Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển háo đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú

Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển háo đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ♣♣♣ - PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN CHUYỂN HOÁ ĐẠM TRONG BÙN ĐÁY AO NI TƠM SÚ (Penaeus monodon) Chun ngành: Ni trồng Thủy sản nước Mặn, Lợ Mã số: 62 62 70 05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Cần Thơ, 2012 i Cơng trình hồn thành Bộ mơn Thủy Sinh học Ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp PGS TS Trương Quốc Phú Phản biện 1: TS LƯU HỒNG MẪN Phản biện 2: TS LÊ HỒNG PHƯỚC Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn cấp Nhà nước, họp Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc: ngày tháng năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Trung tâm Học liệu Trường Đại học Cần Thơ - Thư viện Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ ii KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN Tính cấp thiết đề tài Tơm sú (Penaeus monodon) đối tượng nuôi tăng nhanh hoạt động nuôi thủy sản giới Sự phát triển nhanh nghề nuôi tôm biển mang lại việc làm cho người dân tạo nguồn thu nhập ngoại tệ nhiều quốc gia Tuy nhiên, hệ lụy tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp dẫn đến tình trạng nhiễm mơi trường dịch bệnh, nghề nuôi tôm biển gặp trở ngại lớn Sản lượng tôm nuôi nhiều quốc gia suy giảm, ảnh hưởng lớn đến đời sống kinh tế nhiều dân cư Để giải vấn đề chất hoá học kháng sinh sử dụng hoạt động nuôi tôm (Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund Bengtsson, 2001) Việc sử dụng thuốc kháng sinh không cách dẫn đến kháng thuốc (Weston, 1996) Mặt khác sản phẩm thủy sản xuất không đạt tiêu chuẩn dư lượng thuốc kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim ctv., 2006) Chính giải pháp phòng trị bệnh đặt bao gồm việc quản lý bệnh, địch hại tổng hợp (Li, 2008), đặc biệt việc sử dụng vi sinh vật hữu ích (probiotic) nhằm cải thiện mơi trường ni tăng suất vật nuôi Đây giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng để quản lý vi sinh ao nuôi thâm canh, hạn chế tối đa thuốc kháng sinh để bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, hạn chế đáng kể lượng chất hữu thải mơi trường góp phần phát triển nghề nuôi thủy sản cách bền vững Việc nghiên cứu chọn lựa dịng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc địa phương làm sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh cần thiết có ý nghĩa thực tiễn cao giai đoạn nhằm nâng cao hiệu nuôi thủy sản, hạn chế ô nhiễm môi trường thúc đẩy tăng cường bền vững nghề nuôi Từ nguyên nhân mà đề tài "Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm bùn đáy ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon)” thực Mục tiêu đề tài Nghiên cứu thành lập chủng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú thâm canh nhằm bổ sung sưu tập vi khuẩn làm sở khoa học việc chọn lựa dịng vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm vi sinh Nội dung luận án - Sưu tập định danh nhóm vi khuẩn phân hủy hữu cơ, chuyển hố đạm phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh qua chu kỳ nuôi - Xác định biến động yếu tố môi trường yếu tố vi sinh vật qua chu kỳ nuôi - Đánh giá khả cải thiện chất lượng nước nhóm vi phân lập vai trị chúng ương ni tơm bể qui mơ phịng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Luận án bổ sung sưu tập dòng vi khuẩn hữu ích có hiệu xử lý nước tốt nuôi tôm kết luận khoa học ảnh hưởng dòng vi khuẩn lên thay đổi tiêu chất lượng nước tăng trưởng tôm sú vào nguồn sở liệu khoa học chung ứng dụng vi khuẩn hữu ích, làm sở để phục vụ cho nghề nuôi tôm sú phát triển bền vững Những điểm luận án - Luận án chọn lọc, định danh đánh giá hiệu cải thiện chất lượng nước số lồi vi khuẩn hữu ích từ ao nuôi tôm sú thâm canh - Luận án sâu tìm hiểu động thái quần