 1: Giới thiệu 6 trang

Chương II: Lược khảo tài liệu 40 trang

Chương III: Phương pháp nghiên cứu 30 trang

Chương IV: Kết quả và Thảo luận 79 trang

Chương V: Kết luận và kiến nghị 2 trang

Danh mục các công trình của tác giả 1 trang

Tài liệu tham khảo 21 trang

(g ồm 298 tài liệu, trong đó 34 tài liệu tiếng việt và 264 tài

li ệu tiếng nước ngoài)

Phụ lục 33 trang

2 Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sống của tôm

3 Hiện trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong nuôi tôm thâm canh

4 Các chất độc sinh ra từ quá trình phân hủy chất thải trong ao nuôi thâm canh (NH3, H2S và NO2-)

5 Xử lý ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh học

6 Vai trò của vi khuẩn phân hủy hữu cơ

7 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus

8 Các quá trình chuyển hoá nitơ vô cơ và vai trò các

nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas và Nitrobacter)

9 Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

10 Kỹ thuật giải trình tự nucleotid trong ADN

11 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn trong NTTS

Từ tổng quan tài liệu cho thấy chưa có công trình nào nghiên cứu hoàn chỉnh về quần thể vi khuẩn phân hủy hữu cơ

và chuyển hóa đạm trong ao nuôi tôm sú thâm canh, đặc biệt

là xác định được các vi khuẩn hữu ích chiếm ưu thế trong ao nuôi tôm thâm canh có nguồn gốc từ tự nhiên Tất cả các nghiên cứu trên là cơ sở để hướng tới việc quản lý chất lượng nước bằng biện pháp sinh học, làm cơ sở để phục vụ cho nghề nuôi tôm sú phát triển bền vững

Hồ Chí Minh

2.2 Đối tượng nghiên cứu:

Tôm sú (Penaeus monodon) giai đoạn ấu trùng và tôm thương phẩm, vi khuẩn Bacillus sp., Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp

2.3 Chu kỳ thu mẫu

Chu kỳ thu mẫu được thực hiện trước và sau khi thả tôm một ngày Sau đó giữ chu kỳ thu mẫu 2 tuần/lần cho đến khi kết thúc vụ nuôi (5,5 tháng)

2.4 Đặc điểm ao nuôi, chế độ chăm sóc tôm và bón vi sinh trong ao thu mẫu

2.5 Các bước chuẩn bị trước khi thu mẫu

2.6 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.6.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

2.6.2 Môi trường và hóa chất

2.7 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn trong ao

2.7.1 Phương pháp thu mẫu nền đáy (Somsiri et al., 2006)

Mẫu bùn được thu bằng hệ thống ống PVC đã được tiệt trùng bằng dung dịch cồn 70% Mẫu được giữ lạnh bằng nước

đá và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 3 - 5 giờ, sau đó được bảo quản ở 4 °C và xử lý trong vòng 2 giờ

2.7.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

2.7.2.1 Phương pháp phân lập và định danh Bacillus sp a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus :

Môi trường phân lập Bacillus dựa theo Harwood và

Archibald (1990) Cách tiến hành phân lập dựa theo Nguyễn Lân Dũng (1983) Phương pháp cấy chuyền và lưu trữ vi khuẩn (thực hiện theo phương pháp của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2004))

b) Phương pháp định danh Bacillus sp

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa

Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh các chủng vi

khuẩn phân lập được dựa theo Andretta et al., (2004)

Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử

(1) Đối với các chủng vi khuẩn B8, B37, B41 và B67, mẫu

vi khuẩn sinh dưỡng đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng được gửi đến Công ty Nam Khoa - để thực hiện phản ứng PCR và định danh với cặp mồi chung: 16F (5’-TCCAGAGTTTCATCCTGGCTGAC-3’) và 16R (5’-TACCGCGCCTGCTCGCTG-3’)

(2) Đối với hai chủng vi khuẩn B9 và B38 thực hiện quy trình trích ADN, phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen của bán đơn vị nhỏ 16S rRNA của vi khuẩn bằng cặp mồi 16F8 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16R1391 (5’-

GACGGGCGGTGWGTRCA-3’) (Eden et al 1991, Lane,

1991, trích dẫn bởi Kaspari, 2010) Các thí nghiệm này được thực hiện tại viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ theo các bước sau:

- Trích ADN (dựa theo phương pháp của Boon et al., (2002))

- Ki ểm tra chất lượng ADN sau khi trích (Trần Nhân Dũng,

2011)

