NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA GÂY VIÊM PHỔI Ở LỢN

–––––––––––––––––– LÊ VĂN DƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI TRONG HỘI CHỨ

––––––––––––––––––

LÊ VĂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN

ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI TRONG

HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN

TẠI BẮC GIANG, BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

THÁI NGUYÊN, NĂM 2013

––––––––––––––––––

LÊ VĂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN

ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI TRONG

HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN

TẠI BẮC GIANG, BIỆN PHÁP PHÕNG TRỊ

Chuyên ngành: Ký sinh trùng và vi sinh vật học Thú y

Mã số: 62 64 01 04

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Tập thể hướng dẫn khoa học: 1 GS.TS Nguyễn Quang Tuyên

2 PGS.TS Cù Hữu Phú

Thái Nguyên, năm 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn chính xác và đã được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2013

Tác giả

NCS Lê Văn Dương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiểu tổ chức và cá nhân Nhân dịp này tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, Ban quản lý Sau đại học Đại học Thái Nguyên, phòng Quản lý đào tạo Sau đại học, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo nghiên cứu sinh tại trường

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Bộ môn Vi trùng, Bộ môn Virus-Viện Thú y Quốc gia và Chi cục Thú y tỉnh Bắc Giang đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy hướng dẫn khoa học là GS.TS Nguyễn Quang Tuyên phó Viện trưởng-Viện Khoa học sự sống- Đại học Thái Nguyên và PGS.TS Cù Hữu Phú trưởng Bộ môn Vi trùng-Viện Thú y Quốc gia đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo-Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ, chia sẻ những ý kiến quý báu, hướng dẫn tôi thực hiện thí nghiệm để hoàn thiện đề tài nghiên cứu

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các học viên cao học, các em sinh viên đã đóng góp công sức, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn./

Thái Nguyên, tháng 7 năm 2013

Tác giả

NCS Lê Văn Dương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sơ lược nghiên cứu về Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS) ở lợn 4

1.1.1 Cấu trúc virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) ở lợn và các đặc tính sinh học 4

1.1.2 Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus 6

1.1.3 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 7

1.2 Vai trò của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis trong Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn 9

1.2.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn 10

1.2.2 Vi khuẩn P multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P multocida gây ra 23

1.2.3 Vi khuẩn S suis và bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn S suis gây ra 31

Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Nội dung nghiên cứu 40

2.1.1 Tình hình dịch PRRS ở lợn và kết quả chẩn đoán tại tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 40

2.1.2 Phân lập vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis ở mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang 40

2.1.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 40

2.1.4 Nghiên cứu biện pháp phòng, trị 40

2.2 Đối tượng, nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 41

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 41

2.2.2 Nguyên vật liệu 41

2.2.3 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 42

2.3 Phương pháp nghiên cứu 42

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 42

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 43

2.3.3 Phương pháp xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV và phân lập vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida, S suis 43

2.3.4 Phương pháp xác định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis 44

2.3.5 Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis 44

2.3.6 Phương pháp tính LD50 của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis trên chuột bạch 48

2.3.7 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 49

2.3.8 Phương pháp xác định độc lực trên động vật thí nghiệm 49

2.3.9 Phương pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 49

2.3.10 Xây dựng phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS 50

2.3.11 Phương pháp chế tạo Autovaccine thử nghiệm từ các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 51

2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 53

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Tình hình dịch PRRS ở lợn và kết quả chẩn đoán tại tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 54

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS tại một số huyện thuộc tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 54

3.1.2 Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS ở các loại lợn 58

3.1.3 Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS theo mùa vụ 60

3.1.4 Kết quả tổng hợp triệu chứng, bệnh tích chủ yếu ở lợn mắc PRRS và xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang 62

3.2 Kết quả phân lập A pleuropneumoniae, P multocida và S suis ở lợn dương tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang 64

3.3 Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 68

3.3.1 Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 69

3.3.2 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 77

3.3.3 Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 84

3.3.4 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được 90

3.4 Kết quả nghiên cứu biện pháp phòng, trị 96

3.4.1 Kết quả chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh viêm phổi cho lợn 97

3.4.2 Kết quả xác định độ dài miễn dịch và hiệu lực của Autovaccine ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang 107

3.4.3 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS 118

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 121

1 Kết luận 121

2 Đề nghị 122

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 123

TÀI I LIỆU THAM KHẢO 124

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

AGID : Agargel Immuno Diffuse

A pleuropneumoniae : Actinobaccillus pleuroneumoniae

BHI : Brain Heart Infusion

CAMP : Chiristie - Atkinson - Munch - Peterson

CPS : Capsule polysaccharide

DNT : Dermanecrotic toxin

ELISA : Enzyme - linked Immuno sorbant assay

H pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae

IHA : Indirect Haemagglutination test

LPS : Lypopolysaccaride

MR : Methyl red

NAD : Nicotinamide Adenine Dinucleotide

PBS : Phosphat buffer solution

PCR : Polymerase Chain Reaction

PPLO : Pleuropneumonia - like organism

P multocida : Pasteurella multocida

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRSV : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

S ta aureus : Staphylococcus aureus

S. suis : Streptococcus suis

TSA : Tryptic Soya Agar

VP : Voges Prokauer

và một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn S suis 47

Bảng 2.4: Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định serotype và

một số gen mã hoá các yếu tố độc lực của vi khuẩn S suis 48

Bảng 2.5: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại

kháng sinh (NCCLS - 2002) 50 Bảng 2.6: Thí nghiệm kiểm tra an toàn của Autovaccine trên chuột bạch 52 Bảng 3.1: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc PRRS và tử vong tại một số huyện

thuộc tỉnh Bắc Giang từ năm 2010 - 2012 55 Bảng 3.2: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS ở các loại lợn 58 Bảng 3.3: Kết quả xác định tỷ lệ lợn mắc và tử vong do PRRS theo mùa vụ 60 Bảng 3.4: Kết quả tổng hợp triệu chứng, bệnh tích chủ yếu ở lợn mắc PRRS

và xác định mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV 63

Bảng 3.5: Kết quả phân lập vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và

S suis ở mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV 67

Bảng 3.6: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng

vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập được 70

Bảng 3.7: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng

vi khuẩn P multocida phân lập được 72 Bảng 3.8: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng

vi khuẩn S suis phân lập được 74

Bảng 3.9: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng

vi khuẩn S suis phân lập được bằng hệ thống API 20 Strep 76 Bảng 3.10: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae

phân lập được bằng phản ứng AGID 77

Bảng 3.11: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn P multocida

phân lập được bằng phản ứng PCR 79

Bảng 3.12: Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn S suis phân

lập được 82

Bảng 3.13: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn A

pleuropneumoniae phân lập được 85

Bảng 3.14: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P multocida

phân lập được 87

Bảng 3.15: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân

lập được 89 Bảng 3.16: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các

chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập được 91

Bảng 3.17: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các

chủng vi khuẩn P multocida phân lập được 93

Bảng 3.18: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các

chủng vi khuẩn S suis phân lập được 94

Bảng 3.19: Kết quả tổng hợp khả năng mẫn cảm mạnh và kháng với các kháng

sinh của vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis 95

Bảng 3.20: Các chủng vi khuẩn được chọn để chế tạo Autovaccine 97 Bảng 3.21: Kết quả đếm số lượng vi khuẩn có trong canh trùng chế tạo

Autovaccine 99 Bảng 3.22: Kết quả kiểm tra thuần khiết của 3 lô canh trùng sử dụng chế tạo