thể vi khuẩn ao, biến động chất lượng môi trường ao nuôi thâm canh thông qua chu kỳ ni - Luận án xác định lồi vi khuẩn B cereus lồi có nguồn gốc ao khơng phải lồi có chế phẩm vi sinh (B subtilis B licheniformis) - loài vi khuẩn B subtilis (B41), B cereus (B8, B9, B37, B38) B amyloliquefaciens (B67) sử dụng sản xuất chế phẩm vi sinh Bố cục luận án Chương 1: Giới thiệu trang Chương II: Lược khảo tài liệu 40 trang Chương III: Phương pháp nghiên cứu 30 trang Chương IV: Kết Thảo luận 79 trang Chương V: Kết luận kiến nghị trang Danh mục cơng trình tác giả trang Tài liệu tham khảo 21 trang (gồm 298 tài liệu, 34 tài liệu tiếng việt 264 tài liệu tiếng nước ngoài) Phụ lục 33 trang Chương 1: TỔNG QUAN Chương tập trung vào tìm hiểu phân tích nội dung quan trọng như: Khái quát tôm sú, trạng môi trường dịch bệnh nuôi tôm sú Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sống tôm Hiện trạng ô nhiễm môi trường dịch bệnh nuôi tôm thâm canh Các chất độc sinh từ trình phân hủy chất thải ao nuôi thâm canh (NH3, H2S NO2-) Xử lý ô nhiễm môi trường phương pháp sinh học Vai trò vi khuẩn phân hủy hữu Đặc điểm sinh học vi khuẩn Bacillus Các q trình chuyển hố nitơ vơ vai trị nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas Nitrobacter) Kỹ thuật PCR ứng dụng nuôi trồng thủy sản 10 Kỹ thuật giải trình tự nucleotid ADN 11 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn NTTS Từ tổng quan tài liệu cho thấy chưa có cơng trình nghiên cứu hồn chỉnh quần thể vi khuẩn phân hủy hữu chuyển hóa đạm ao ni tơm sú thâm canh, đặc biệt xác định vi khuẩn hữu ích chiếm ưu ao nuôi tôm thâm canh có nguồn gốc từ tự nhiên Tất nghiên cứu sở để hướng tới việc quản lý chất lượng nước biện pháp sinh học, làm sở để phục vụ cho nghề nuôi tôm sú phát triển bền vững Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian thu mẫu từ tháng 3/2008 đến tháng 8/2008 ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng Thời gian phân tích mẫu từ tháng 3/2008 đến tháng 10/2008 Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Thời gian định danh vi khuẩn từ tháng 8/2009 - 8/2011 Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Công ty Nam khoa, TP Hồ Chí Minh 2.2 Đối tượng nghiên cứu: Tôm sú (Penaeus monodon) giai đoạn ấu trùng tôm thương phẩm, vi khuẩn Bacillus sp., Nitrosomonas sp Nitrobacter sp 2.3 Chu kỳ thu mẫu Chu kỳ thu mẫu thực trước sau thả tôm ngày Sau giữ chu kỳ thu mẫu tuần/lần kết thúc vụ nuôi (5,5 tháng) 2.4 Đặc điểm ao ni, chế độ chăm sóc tơm bón vi sinh ao thu mẫu 2.5 Các bước chuẩn bị trước thu mẫu 2.6 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 2.6.1 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 2.6.2 Mơi trường hóa chất 2.7 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn ao 2.7.1 Phương pháp thu mẫu đáy (Somsiri et al., 2006) Mẫu bùn thu hệ thống ống PVC tiệt trùng dung dịch cồn 70% Mẫu giữ lạnh nước đá chuyển phịng thí nghiệm vịng - giờ, sau bảo quản °C xử lý vòng 2.7.2 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn 2.7.2.1 Phương pháp phân lập định danh Bacillus sp a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus: Môi trường phân lập Bacillus dựa theo Harwood Archibald (1990) Cách tiến hành phân lập dựa theo Nguyễn Lân Dũng (1983) Phương pháp cấy chuyền lưu trữ vi khuẩn (thực theo phương pháp Đặng Thị Hoàng Oanh ctv (2004)) b) Phương pháp định danh Bacillus sp Định danh vi khuẩn phương pháp sinh lý, sinh hóa Các tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh chủng vi khuẩn phân lập dựa theo Andretta et al., (2004) Định danh vi khuẩn phương pháp sinh học phân tử (1) Đối với chủng vi khuẩn B8, B37, B41 B67, mẫu vi khuẩn sinh dưỡng phát triển môi trường thạch nghiêng gửi đến Công ty Nam Khoa - để thực phản ứng PCR định danh với cặp mồi chung: 16F (5’TCCAGAGTTTCATCCTGGCTGAC-3’) 16R (5’TACCGCGCCTGCTCGCTG-3’) (2) Đối với hai chủng vi khuẩn B9 B38 thực quy trình