- Khu ếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR

a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Nitrosomonas sp

Môi trường ammonium-calcium-carbonate được sử dụng

để phân lập vi khuẩn Nitrosomonas sp dựa theo phương pháp

của Ehrlich, 1975 Nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas sp

được thực hiện theo Lewis và Pramer (1958) và MacDonad và Spokes (1980)

b) Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrosomonas sp Định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh

hóa gồm 2 phép thử:

- Ki ểm tra khả năng khử NH 3 thành NO 2

- của nhóm vi khuẩn AOB: thuốc thử Griess - Ilosvay được sử dụng để kiểm tra khả năng chuyển hóa từ NH3 thành NO2- của nhóm vi khuẩn oxi hóa ammonium (AOB) sau khi đã nuôi tăng sinh

- Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp

nhu ộm Gram

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

- Phương pháp trích và kiểm tra chất lượng ADN được tiến

hành theo các bước như đối với vi khuẩn Bacillus sp (mục

2.7.2.1)

- Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR: phản

ứng PCR được thực hiện để khuếch đại vùng gen mục tiêu của gen 16S rRNA amoA với cặp mồi AmoA 1F: 5’-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3’ và 2R: 5-CCC CTC KGS AAA GCC

TTC-3’ (Rotthauwe et al., 1997)

- Giải trình tự DNA định danh loài: sản phẩm PCR của các

chủng vi khuẩn được gửi đến Phòng xét nghiệm Nam Khoa -

BIOTEK để thực hiện định danh

2.7.2.3 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn

Nitrobacter sp

a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Nitrobacter sp

Môi trường nitrite-calcium-carbonate sử dụng cho phân lập

vi khuẩn Nitrobacter sp dựa trên phương pháp của Ehrlich,

1975 Môi trường Aleem và Alexander, 1960 được sử dụng để

nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrobacter

b) Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrobacter sp

Định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh

sử dụng để kiểm tra khả năng chuyển hóa từ NO2- thành NO3của nhóm vi khuẩn NOB sau khi đã nuôi tăng sinh

- Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp

nhu ộm Gram

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

- Phương pháp trích và kiểm tra chất lượng ADN được tiến

hành theo các bước như đối với vi khuẩn Bacillus sp (mục

2.7.2.1)

- Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR: thực

hiện phản ứng PCR với primer PNGT 1F: 5’- TTT TTT GAG ATT TGC TAG - 3’ PNTG 2R: 5’- CTA AAA CTC AAA GGA ATT TGA - 3’ là mồi chuyên biệt để nhận diện nhóm

Nitrobacter (Degrange và Bardin, 1995) để khuếch đại vùng gen mục tiêu của gen 16S rRNA của nhóm vi khuẩn

Nitrobacter sp

- Gi ải trình tự ADN định danh loài: được thực hiện tại Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

2.8 Phương pháp xác định biến động chất lượng nước và vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú

2.8.1 Phương pháp thu mẫu và xác định chất lượng nước

và bùn đáy ao

2.8.1.1 Phương pháp thu mẫu

Nhiệt độ, pH, độ mặn được đo tại hiện trường Các chỉ tiêu TAN, TSS, NO2-, NO3-, TN, H2S được thu và bảo quản lạnh (4

°C) DO được cố định tại chỗ bằng hóa chất

2.8.1.2 Phương pháp phân tích chất lượng nước

Tất cả các chỉ tiêu môi trường được phân tích theo phương

pháp chuẩn (APHA, et al., 1995) Các hóa chất được sử dụng

trong phân tích có xuất xứ từ Đức (Merck)

2.8.1.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

a) Xác định mật độ Mật độ vi khuẩn tổng số và Vibrio bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (Baumann et al., 1980)

Môi trường Tripticase Soya Agar (TSA) thêm 1,5% NaCl

và môi trường Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS) được sử dụng để xác định mật độ vi khuẩn tổng và Vibrio Mật số vi khuẩn được tính bằng công thức: Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU/g bùn) = số khuẩn lạc trung bình × độ pha loãng × 10

b) Xác định mật độ Bacillus sp dựa theo phương pháp của

Nguyễn Lân Dũng, 1983; Harwood và Archibald, 1990 Sử dụng môi trường thạch chuyên biệt cho xác định mật độ vi

khuẩn Bacillus Mật độ vi khuẩn được tính như công thức đã

trình bày ở trên

c) Xác định mật độ Nitrosomonas và Nitrobacter (Ehrlich,

1975)

Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê

sự phân bố vi khuẩn trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha

loãng khác nhau Sau đó dựa vào bảng thống kê Mac Crady để suy ra giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu

Đơn vị tính mật độ của 2 nhóm Nitrosomonas và Nitrobacter là MPN/g

2.9 Các thí nghiệm đánh giá hiệu quả xử lý nước của vi khuẩn chọn lọc

2.9.1 Thanh lọc vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn thuộc ba nhóm Bacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp được thanh lọc để chọn ra

chủng có khả năng phân hủy hữu cơ, TAN, NO2- tốt nhất

2.9.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm được kiểm soát là như nhau

ở tất cả các nghiệm thức

2.9.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn B37, S8 và N10 lên ấu trùng tôm sú trong hệ thống ương tuần hoàn

2.9.3.1 Vật liệu thí nghiệm

Loài vi khuẩn được chọn bổ sung vào hệ thống thí nghiệm

bao gồm B37 (B cereus), S8 (N nitrosa) và N10 (N winogradskyi)

2.9.3.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với mật độ vi khuẩn

Bacillus lần lượt là 106 (NT1), 105 (NT2), 104 CFU/mL (NT3)

và nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn (ĐC) Trong hệ thống lọc tuần hoàn còn bổ sung thêm vi khuẩn

Nitrosomonas và Nitrobacter (mật độ 104 MPN/mL trên mỗi loài) Các bể ương được nối với bể lọc tuần hoàn ở giai đoạn Mysis 1, hệ thống lọc được vận hành cho đến khi kết thúc thí nghiệm Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

Ấu trùng tôm ở giai đoạn Nauplius bố trí với mật độ 150 ấu trùng/L Mẫu được thu 3 ngày/lần với các chỉ tiêu bao gồm:

pH, nhiệt độ, TAN, NO3-, NO2-, COD, DO, TSS, TN, H2S và

mật độ vi khuẩn Thí nghiệm được kết thúc khi ấu trùng chuyển sang giai đoạn PL7

2.9.3.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn

a) Nuôi tăng sinh vi khuẩn Bacillus

Môi trường nuôi tăng sinh là môi trường Luria Bertani (LB, Hình 3.7) Mật độ vi khuẩn đậm đặc được xác định bằng

phương pháp đo OD tại bước sóng 600 nm (Leonel et al

2006)

b) Nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter

Hai dòng vi khuẩn S8 và N10 được nuôi tăng sinh trong

môi trường lỏng cho giống Nitrosomonas theo Lewis và

Pramer (1958) và MacDonad và Spokes (1980) và cho giống

Nitrobacter theo Aleem và Alexander (1960)

2.9.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi

Các chỉ tiêu môi trường như pH, DO, COD, TSS, TAN,

NO2-, NO3- và TN, và các chỉ tiêu vi khuẩn như mật độ vi

khuẩn tổng số , Vibrio, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter đã

được theo dõi (3 ngày/lần) cho đến kết thúc thí nghiệm Chỉ tiêu tỉ lệ sống của tôm được xác đinh ở giai đoạn Zoae3,

Mysic2, Postlarvae 1 và Poslarvae 7

2.9.3.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu chất lượng

nước (APHA et al (1995))

Hình 3.7 Nuôi tăng sinh vi khuẩn và hệ thống thí nghiệm

2.9.3.6 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn (xem

2.8.1.3)

2.9.3.7 Phương pháp phân tích mẫu tôm

T ỉ lệ sống (%) = Số ấu trùng * 100/Số lượng ấu trùng bố trí

2.9.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B9, B41, B67 lên

chất lượng nước bể nuôi tôm sú

2.9.4.1 Vật liệu thí nghiệm

Ba loài vi khuẩn B9 (B cereus), B41 (B

amyloliquefaciens ) và B67 (B subtilis) đã được bố trí vào bể

nuôi tôm sú Tôm giống thí nghiệm có nguồn gốc từ trại giống

Cần Thơ Nguồn bùn được lấy từ ao nuôi tôm sú tại huyện

Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng

2.9.4.2 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức: Nghiệm

thức 1 (ĐC): không cấy vi khuẩn Nghiệm thức 2 (B41): cấy vi

khuẩn B amyloliquefaciens) Nghiệm thức 3 (B67): cấy vi

khuẩn B subtilis Nghiệm thức 4 (B9): cấy vi khuẩn B cereus

105 - 106 CFU/mL / nghiệm thức Mỗi bể được bố trí một lớp

bùn từ 4 - 5 cm ở đáy bể Mật độ thả tôm 30 con/m2 Mỗi

nghiệm thức được lặp lại 3 lần Trong suốt quá trình thí

nghiệm, mẫu vi khuẩn được thu trước khi bổ sung vi khuẩn và

tiếp theo định kỳ 2 tuần thu mẫu một lần cho đến khi kết thúc

thí nghiệm

2.9.4.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn (xem 2.9.3.3)