Autovaccine 100 Bảng 3.23: Kết quả kiểm tra vô trùng 3 lô Autovaccine chế tạo thử nghiệm 101 Bảng 3.24: Kết quả kiểm tra an toàn của Autovaccine trên chuột bạch 102 Bảng 3.25: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine trên chuột bạch khi

công cường độc vi khuẩn A pleuropneumoniae 103

Bảng 3.26: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine trên chuột bạch khi

công cường độc vi khuẩn P multocida 104

Bảng 3.27: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine trên chuột bạch khi

công cường độc vi khuẩn S suis serotype 2 105

Bảng 3.28: Kết quả xác định hiệu lực của Autovaccine trên lợn thí nghiệm

bằng phương pháp công cường độc 108 Bảng 3.29: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn được tiêm

Autovaccine sau một tháng 110 Bảng 3.30: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể có trong máu lợn được tiêm

Autovaccine sau hai tháng 112 Bảng 3.31: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm

được tiêm Autovaccine sau ba tháng 113 Bảng 3.32: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trong máu lợn thí nghiệm

được tiêm Autovaccine sau bốn tháng 114 Bảng 3.33: Kết quả xác định tỷ lệ lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS ở vùng

tiêm và vùng không tiêm Autovaccine 116 Bảng 3.34: Nguy cơ lợn mắc viêm phổi và PRRS do không tiêm Autovaccine

so sánh giữa nhóm lợn được tiêm và nhóm lợn không tiêm 117 Bảng 3.35: Kết quả điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS 119

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: So sánh tỷ lệ lợn mắc PRRS giữa các huyện từ 2010-2012 57

Hình 3.2: So sánh tỷ lệ tử vong ở lợn do PRRS giữa các huyện từ 2010-2012 57

Hình 3.3: So sánh tỷ lệ lợn mắc PRRS giữa các loại lợn khác nhau 59

Hình 3.4: So sánh tỷ lệ tử vong ở lợn do PRRS giữa các loại lợn khác nhau 59

Hình 3.5: So sánh tỷ lệ lợn mắc PRRS giữa vụ Đông - Xuân và Hè - Thu 61

Hình 3.6: So sánh tỷ lệ tử vong ở lợn do PRRS giữa vụ Đông - Xuân và Hè -Thu 61

Hình 3.7: Tỷ lệ phân lập được vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis ở mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PRRSV 68

Hình 3.8: Tỷ lệ lưu hành serotype của các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập được 78

Hình 3.9: Tỷ lệ lưu hành serotype của các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được 80

Hình 3.10: Kết quả phản ứng PCR xác định serotype vi khuẩn P multocida 81

Hình 3.11: Tỷ lệ lưu hành serotype của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được 83

Hình 3.12: Kết quả phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn S suis 84

MỞ ĐẦU

Theo thống kê, tính đến tháng 4 năm 2012 tỉnh Bắc Giang có tổng đàn lợn khoảng 1.168.182 con Trong đó, đàn lợn nái là 182.780 con, lợn thịt là 983.862 con và có trên 550 trại chăn nuôi lợn tập trung [9] Chăn nuôi lợn ở Bắc Giang phát triển mạnh đã từng bước góp phần xóa đói, giảm nghèo và tạo ra sản phẩm có sức cạnh tranh trên thị trường Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi thì dịch bệnh cũng phát sinh, lây lan và gây thiệt hại lớn về kinh

tế Một trong những bệnh thường xảy ra trong những năm gần đây là bệnh Tai xanh hay Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrom - PRRS) PRRS là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn ở mọi giống và lứa tuổi, năm 2010 toàn tỉnh đã có 101.371 con mắc bệnh, chết và tiêu hủy 24.171 con Dịch xảy ra trên 956 thôn của 151/230 xã, phường, thị trấn [8] Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn do một loại ARN virus gây ra tấn công và diệt các đại thực bào ở phổi (40%) dẫn đến hiện tượng suy giảm sức

đề kháng ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn khác gây bệnh nên thường gây thiệt hại nặng nề đối với ngành chăn nuôi lợn Đối với lợn nái, PRRS gây hậu quả nghiêm trọng như sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết non; tình trạng bệnh âm ỷ gây rối loạn sinh sản như động dục kéo dài, chậm động dục trở lại Đối với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lượng tinh dịch, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Nguyễn Bá Hiên

và cs, 2013) [13] Các nghiên cứu trong nước cho thấy khi lợn mắc PRRS thường gặp các loại vi khuẩn gây bệnh kế phát trong đường hô hấp như

Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis serotype 2, Bordetella bronchiseptica (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan,

2007 [22]; Bùi Quang Anh và cs, 2008 [2]; Cù Hữu Phú, 2011 [28]) đã làm cho dịch trầm trọng với bệnh lý nặng, kéo dài và tỷ lệ lợn mắc bệnh, chết cao nhưng chưa được nghiên cứu cụ thể Để làm rõ mối quan hệ giữa các vi khuẩn

Actinobacillus pleuropneumoniae (A pleuropneumoniae), Pasteurella multocida

(P multocida), Streptococcus suis (S suis) gây bệnh ghép với PRRS và làm cơ

sở khoa học cho việc xây dựng các biện pháp phòng, chống PRRS và bệnh viêm phổi ở lợn do các vi khuẩn ghép với PRRS, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Actinobacillus

pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis gây viêm phổi trong Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn tại Bắc Giang, biện pháp phòng trị”

* MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn A pleuropneumoniae,

P multocida và S suis gây viêm phổi ở lợn mắc PRRS

- Nghiên cứu chế tạo Autovaccine phòng bệnh viêm phổi cho lợn từ các

chủng A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được

- Đề xuất và thử nghiệm các phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS có hiệu quả

* Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Là công trình nghiên cứu có hệ thống về đặc tính sinh vật, hóa học của các

chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây bệnh viêm phổi

- Bổ sung và làm phong phú dữ liệu khoa học, làm tài liệu tham khảo

dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây bệnh viêm phổi ghép ở lợn mắc PRRS

* Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Sử dụng Autovaccine tiêm phòng cho lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang đã góp

phần giảm trầm trọng dịch PRRS, giảm tỷ lệ lợn mắc viêm phổi do vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis gây ra

- Sử dụng phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS có hiệu quả cao góp phần nâng cao số lượng và chất lượng đàn lợn nuôi tại Bắc Giang

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để xây dựng các biện pháp phòng, trị bệnh cho lợn đạt hiệu quả

* NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Làm rõ vai trò gây viêm phổi của các vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis ở lợn mắc PRRS

- Autovaccine chế tạo từ các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida và S suis phân lập được có hiệu quả phòng bệnh viêm phổi cho lợn,

làm giảm trầm trọng dịch PRRS và được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại tỉnh Bắc Giang

- Xác định được các phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi và PRRS đạt hiệu quả cao

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC NGHIÊN CỨU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN (PRRS) Ở LỢN

1.1.1 Cấu trúc virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) ở lợn và các đặc tính sinh học

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn do virus thuộc họ

Arteriviridae, giống Nidovirales có cấu trúc dạng chuỗi đơn ARN Dựa vào phân

tích cấu trúc gen người ta đã xác định được hai nhóm virus Nhóm I gồm các virus thuộc chủng Châu Âu (gọi là virus Lelystad) gồm nhiều phân nhóm đã được xác định Nhóm virus này được Wensvoort và cs (1991) [155] thuộc Viện Thú y Trung ương - Lelystad - Hà Lan phân lập được trên tế bào đại thực bào phế nang của lợn và đặt tên là virus Lelystad-LV Nhóm II gồm các virus thuộc dòng Bắc Mỹ với tên gọi là VR-2332; nhóm này được Collins và cs (1992) [66] phân lập được ở lợn tại Mỹ vào năm 1992 Về mặt di truyền và tính kháng nguyên, hai nhóm virus này hoàn toàn khác nhau Sự khác nhau về cấu trúc chuỗi nucleotide của virus thuộc hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ là khoảng 40% (Han và cs, 2006) [89], do đó có ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo giữa 2 chủng này

Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tương đồng về amino acid từ 99 đến 99,7%

so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều bị mất 30 axít amin Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nước ta hiện nay thuộc dòng Bắc

Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc (Cục thú y, 2008) [7]

Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nước từ năm 2009 đến nay đã nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay được xác định thuộc chủng Bắc Mỹ dòng Trung Quốc (Lê Thanh Hòa và cs, 2009 [15]; Nguyễn Văn Cảm và cs, 2011 [6]; Cao Văn Thật và

cs, 2012 [40]; Lý Thị Liên Khai và Võ Thị Cẩm Giàng, 2012 [17])

* Cấu trúc virus

Dưới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích thước từ

45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thước từ 25 - 35 nm, trên bề mặt có gai nhô ra rõ, có vỏ là lipit (William T.Christianson và Han Soo Joo, 2001) [49]

Virus gây PRRS là ARN virus với bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn

dương, có những đặc điểm chung của nhóm Arterivirus Sợi ARN này có kích

thước khoảng 15 kilobase, có chín ORF (open reading frame) mã hoá cho chín protein cấu trúc Tuy nhiên, có sáu phân tử protein chính có khả năng trung hoà kháng thể bao gồm bốn phân tử glycoprotein, một phân tử protein xuyên màng (M) và một protein nucleocapsid (N) (Tô Long Thành, 2007) [38]

Nguyễn Bá Hiên và cs (2013) [13] cho thấy sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gen có khoảng 15 kb, mã hóa 9 ORFs Bộ gen PRRSV bao gồm hai gen polymerase là ORF1a và ORF1b và bẩy gen cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6

và 7 ORF1a và ORF1b cấu thành khoảng 75% bộ gen của virus và được đặc trưng bởi một quá trình khung ribosome chuyển dịch thành một polyprotein lớn

mà sự phân tách làm phát sinh các protein không cấu trúc (NSP) bao gồm cả RNA phụ thuộc polymerase Các khung đọc mở ORF2a, 3, 4 và 5 tất cả mã hóa cho các protein glycosyl hóa là GP2a, GP3, GP4, GP5 tương ứng Các ORF2b mới được định nghĩa mã hóa các protein nhỏ nhất của các hạt virus được chỉ định GP2b ORF7 mã hóa các protein nuclocapsid không glycosyl hóa (N)

* Đặc tính sinh học của virus

Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn mắc PRRS thường dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát Virus không gây ngưng kết với các loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của người Virus phát triển tốt trên môi trường tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra (William T.Christianson và Han Soo Joo, 2001)

[49] Tuy có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhưng các chủng virus Bắc

Mỹ và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thương đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, người ta chia ra hai nhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp Nhóm virus có độc lực cao thường gây ra các tổn thương ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp Năm 2007, Kegong Tian và Yu [109] khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho rằng virus đã có sự biến đổi

về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ lệ chết cao, trên 20% trong tổng

C virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở 37oC chịu được 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích hợp ở pH 5 -

7 Với các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit, virus dễ dàng

bị tiêu diệt Dưới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng (Tô Long Thành, 2007) [38]

* Khả năng gây bệnh của virus

Người và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm Virus có thể nhân lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng nên rất khó khống chế (Albina và cs, 1994) [50] Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả Lợn rừng là động vật mang trùng và có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên (Tô Long Thành, 2007) [38] Về độc lực, người ta thấy virus gây PRRS tồn tại dưới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng biến thể độc lực cao Dạng cổ điển có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng đàn Dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và chết nhiều (Kegong Tian, Yu, 2007) [109]

1.1.3 Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

* Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây

Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh Lợn mang trùng có thể bài thải virus trong vòng 6 tháng

Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đường hô hấp, tiêu hóa và đường âm đạo Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus là các đại thực bào ở phế nang Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt của virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong loại

tế bào này và phá hủy nó Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm giảm khả năng phòng

vệ của phổi Lúc đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng sinh của đại thực bào nhưng sau 2-3 ngày, virus này sẽ giết chết chúng, các virion được giải phòng ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác, tiếp tục quá trình nhân lên và phá hủy đại thực bào Trong cơ thể lợn ốm do mắc PRRS có tới 40% tế bào đại thực bào bị virus giết chết (William T.Christianson và Han Soo Joo, 2001) [49] Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng; cả trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu Khi đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV mở đầu cho quá trình miễn dịch không xảy ra được, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch

và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về

tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp như

Mycoplasma hyopneumoniae, P multocida, S suis, A pleuropneumoniae

Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên năm

2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thường kế phát bệnh do các nhóm vi khuẩn

đường hô hấp và đường ruột như A pleuropneumoniae, P multocida, S suis,

Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens Kết quả phân lập được

vi khuẩn A pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63,33% và thấp nhất là P multocida 10% Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm

cho dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn

* Triệu chứng

Lợn mắc PRRS thường có các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn, mẩn

đỏ da, khó thở, táo bón hoặc ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh Đặc biệt, một số con lợn mắc bệnh ở chóp tai bị ứ huyết có màu xanh tím và một số triệu chứng khác tuỳ thuộc vào bệnh kế phát và từng loại lợn

Ở lợn nái: Các triệu chứng chủ yếu là tím âm hộ, sảy thai, thai chết lưu, thai

gỗ hàng loạt, đẻ non, lợn con đẻ ra yếu ớt, tỷ lệ tử vong cao Tỷ lệ thai chết tăng lên theo độ tuổi của thai như thai dưới 2,5 tháng tuổi tỷ lệ chết 20%, thai trên 2,5 tháng tỷ lệ chết là 93,75% (Phạm Ngọc Thạch, 2007) [34] Lợn nái trong giai đoạn nuôi con thường ít uống nước, viêm vú, mất sữa, viêm tử cung âm đạo, mí mắt sưng, có thể táo bón hoặc ỉa chảy, viêm phổi

Ở lợn đực giống: Sốt cao, bỏ ăn, đờ đẫn hoặc hôn mê, một số con có hiện tượng

tai xanh Đặc biệt xuất hiện hiện tượng viêm dịch hoàn, bìu dái nóng đỏ (chiếm 95%), dịch hoàn sưng đau, lệch vị trí (85%), giảm hưng phấn Lượng tinh ít, chất lượng kém biểu hiện qua các chỉ số như nồng độ tinh trùng C< 80.106, hoạt lực của tinh trùng A< 0,6, sức kháng của tinh trùng R< 3000, tỷ lệ kỳ hình K >10%, tỷ lệ sống của tinh trùng < 70%, độ nhiễm khuẩn cao 20.103 Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản của mình (Nguyễn Như Thanh, 2007) [36]

Ở lợn choai, lợn thịt: Lợn mắc bệnh sốt cao 40oC đến 42oC, bỏ ăn, ủ rũ, khó thở, ho; những phần da mỏng gần tai, phần da bụng lúc đầu có màu hồng nhạt, dần dần chuyển sang màu hồng thẫm và xanh nhạt Lợn con mới sinh hầu như sẽ chết sau vài giờ; số còn sống sót tiếp tục chết vào tuần thứ nhất Lợn con có triệu chứng gầy yếu, bỏ bú, da xuất huyết phồng rộp, khó thở và tiêu chảy (Bùi Quang Anh và cs, 2008) [2]