trích ADN, phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen bán đơn vị nhỏ 16S rRNA vi khuẩn cặp mồi 16F8 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) 16R1391 (5’GACGGGCGGTGWGTRCA-3’) (Eden et al 1991, Lane, 1991, trích dẫn Kaspari, 2010) Các thí nghiệm thực viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ theo bước sau: - Trích ADN (dựa theo phương pháp Boon et al., (2002)) - Kiểm tra chất lượng ADN sau trích (Trần Nhân Dũng, 2011) - Khuếch đại vùng gen mục tiêu phản ứng PCR - Kiểm tra sản phẩm PCR - Giải trình tự đoạn gen khuếch đại - Phân tích số liệu 2.7.2.2 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn Nitrosomonas sp a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Nitrosomonas sp Môi trường ammonium-calcium-carbonate sử dụng để phân lập vi khuẩn Nitrosomonas sp dựa theo phương pháp Ehrlich, 1975 Nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas sp thực theo Lewis Pramer (1958) MacDonad Spokes (1980) b) Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrosomonas sp Định danh phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh hóa gồm phép thử: - Kiểm tra khả khử NH3 thành NO2- nhóm vi khuẩn AOB: thuốc thử Griess - Ilosvay sử dụng để kiểm tra khả chuyển hóa từ NH3 thành NO2- nhóm vi khuẩn oxi hóa ammonium (AOB) sau ni tăng sinh - Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram Định danh phương pháp sinh học phân tử - Phương pháp trích kiểm tra chất lượng ADN tiến hành theo bước vi khuẩn Bacillus sp (mục 2.7.2.1) - Khuếch đại vùng gen mục tiêu phản ứng PCR: phản ứng PCR thực để khuếch đại vùng gen mục tiêu gen 16S rRNA amoA với cặp mồi AmoA 1F: 5’-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3’ 2R: 5-CCC CTC KGS AAA GCC TTC-3’ (Rotthauwe et al., 1997) - Giải trình tự DNA định danh loài: sản phẩm PCR chủng vi khuẩn gửi đến Phòng xét nghiệm Nam Khoa BIOTEK để thực định danh 2.7.2.3 Phương pháp phân lập định danh vi khuẩn Nitrobacter sp a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Nitrobacter sp Môi trường nitrite-calcium-carbonate sử dụng cho phân lập vi khuẩn Nitrobacter sp dựa phương pháp Ehrlich, 1975 Môi trường Aleem Alexander, 1960 sử dụng để nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrobacter b) Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrobacter sp Định danh phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh hóa gồm phép thử - Kiểm tra khả khử NO2- thành NO3- nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB): thuốc thử Griess - Ilosvay sử dụng để kiểm tra khả chuyển hóa từ NO2- thành NO3của nhóm vi khuẩn NOB sau ni tăng sinh - Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn phương pháp nhuộm Gram Định danh phương pháp sinh học phân tử - Phương pháp trích kiểm tra chất lượng ADN tiến hành theo bước vi khuẩn Bacillus sp (mục 2.7.2.1) - Khuếch đại vùng gen mục tiêu phản ứng PCR: thực phản ứng PCR với primer PNGT 1F: 5’- TTT TTT GAG ATT TGC TAG - 3’ PNTG 2R: 5’- CTA AAA CTC AAA GGA ATT TGA - 3’ mồi chuyên biệt để nhận diện nhóm Nitrobacter (Degrange Bardin, 1995) để khuếch đại vùng gen mục tiêu gen 16S rRNA nhóm vi khuẩn Nitrobacter sp - Giải trình tự ADN định danh lồi: thực Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ ... bền vững nghề nuôi Từ nguyên nhân mà đề tài "Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hố đạm bùn đáy ao ni tôm sú (Penaeus monodon)” thực Mục tiêu đề tài Nghiên cứu thành lập chủng vi khuẩn hữu ích... thể vi khuẩn phân hủy hữu chuyển hóa đạm ao nuôi tôm sú thâm canh, đặc biệt xác định vi khuẩn hữu ích chiếm ưu ao ni tơm thâm canh có nguồn gốc từ tự nhiên Tất nghiên cứu sở để hướng tới vi? ??c... danh vi khuẩn chuyển hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm 3.1.1 Phân lập định danh vi khuẩn Bacillus 3.1.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus Đã thu thập 67 chủng (B1 - B67) Tất chủng lưu trữ thạch nghiêng