2.9.4.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn (xem

2.9.3.6)

2.9.4.5 Phương pháp thu và phân tích chất lượng nước

(APHA et al (1995))

2.9.4.6 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm

Tôm được cho ăn thức ăn công nghiệp Grow Feed 5

lần/ngày (06, 10, 14, 18, 22 giờ) Khối lượng tôm được xác

định lúc bắt đầu thí nghiệm và kết thúc

2.9.4.7 Phương pháp phân tích mẫu tôm

Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của

tôm dựa theo các tác giả Robertson et al (2000), Felix và

Sudharsan (2004); Venkat et al (2004)

2.9.5 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B8, B37, B38 lên

chất lượng nước bể nuôi tôm sú

2.9.5.1 Vật liệu thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí trong 12 bể composite thể tích 500

L Ba loài vi khuẩn B cereus (B37), B cereus (B38), và B cereus (B8) được chọn thí nghiệm Tôm giống có khối lượng

trung bình là 1 g/con Nước biển 100‰ có nguồn gốc từ Vĩnh Châu (Sóc Trăng), được pha với nước máy để đạt độ mặn 16‰

5 lần/ngày Mẫu được thu trước khi bổ sung vi khuẩn và định

kỳ 5 ngày một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm

2.9.5.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn (xem 2.9.3.3) 2.9.5.4 Các chỉ tiêu theo dõi (xem 2.9.4.4 và 2.9.4.5)

2.9.6 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý với chương trình Excel và phần mềm Statistica 6.0 Tất cả các số liệu đều được kiểm tra tính đồng nhất và phân phối chuẩn trước khi đưa vào xử lý One-way ANOVA Sự khác biệt giữa các nghiệm thức được kiểm tra bằng phép thử Duncan ở mức ý nghĩa 0,05

Chương 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm

3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus

3.1.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus

Đã thu thập được 67 chủng (B1 - B67) Tất cả các chủng này được lưu trữ trong thạch nghiêng ở 4°C và trong glycerol ở nhiệt độ -80°C tại khoa Thủy sản

3.1.1.2 Định danh vi khuẩn Bacillus

a) Định danh bằng phép thử sinh lý, sinh hóa

Hình d ạng khuẩn lạc: dạng hình tròn, hơi rìa, khuẩn lạc

phẳng, bề mặt nhẵn hoặc hơi nhăn, màu trắng đục đến hơi

vàng Tế bào vi khuẩn Bacillus Gram dương, có dạng hình que

ngắn, hoặc que dài tùy thuộc vào các loài khác nhau

K ết quả nhuộm bào tử: các tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn

Bacillus có hiện tượng hình thành bào tử sau 24 giờ phát triển trên bề mặt môi trường thạch Quan sát các mẫu vi khuẩn

Bacillus đã nhuộm bào tử trên kính hiển vi cho thấy bào tử bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào

vi khuẩn bắt màu hồng của Safranin

Sau khi kiểm tra và đánh giá lại 67 chủng vi khuẩn đã thu thập được dựa trên quan sát hình dạng, đặc điểm, màu sắc, kích thước và thời gian phát triển của khuẩn lạc trên môi trường thạch cũng như hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm bào tử đã loại bỏ các chủng vi khuẩn trùng lặp giữa các ao và các đợt thu mẫu Đồng thời thực hiện các thí nghiệm xác định khả năng hình

thành nội bào tử và phản ứng catalase dương tính đặc trưng

của các loài thuộc giống Bacillus Kết quả xác định được 9

chủng vi khuẩn khác nhau (B2, B6, B7, B8, B9, B37, B38, B41, B67) Chín chủng vi khuẩn này được thanh lọc với mục đích chọn ra chủng có khả năng phân hủy hữu cơ tốt nhất, nên chỉ có 6/9 chủng vi khuẩn được chọn lọc (B8, B9, B37, B38, B41 và B67) Các chủng này được trữ trên môi trường thạch nghiêng ở 4ºC và trong glycerol ở -80°C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 4.1: Hình dạng vi khuẩn Bacillus

a Khuẩn lạc Bacillus b Tế bào Bacillus (vật kính 100 X) C Bào tử Bacillus (vật kính 100 X)

b) Định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- K ết quả nhận diện vi khuẩn Bacillus bằng kỹ thuật PCR