* Bệnh tích

Lợn mắc PRRS bệnh tích thường thấy như thận xuất huyết lấm tấm như đầu đinh ghim; não xung huyết; hạch hầu, amidan sưng hoặc sung huyết; gan

sưng, tụ huyết; lách sưng, nhồi huyết; hạch màng treo ruột xuất huyết; loét van hồi manh tràng; phổi tụ huyết, xuất huyết, cuống phổi chứa đầy dịch nhớt, sầu bọt (Bùi Quang Anh và cs, 2008) [2]

Theo Nguyễn Tiến Dũng (2011) [10], bệnh tích đặc trưng nhất là viêm phổi

kẽ và viêm hạch lâm ba ở cả 2 dạng (PRRS dạng cổ điển và PRRS dạng sốt cao) Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám đặc chắc (nhục hóa) trên các thùy phổi Thùy phổi bị viêm có màu đỏ xám, có mủ và đặc chắc Trên mặt cắt ngang của thùy bị viêm lồi ra, khô Nhiều trường hợp lợn mắc bệnh bị viêm phế quản phổi hóa mủ ở mặt dưới thùy đỉnh

* Các biện pháp phòng bệnh

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn Để chủ động phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng, chống dịch như: phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và người dân tham gia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung ương tới các địa phương Thực hiện nghiêm việc tiêm vaccine phòng các bệnh nguy hiểm ở lợn theo Quyết định

số 63/2005/QĐ-BNN ngày 13/10/2005 của Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011) [44]

1.2 VAI TRÕ CỦA VI KHUẨN A PLEUROPNEUMONIAE, P MULTOCIDA

VÀ S SUIS TRONG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN

Trong PRRS thì vai trò của vi khuẩn kế phát là một trong những nguyên nhân quan trọng gây chết hàng loạt lợn tại các địa phương xảy ra dịch hiện nay

Do PRRSV với đích tấn công phá hủy đại thực bào, làm suy giảm miễn dịch, dẫn đến các mầm bệnh nhiễm trùng thứ phát có cơ hội trỗi dậy gây bệnh cho lợn

Trong đó, một số loại vi khuẩn thường gây bệnh viêm phổi ở lợn như A pleuropneumoniae, P multocida và S suis

1.2.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae và bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn

1.2.1.1 Vi khuẩn A pleuropneumoniae

* Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae thuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trước đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticus hay Haemophilus pleuropneumoniae đã được xác định là nguyên nhân chính gây nên

bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn Utrera và Pijoan (1991) [147] đã mô

tả A pleuropneumoniae là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thước khoảng 0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm Vi khuẩn không di động, không sinh nha

bào, có khả năng hình thành giáp mô, tuy nhiên một số chủng không có giáp mô cũng

đã được quan sát thấy Dưới kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn có nhung mao với kích thước 0,5-2 x 60-450 nm Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide được tìm

thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn A pleuropneumoniae, còn loại không có vỏ

thì ít tìm thấy hơn (Perry và cs, 1990) [133]

Moller và Kilian (1990) [121] cho biết A pleuropneumoniae là một loại vi

khuẩn khó phân lập trên các môi trường thông thường và thường phụ thuộc vào

yếu tố V Do vậy, khi nuôi cấy A pleuropneumoniae cần các môi trường giàu

dinh dưỡng Trên môi trường thạch máu vi khuẩn không phát triển trên môi trường thạch máu thông thường mà chỉ có thể mọc trên thạch máu đã được bổ

sung NAD hoặc có cấy kèm vi khuẩn Sta aureus Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc mọc xung quanh đường cấy Sta aureus với kích

thước 0,5-1 mm và hình thành một vùng dung huyết β Vùng dung huyết này thường được quan sát rõ hơn trên môi trường thạch có bổ sung 5-7 % máu cừu

Ngoài ra, vi khuẩn A pleuropneumoniae còn gây một vùng dung huyết tăng cường trong vùng dung huyết bán phần, xung quanh đường cấy Sta aureus có

độc tố dung huyết β gọi là hiện tượng CAMP (Kilian, 1976) [110] Hiện tượng

CAMP này liên quan tới sự có mặt của 3 loại độc tố của A pleuropneumoniae

bao gồm ApxI, ApxII và ApxIII

Trên môi trường TSA: Trong thành phần của môi trường này được bổ sung Yearst Extract (YE) và huyết thanh ngựa Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dưới ánh sáng đèn điện có màu xám xanh Trên môi trường thạch chocolate: Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành

khuẩn lạc nhầy, màu trắng xám Vi khuẩn A pleuropneumoniae thuộc biotype 1

có thể phân biệt được với H parasuis bởi khả năng gây dung huyết trên thạch máu khi có Sta aureus cấy kèm (Kilian và cs, 1978) [111]

* Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn A pleuropneumoniae lên men đường glucose, xylose, mannitol,

mannose và không lên men đường arabinose, lactose, raffinose, sorbitol Dương tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G; âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey (Moller và cs, 1996 [122]; Trịnh Quang Hiệp và cs, 2004 [14]; Cù Hữu Phú và cs, 2005 [27]; Đặng Xuân Bình và

cs, 2007 [3]; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010 [12])

* Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn A pleuropneumoniae từ lâu đã được nhiều nghiên cứu xác định là

nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn và được chia

thành 2 biotype chính dựa trên nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trưởng của vi

khuẩn (Pohl và cs, 1983) [136] Biotype 1 cần có NAD, còn biotype 2 thì không đòi hỏi NAD trong quá trình nuôi cấy, song vẫn cần có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2 (Pohl và cs, 1983) [136] Biotype

1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào (Perry và cs, 1990) [133] Ở biotype 2 có serotype 2; 4; 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên như biotype 1 Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 được phát hiện và được mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen và cs, 1997) [129] Blackall và cs (2002) [55] đã phát hiện ra serotype 15 thuộc biotype

1 ở 9 chủng vi khuẩn phân lập được tại Australia

* Các yếu tố độc lực

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy độc lực ở các serotype khác nhau của vi

khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn được quyết định bởi các ngoại độc tố mà

chúng sản sinh ra (Devenish và cs, 1990 [67]; Frey và Bosse, 1993 [80]; Frey, 1995a [82]) Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt, yếu tố bám dính, ngoại độc tố và một vài loại enzym có liên quan cũng

đóng vai trò quan trọng đối với độc lực của vi khuẩn A pleuropneumoniae

(Frey, 1995a) [82] Hiểu biết về thành phần và cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính, độc lực của vi khuẩn sẽ cung cấp các thông tin quan trọng, là cơ

sở khoa học cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh đặc hiệu cũng như chế tạo vaccine phòng bệnh

- Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin): Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức

độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A pleuropneumoniae phần lớn

có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn (Devenish và cs, 1990 [67]; Frey, 1995b [83])

Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên

quan đến bốn loại protein độc tố Các độc tố này được xếp vào nhóm RTX-toxin

và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI, ApxII, ApxIII (Frey và Bosse, 1993)

[80] và Apx IV (Rycroft và cs, 1991b [143]; Cho và Chae, 2001 [62]) Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau

của vi khuẩn A pleuropneumoniae (Frey, 1995a) [82]

+ ApxI là một protein có trọng lượng phân tử từ 105 -110 kDa, có độc lực cao, gây dung huyết và có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hướng đại thực bào phế nang và bạch cầu trung tính Trước kia, ApxI được đặt tên là haemolysin I (HlyI) hay cytolysin I (ClyI) (Frey và Nicolet, 1988 [77]; Kamp và cs, 1991 [106])

ApxI được tiết ra bởi A pleuropneumoniae serotype 1; 5; 9; 10 và 11 thuộc

biotype 1 (Frey, Nicolet, 1990 [78]; Kamp và cs, 1994 [107]) và serotype 14 của biotype 2 (Rayamajhi và cs, 2005 [138]) Operon mã hóa cho ApxI được xác

định là gen apxI và gồm 4 gen được sắp xếp theo thứ tự là apxIC, apxIA, apxIB,

và apxID (Gygi và cs, 1992 [88]; Jansen và cs, 1993 [104]), trong đó C là gen

hoạt hóa, A là gen quy định cấu trúc độc tố và B cùng D là hai gen mã hóa cho các protein kết hợp với màng liên quan đến sự tiết độc tố qua cả hai màng Ion Can xi (Ca2+) cần thiết cho các hoạt động sinh học của độc tố dung huyết A pleuropneumoniae (Devenish và Rosendal, 1991) [68] Phân tích protein của độc

tố ApxI cho thấy 56% tương đồng với HlyA- độc tố làm dung huyết của vi

khuẩn E coli (Femlee và cs 1985) [75] Các chủng sản sinh ra ApxI thường có độc lực cao, điều này cho thấy độc tố có liên quan đến độc lực của A pleuropneumoniae (Frey và Nicolet, 1990 [78]; Kamp và cs, 1991 [106])

+ ApxII là độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình và

có trọng lượng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey và Nicolet, 1988) [77] Trước đây ApxII được gọi là HlyII, ClyII hay CytII (Frey và Nicolet, 1990 [78]; Kamp

và cs, 1991 [106]; Frey và cs, 1992 [79]) Tất cả các serotype của A pleuropneumoniae đều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp và cs, 1991

[106]; Kamp và cs, 1994 [107]; Rayamajhi và cs, 2005 [138])

Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tương ứng Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này được tìm thấy ở tất cả các serotype của A pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3 (Frey, 1995a) [82]

+ ApxIII là độc tố không làm tan huyết, nhưng lại là độc tố dung giải tế bào mạnh với trọng lượng phân tử 120 kDa (Kamp và cs, 1991) [106] Trước kia ApxIII được đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) (Kamp và cs, 1991 [106]; Rycroft và cs, 1991a [142]; Macdonald và Rycroft, 1992 [117]; Jansen và

cs, 1992 [ 103], 1993 [104]) ApxIII được phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII do không gây dung huyết, nhưng lại gây dung giải mạnh các tế bào khác (Kamp và

cs, 1991) [106] ApxIII giống 50% với ApxI và HlyI của vi khuẩn E coli (Jansen

và cs 1993) [104] Vùng gen điều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen điều hòa (operon) cho apxI (Chang và cs,

1993) [60] Protein độc tố ApxIII được tiết ra bởi serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của

A pleuropneumoniae (Rayamajhi và cs, 2005) [138]

+ ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A pleuropneumoniae đã được

phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA (Schaller và cs, 1999) [144] Gen

ApxIVA được phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A pleuropneumoniae và

điều đó chứng tỏ nó có tính chất đặc trưng cho loài Vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ như thế nào trong quá trình gây bệnh hiện chưa được nghiên cứu kỹ, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA

trong cơ thể sống và được tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A pleuropneumoniae (Schaller và cs, 1999 [144]; Liu và cs, 2009 115)

Không có serotype nào của A pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra

cả ba loại độc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 độc tố Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII Một số lượng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một độc tố Apx như serotype 10 sản sinh ApxI, serotype 7 và serotype 12 sản sinh ApxII (Frey

và Nicolet, 1990 [78]; Kamp và cs, 1991 [106]; Frey và cs, 1992 [79], 1993 [80],

1994 [81]) Độc lực của các serotype A pleuropneumoniae thay đổi từ mức độ

mạnh đến yếu Sự thay đổi này tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra Những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thường có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố (Frey và Nicolet, 1990 [78]; Kamp và cs,

1991 [106]) Nghiên cứu của Inzana (1991) [95] cho thấy A pleuropneumoniae

serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng

xác định độc lực của vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 5 Đồng thời tác giả

đã làm thí nghiệm gây đột biến các chủng A pleuropneumoniae serotype 5 để

không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII và sau đó dùng các chủng đã đột biến làm giống gốc sản xuất vaccine cũng cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên Kết quả nghiên cứu chứng minh các độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các

chủng A pleuropneumoniae serotype 5

- Lipopolysaccharide (LPS): Lipopolysaccharide là thành phần chính của màng ngoài vi khuẩn A pleuropneumoniae, có liên quan nhiều tới quá trình

gây độc và có khả năng gây thương tổn đối với mô LPS có vai trò quan trọng trong quá trình bám dính của vi khuẩn A pleuropneumoniae lên tế bào biểu mô

và lớp màng nhầy khí quản của lợn Bám dính là hoạt động ban đầu giúp cho sự xâm nhập của vi khuẩn, rồi từ đó gây ra bệnh Belanger và cs (1990) [52] cho thấy có tới 83% các serotype với LPS mịn (smooth LPS) bám dính phần lớn vào vành khí quản, trong khi 80% các serotype với LPS bán mịn (semi-smooth LPS) bám dính yếu Điều này cho thấy LPS có thể là một nhân tố quan trọng

đối với sự tồn tại của vi khuẩn A pleuropneumoniae ở đường hô hấp trên của

lợn Ngoài ra, LPS và ngoại độc tố có khả năng tương tác làm tăng độc lực của

A pleuropneumoniae (Inzana, 1991) [95]

Thành phần heptose và glucose trong LPS của A pleuropneumoniae cao hơn so với ở một vài loài vi khuẩn Gram âm khác như E coli Jensen và Bertram (1986) [102] đã tìm thấy LPS từ vi khuẩn A pleuropneumoniae có độc lực cao

thuộc serotype 5 có nhiều galactose hơn thể phân lập không độc cùng serotype 5 LPS thành tế bào có ý nghĩa quan trọng trong việc gây ra đáp ứng miễn dịch của

vật chủ sau khi A pleuropneumoniae xâm nhiễm

- Polysaccharide vỏ vi khuẩn (Capsule polysaccharide - CPS): Vi khuẩn A pleuropneumoniae được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các

polysaccharide Lớp vỏ polysaccharide này tích điện âm và được cấu tạo bởi các đơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer Oligosaccharide gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate (Perry và cs, 1990) [133] Polysaccharide vỏ vi khuẩn là một trong những thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân

tố quyết định tính đặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward và Inzawa, 1997) [154] Polysaccharide vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trưng của hiện tượng phát ánh

ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy Lớp vỏ của A pleuropneumoniae có độ dầy từ 80 - 230 nm tùy thuộc vào các serotype khác

nhau Đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về độ dầy lớp vỏ dẫn đến sự khác

nhau về độc lực Các chủng A pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, trong

khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ Quan sát

dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng có độc lực có kích thước lớn hơn

và có lớp vỏ bám dính dầy hơn so với những chủng ít độc; lớp vỏ của vi khuẩn A pleuropneumoniae không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có vai

trò quan trọng trong chẩn đoán và dịch tễ (Inzana, 1991) [95]