Hai chủng B9 và B38 đều có sản phẩm PCR ở vị trí 1.500

bp dựa theo thang chuẩn (Hình 4.3a) Đối với 4 chủng vi khuẩn còn lại B8, B37, B41 và B67, sản phẩm PCR có kích thước nằm trong khoảng 500 - 600 bp dựa trên thang chuẩn (Hình 4.3b)

- Kết quả giải trình tự 6 chủng vi khuẩn Bacillus

Bảng 4.3: Kết quả so sánh trình tự của các dòng Bacillus đã phân lập

Kí

Max score

Total score

Max ident

Accession number

- Max score: s ự giống nhau giữa trình tự các nuleotide đang kiểm tra với

các trình t ự khác trong cơ sở dữ liệu

- Total score: t ổng số điểm của tất cả các cặp điểm số cao HSP (hight

scoring pairs) trong cùng trình t ự của cơ sở dữ liệu

- Max identity: % đồng hình cao nhất của tất cả các cặp điểm số cao HSP được xác định khi so sánh các cặp được cho điểm cao trong cùng 1 cơ sở dữ

li ệu trình tự

- Accession number: S ố gia nhập vào cơ sở dữ liệu

3.1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrosomonas

3.1.2.1 Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas

Kết quả đã phân lập được 8 chủng vi khuẩn Nitrosomonas,

ký hiệu mẫu được liệt kê từ S5 - S12 Các chủng vi khuẩn này được lưu trữ trong môi trường nuôi tăng sinh dạng lỏng (Lewis

và Pramer, 1958) và lắc trên máy lắc Bên cạnh đó mẫu còn trữ ở tủ đông ở nhiệt độ -80 °C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2.2 Định danh vi khuẩn Nitrosomonas

Định danh bằng phép thử sinh hóa

Kết quả nhuộm Gram cho thấy các chủng này thuộc Gram

âm, hình que ngắn Mặt khác kết quả khảo sát khả năng khử ammonium cho thấy tất cả các chủng này đều có khả năng khử mạnh ammonium ở giai đoạn 10 ngày nuôi Theo mô tả về hình dạng vi khuẩn của một số tác giả (Meicklejohn, 1950; Engel và Alexander, 1958; Watson và Mandel, 1997) kết hợp với các kết quả nghiên cứu của Lewis và Pramer (1958),

Heselsoe et al (2001) và Hoàng Phương Hà và ctv (2008) cho

thấy các chủng vi khuẩn đã phân lập đều thuộc nhóm

Nitrosomonas sp

Hình 4.5: Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa Nitrosomonas sp

a Môi tr ường phân lập

Nitrosomonas d ương tính với

- K ết quả phản ứng PCR

Sản phẩm PCR của cả 3 dòng vi khuẩn S6, S8 và S12 đều

nằm ở vị trí khoảng 400 bp dựa trên thang chuẩn (Hình 4.6)

a

Điều này chứng tỏ 3 chủng vi khuẩn trên thuộc loài vi khuẩn

Nitrosomonas sp

1 2 3 4 5 M

Hình 4.6: Kết quả điện di PCR ứng dụng qui trình PCR định

danh vi khuẩn Nitrosomonas

Gi ếng M: thang ADN 200 bp (Fermentas); Giếng 1: Đối chứng âm; Giếng

2: S6; Gi ếng 3: S8; Giếng 4, 5: S12

- Kết quả giải trình tự 3 chủng vi khuẩn Nitrosomonas

Bảng 4.9: Kết quả so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn

Nitrosomonas phân lập

Kí

hiệu Mô tả loài score Max Total score ident Max Accession number

S6 Nitrosomonadaceae 3CC11 432 814 99% FJ561357

S8 Nitrosomonas nitrosa 409 409 99% AF272404.1

S12 Nitrosomonas nitrosa 499 499 99% AF272404.1

3.1.3 Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrobacter

3.1.3.1 Phân lập vi khuẩn Nitrobacter

Kết quả đã phân lập được 8 chủng Nitrobacter có khả năng oxy hóa nitrite trong môi trường nitrite-calcium-carbonate Ký

hiệu mẫu được liệt kê từ N5 - N12 Các chủng vi khuẩn này được lưu trữ trong môi trường Aleem và Alexander, (1960) và lắc trên máy lắc Bên cạnh đó mẫu còn trữ ở tủ đông ở nhiệt

độ -80 °C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.3.2 Định danh vi khuẩn Nitrobacter

Định danh bằng các phép thử sinh lý, sinh hóa

400 bp

200 bp