Các serotype có lớp vỏ dầy có độc lực mạnh hơn so với các serotype có lớp

vỏ mỏng (Jensen và Bertram, 1986 [102]; Jacobsen và cs, 1996 98) Điều này cho thấy lớp vỏ vi khuẩn có thể là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến độc

lực của các serotype khác nhau Lớp vỏ của A pleuropneumoniae có đặc tính

chống lại thực bào và được coi là lá chắn chủ yếu của vi khuẩn chống lại hệ

thống bảo vệ của vật chủ Những chủng A pleuropneumoniae có vỏ bình thường

có khả năng kháng lại với hiện tượng tiêu diệt vi khuẩn qua trung gian bổ thể của

huyết thanh lợn khi có kháng thể đặc hiệu Ngược lại, với các chủng A pleuropneumoniae đột biến thiếu hụt vỏ thì bị tiêu diệt bởi huyết thanh bình

thường Cơ chế mà lớp vỏ vi khuẩn tạo nên sự kháng lại các hoạt tính diệt khuẩn

đã được phát hiện, cho thấy thành phần cấu thành lớp vỏ vi khuẩn không ngăn cản hoạt hóa bổ thể hay sự kết dính của C3 (một thành phần của bổ thể) lên vi khuẩn nhưng lại hạn chế lượng kháng thể và sự lắng đọng bổ thể C9 lên bề mặt

vi khuẩn trong huyết thanh bình thường (Ward và Inzana, 1994) [153]

- Các protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OMPs): Protein màng ngoài của A pleuropneumoniae có trọng lượng phân tử 43 kDa (O'Reilly

và cs, 1991 [131]; Hartmann và cs, 1995 [90]) và có thể thay đổi tùy theo hàm lượng NAD cung cấp trong môi trường nuôi cấy D'

Silva và cs (1995) [71] đã xác định được các protein mang sắt nằm trên màng ngoài, sau đó các đặc tính cùng chuỗi gen của chúng cũng được Gonzalez và cs (1995) [ 86]; Chung và cs (2007) 64 nghiên cứu xác định Vi khuẩn A pleuropneumoniae sản sinh một

vài loại protein màng ngoài (OMPs) và các protein này được cho là có vai trò

trong đáp ứng miễn dịch Hơn nữa, các kháng thể kháng OMPs của A pleuropneumoniae được chứng minh tác động như một chất opsonin quan trọng chống đại thực bào và bạch cầu đơn nhân A pleuropneumoniae có khả năng

tổng hợp hai protein mới khi được nuôi trong môi trường thiếu sắt và có các

kháng thể chống lại chúng Hiện tượng xuất hiện các polypeptid này chỉ có được

ở trong cơ thể sống Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy có một số receptor

transferrin đặc hiệu ở lợn và khả năng phát triển của A pleuropneumoniae với

transferrin vận chuyển sắt Các phân tích về mặt di truyền các yếu tố mã hóa cho receptor các protein transferrin được nhận dạng bởi hai gen nằm trên một

operon Theo quy định gen tbpB (mã hóa cho protein Tbp2 có khối lượng phân

tử dao động từ 59,8 đến 65,5 kDa) và gen tbpA (mã hóa cho protein Tbp1 với

trọng lượng chính xác 102,2 kDa) Theo các chứng minh ngược dòng trên

operon tbp gợi ý rằng các ion sắt ở môi trường điều khiển gen tbp qua protein Fur (Gerlach và cs, 1992) [84]

- Các protein thu nhận sắt: Khả năng cạnh tranh và hấp thụ sắt được xem là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của A pleuropneumoniae giúp vi

khuẩn tồn tại trong cơ thể vật chủ Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy vi

khuẩn A pleuropneumoniae có thể sử dụng transferrin của vật chủ (Gerlach và

cs, 1992 [84]; Wilke và cs, 1997 [156]) và hemoglobin (Archambault và cs 1999) [51], cũng như sử dụng các loại siderophore khác nhau của nhiều vi sinh vật khác (Diarra và cs, 1996) [70] làm nguồn cung cấp sắt cho sinh trưởng Các nghiên cứu cũng đã xác định chắc chắn có sự tồn tại của các thụ thể trên bề mặt

màng tế bào A pleuropneumoniae đặc hiệu cho các nguồn thu nhận sắt Nghiên cứu của Jacques (2004) [101] cho biết vi khuẩn A pleuropneumoniae có protein

gắn kết hemoglobin và các receptor ferric hydroxamate Chính protein gắn

transferrin đã giúp cho A pleuropneumoniae được cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây nhiễm trùng

- Các yếu tố độc lực khác: Ngoài các yếu tố độc lực chính như trên vi

khuẩn A pleuropneumoniae còn có một số thành phần khác cũng có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học, bao gồm:

+ Fimbriae là yếu tố bám dính chính lên tế bào niêm mạc đường hô hấp của

vật chủ của A pleuropneumoniae trong quá trình xâm nhập (Inzana, 1991) [95] Dưới kính hiển vi điện tử, fimbriae có đường kính từ 0,5 - 2 nm, dài từ 60 - 450

nm (Utrera và Pijoan, 1991) [147]

+ Ngưng kết tố: Hiện tượng ngưng kết hồng cầu đã được xác định ở một số

chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae phân lập được, tuy nhiên cũng có một số chủng A pleuropneumoniae không có đặc tính ngưng kết cũng đã được xác định

(Jacques và cs 1988) [99]

+ HlyX protein: Vi khuẩn A pleuropneumoniae có chứa gen hlyX (cfp) quy

định khả năng dung giải hồng cầu, biểu hiện phản ứng CAMP có mặt ở hầu hết các

chủng A pleuropneumoniae phân lập được (Macdonald và Rycroft, 1993) [118] + Protease: Vi khuẩn A pleuropneumoniae tiết ra protease có khả năng

phân giải gelatin, IgA, IgG và hemoglobin (Negrete-Abascal và cs, 1994) [126] + Enzym superoxide dismutase (SOD) là một trong những yếu tố độc lực vì

nó giúp cho vi khuẩn tồn tại trong suốt quá trình gây nhiễm Trình tự cấu trúc của enzym này đã được xác định bởi Langford và cs (1996) [113]

+ Urease: Bosses và MacInnes (2000) [56] cho thấy hoạt động của urease

góp phần vào khả năng gây nhiễm trùng của vi khuẩn A pleuropneumoniae trên

đường hô hấp của lợn và sau đó làm phát sinh bệnh Hoạt động urease cũng góp phần gây bệnh do quá trình này cung cấp cho vi khuẩn nguồn nitrogen, từ đó trực tiếp hoặc gián tiếp gây tổn thương tế bào thực bào và tế bào nội mạc của vật chủ

* Khả năng đề kháng với kháng sinh

Việc sử dụng kháng sinh không cần thiết làm cho A pleuropneumoniae kháng lại nhiều loại kháng sinh Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn A pleuropneumoniae được quyết định bởi thành phần plasmid có trong tế bào vi

khuẩn và plasmid này có trọng lượng phân tử thấp (2,3-3,6) x106 dalton Cơ sở của hiện tượng kháng này với Ampicillin là do vi khuẩn tiết ra men β-lactamase Những plasmid này không có vật liệu gen để thúc đẩy sự dẫn truyền tới vi khuẩn khác và sự xuất hiện của plasmid này gợi ý về kết quả của một quá trình chọn

lọc của vi khuẩn A pleuropneumoniae Đặc tính kháng kháng sinh có khả năng

truyền bằng plasmid (Wilson và cs, 1989) [158]

Ở Việt Nam, Trịnh Quang Hiệp và cs (2004) [14] kiểm tra khả năng mẫn

cảm với kháng sinh của 29 chủng Actinobacillus phân lập từ trại chăn nuôi lợn tập

trung thuộc công ty giống Thái Bình và Hải Phòng đã xác định các loại kháng sinh tác dụng tốt là amikacin (94,95%), amoxicilin (88,89%), rifampicin (83,33%); rồi

đến oxacillin và ceftazidine cùng là 77,78% Sự mẫn cảm với kháng sinh của A pleuropneumoniae cũng được Cù Hữu Phú và cs (2005) [27] cho biết ít mẫn cảm

nhất là kanamycin (45,45%), neomycin (50%), lincomycin (63,64%) Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) [12] khi nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các các

chủng A pleuropneumoniae phân lập được ở lợn thuộc các tỉnh miền Bắc đã cho thấy các chủng A pleuropneumoniae phân lập được mẫn cảm nhất với kháng sinh

ceftriaxone, chiếm tỷ lệ 73,01%; tiếp theo là các kháng sinh ampicillin, amoxicillin, ceftazidine lần lượt là 63,49%; 58,73% và 55,56% Một số kháng sinh đang được sử dụng nhiều có tỷ lệ kháng thuốc khá cao như lincomycin bị kháng tới 93,65%, tiếp đến là erythromycin, neomycin và gentamicin 85,71%, 80,95% và 49,21% Nghiên cứu của Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011)

[1] cho biết, các chủng A pleuropneumoniae phân lập được ở lợn mắc PRRS mẫn

cảm cao với các loại kháng sinh như florfenicol (89,47%), amoxicillin (84,21%), erythromycin (78,95%), kistasamycin (73,68%) và kháng mạnh streptomycin (100%), enrofloxacin (94,74%), colistin (94,74%), gentamicin (89,47%)

Như vậy, khả năng kháng thuốc của vi khuẩn A pleuropneumoniae khá phổ

biến, có xu hướng tăng lên về tỷ lệ và chủng loại thuốc bị kháng Do đó cần có biện pháp sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi và thú y hợp lý nhằm hạn

chế khả năng kháng thuốc của A pleuropneumoniae

1.2.1.2 Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A pleuropneumoniae

Bệnh viêm phổi - màng phổi (VPMP) ở lợn lây lan rộng và được ghi nhận ở

nhiều nước trên thế giới, nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển Bệnh có mặt và lây lan mạnh ở hầu hết các nước Châu Âu và một phần ở Mỹ, Canada, Mexico, Nam

Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc và Australia Ở Việt Nam, trong những năm gần đây A pleuropneumoniae đã được phân lập và đánh giá là một trong những nguyên nhân

gây bệnh viêm đường hô hấp khá quan trọng ở tất cả các trại lợn trên toàn quốc

* Triệu chứng

Triệu chứng lâm sàng của bệnh thể hiện ở nhiều mức, phụ thuộc vào tuổi của lợn, tình trạng miễn dịch, điều kiện môi trường và mức độ cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh Tiến triển lâm sàng có thể là quá cấp tính, cấp tính hoặc mãn tính

- Thể quá cấp tính: Lợn mắc bệnh sốt 41,5oC, mệt mỏi, bỏ ăn, có thể nôn mửa và tiêu chảy Thời gian ngắn trước khi chết, thường có những biểu hiện khó thở dữ dội, thở bằng mồm, lợn ở tư thế ngồi thở, nhiệt độ giảm nhanh Ngay trước khi chết, có chảy nhiều dịch bọt lẫn máu ở miệng và mũi, nhịp tim tăng; phần da ở mũi, tai, chân và sau cùng toàn bộ cơ thể trở nên tím tái (Nicolet, 1992) [128], lợn mắc bệnh thường chết sau 24 - 36 giờ

- Thể cấp tính: Ở thể này thường có nhiều lợn cùng mắc bệnh trong một chuồng hoặc ở những chuồng khác nhau Lợn bệnh sốt từ 40,5oC - 41oC, da đỏ, mệt mỏi, nằm không muốn dậy, không muốn uống, bỏ ăn Các dấu hiệu hô hấp nặng như khó thở, ho và đôi khi thở bằng miệng rất rõ (Fenwick và Henry, 1994) [76] Bệnh diễn biến khác nhau ở từng cá thể, phụ thuộc vào mức độ tổn thương

ở phổi và thời điểm bắt đầu điều trị Lợn thường sống sót nếu qua được 4 ngày đầu của bệnh

- Thể bán cấp tính: Thể này xuất hiện sau khi các dấu hiệu cấp tính mất đi; lợn bệnh không sốt hoặc sốt nhẹ, xuất hiện ho tự phát, với các cường độ khác nhau, con vật kém ăn, giảm tăng trọng (Nicolet, 1992) [128]

- Thể mãn tính: Lợn mắc bệnh không có biểu hiện rõ ràng trên lâm sàng Những con vật mắc bệnh thể mãn tính là nhân tố truyền bệnh cho những lợn khác (Kume và cs,1986) [112] Những dấu hiệu viêm phổi sẽ biểu hiện rõ hơn

nếu có nhiễm trùng kế phát các vi sinh vật đường hô hấp khác (Mycoplasma, Pasteurella, PRRS) hay các nhân tố Stress (MacInnes và Rosendal, 1988) [119]

* Bệnh tích

Lợn bị nhiễm A pleuropneumoniae cho thấy lợn bệnh có những tổn

thương chủ yếu ở đường hô hấp (Nicolet, 1992) [128] Đa số các trường hợp lợn

bị viêm hai bên phổi với tổn thương ở các thùy đỉnh, thùy tim và một phần các thùy trên vòm hoành Viêm màng phổi tơ huyết và fibrin thường rất rõ ở những

lợn chết trong giai đoạn cấp tính của bệnh Hầu hết những nghiên cứu đều kết

luận rằng những tổn thương trên là do độc tố của vi khuẩn A pleuropneumoniae

gây ra (Bertram, 1986) [54] Ở các trường hợp tử vong nhanh chóng như thể cấp tính thấy khí quản và các phế quản bị lấp đầy bởi các chất tiết nhày, bọt nhuốm máu, phổi trở nên sẫm màu, có rất nhiều máu ở lồng ngực và nhiều tơ huyết gắn giữa phổi, thành ngực, cơ hoành và màng ngoài tim (Rogers và cs, 1990) [141]

* Các biện pháp phòng bệnh

Việc phòng bệnh cần thực hiện theo một số nguyên tắc sau:

- Các trại chăn nuôi không có lợn mắc bệnh và nhiễm A pleuropneumoniae

phải duy trì việc cách ly, đi đôi với việc sử dụng tinh dịch an toàn Khi nhập lợn mới vào đàn, phải đảm bảo lợn có nguồn gốc từ một đàn không bị bệnh, không bị nhiễm khuẩn, nên nuôi cách ly chúng trong một thời gian trước khi cho vào đàn

- Có thể dùng thuốc kháng sinh để phòng bệnh nhưng không được dùng kéo

dài và thường xuyên kiểm tra sự mẫn cảm của vi khuẩn A pleuropneumoniae

với kháng sinh Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không loại bỏ được mầm

bệnh hoàn toàn và vi khuẩn A pleuropneumoniae vẫn có thể thải ra môi trường

(Fedorka-Cray và cs, 1993) [74]

- Tiêu hủy toàn đàn khi mắc bệnh là phương pháp tối ưu để thanh toán dịch bệnh, sau đó tiêu độc chuồng trại, tạo đàn mới từ những con giống sạch bệnh Trong trường hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm tra huyết thanh dương tính cao thì tiêu hủy là phương pháp hiệu quả (Nicolet, 1992) [128] Tuy nhiên, phương pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống thuần quý (Leman, 1992) [114] Điều này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con lợn mang trùng mà chưa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách Các biện pháp quản lý không được kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn sẽ tồn tại (Fenwick và Henry, 1994) [76]

- Hiện đã có nhiều loại vaccine được sản xuất để phòng cho bệnh này và được chia thành 2 nhóm chính là vaccine vô hoạt và vaccine có chứa một số thành phần cấu tạo của vi khuẩn Vaccine vô hoạt toàn khuẩn đặc hiệu theo chủng huyết thanh, có thể có miễn dịch chéo với các chủng huyết thanh khác

Vaccine dùng tiêm cho lợn con khi kháng thể thụ động nhận được từ lợn mẹ đã giảm đi giúp đàn lợn giảm tỷ lệ tử vong, giảm thuốc điều trị và chất lượng thịt cũng được nâng cao, lợn ít bị viêm phổi

- Trong chương trình kiểm soát dịch bệnh do A pleuropneumoniae gây ra ở

lợn phải thực hiện triệt để biện pháp tiêu độc khử trùng Vi khuẩn nhạy cảm với nhiều chất sát trùng thông thường như Han-Iodine 10%, Benkocid, Chloramin B

Các đàn lợn đã bị nhiễm vi khuẩn A pleuropneumoniae cần có biện pháp can thiệp

kịp thời để loại trừ mầm bệnh Thiết lập lại đàn lợn có nguồn gốc từ các đàn chắc

chắn không bị nhiễm A pleuropneumoniae là một trong các biện pháp tối ưu

* Điều trị bệnh

Vi khuẩn A pleuropneumoniae có MIC cao với streptomycin, kanamycin, spectinomycin, spiramycin và lincomycin (Nicolet và Schifferli, 1982 [127]; Inoue và cs, 1984 [94]) Prescott và Baggot (1993) [137] đã đánh giá lại khả năng nhạy cảm của vi khuẩn này với một số kháng sinh Sự xuất hiện tình trạng

vi khuẩn A pleuropneumoniae kháng lại ampicilin, cephalosporin, colistin,

tetracyclin, streptromycin, sulfonamide là vấn đề đáng lo ngại và thường gặp ở các serotype 1; 3; 5 và 7; nhưng hiếm gặp ở các chủng khác, nhất là serotype 2 (Nicolet và Schifferli, 1982 [127]; Inoue và cs, 1984 [94])

Kháng sinh được chọn lựa trong điều trị phải là kháng sinh có nồng độ ức chế tối thiểu thấp và có khả năng diệt khuẩn tốt nhất Một số kháng sinh mới có gần đây như các dẫn xuất quinolone (enrofloxacin) hoặc cephalosporin bán tổng hợp (ceftiofur sodium) đã được chứng minh trên thử nghiệm rất có kết quả Moore và cs (1996) [123] đã xác định được tilmicosin có hiệu quả cao trong điều

trị bệnh do vi khuẩn A pleuropneumoniae gây ra ở lợn Điều trị bằng kháng sinh

chỉ có hiệu quả ở giai đoạn mới phát bệnh, có tác dụng làm giảm tỷ lệ lợn chết Nếu điều trị muộn khi cơ thể đã xuất hiện nhồi máu hoặc tổn thương mãn tính làm cho lợn bị rối loạn hô hấp thì kết quả rất kém Cần làm kháng sinh đồ khi thí nghiệm điều trị bằng kháng sinh Sự thành công của điều trị phụ thuộc chủ yếu vào việc phát hiện sớm các dấu hiệu lâm sàng và can thiệp điều trị kịp thời

1.2.2 Vi khuẩn P multocida và bệnh viêm phổi ở lợn do P multocida gây ra

1.2.2.1 Vi khuẩn P multocida

* Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Theo phân loại của Bergey (1974) [53], vi khuẩn P multocida thuộc bộ Eubacteriales, họ Parvobateriaceae, tộc Pasteurelliae, giống Pasteurella, loài Pasteurella multocida Kích thước của vi khuẩn P multocida có sự thay đổi phụ

thuộc vào nguồn gốc của chúng, vi khuẩn phân lập từ bò có kích thước đồng nhất từ 0,5-1,2 , trong khi đó P multocida phân lập từ lợn có dạng tròn hơn,

kích thước từ 0,8-1,0 

Kích thước của vi khuẩn thay đổi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, khi

nuôi cấy lâu trên môi trường nhân tạo thường có hình trực khuẩn P multocida là

vi khuẩn yếm khí tùy tiện, bắt màu Gram âm, không di động, không sinh nha bào khi phát triển trong cơ thể; trong môi trường nuôi cấy có bổ sung huyết thanh hoặc máu vỡ sẽ hình thành giáp mô Khi cấy truyền trên môi trường nhân tạo hoặc tiêm truyền qua động vật máu lạnh nhiều lần thì độc lực của vi khuẩn giảm

do không còn giáp mô, nhưng nếu tiêm truyền vi khuẩn qua lợn thì độc lực lại tăng lên vì chúng lại khôi phục khả năng hình thành giáp mô

Vi khuẩn P multocida gây bệnh ở lợn là loại cầu trực khuẩn, bắt màu Gram

âm, có kích thuớc 0,2-0,41 x 0,04-1,5m, hai đầu tròn, không di động, không sinh nha bào, thường bắt màu sẫm ở hai đầu trong các tiêu bản máu ở phủ tạng

lợn còn tươi P multocida là loại vi khuẩn sống hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện,

điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 37°C trong môi trường trung tính

hay hơi kiềm (pH: 7,2-7,4) Vi khuẩn P multocida mọc tốt trên một số môi

trường như nước thịt, thạch thường, thạch máu … (Cù Hữu Phú, 2011) [28] Trên môi trường thạch có huyết cầu tố và huyết thanh là môi trường tốt dùng để giám định, phân lập và xác định độc lực của vi khuẩn này Ở môi trường

này vi khuẩn P multocida phát triển thành khuẩn lạc đặc biệt có hiện tượng phát

dung quang Peter và cs (1996) [134] đã sử dụng môi trường dinh dưỡng tối

thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và không sinh độc tố của vi khuẩn P multocida Môi trường gồm 17 thành phần, trong đó có cysteine, acid glutamic,

leucine, muối vô cơ, nicotinamid, pantothenate, thiamine, methionine Kết quả cho thấy có 40/46 chủng đem thử (chiếm 87%) mọc tốt sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không sinh độc tố như lúc đầu

Jablonski và cs (1996) [97] cho biết vi khuẩn P multocida phát triển tốt

trên môi trường nhân tạo cần cho thêm một số chất như cysteine, acid glutamic, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamid, pantothenate, thiamine và đường Trong đó leucine có tác dụng kích thích tăng trưởng và thiamine có thể thay thế bằng adenine Eiichi và cs (1997) [72] khi nghiên cứu môi trường dùng để bảo

quản mẫu bệnh phẩm chứa vi khuẩn P multocida thấy vi khuẩn có thể duy trì sự

sống được trong môi trường Cary- Blair và L-15 (leubovitz medium No15) hơn

15 ngày ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên sử dụng Cary - Blair làm môi trường vận chuyển (transport medium) thì sẽ tốt hơn, còn môi trường L-15 thích hợp hơn khi bảo quản vi khuẩn này trong phòng thí nghiệm

Vi khuẩn P multocida phát triển trong môi trường phổ thông có thêm tụy

đệm CaCl2 và MgCl2 cũng giống như phát triển trên môi trường BHI - Brain Heart Infusion (Michael và cs, 2002) [120]

Theo tài liệu của OIE (2004) [130], môi trường tốt nhất cho P multocida là

môi trường YPC (yeast extract peptone L-cytine) có thêm sacarose và sodium sulfite (Na2SO4) và môi trường TSA (tryptone soya agar) Trên môi trường TSA

kích thước của khuẩn lạc sẽ lớn hơn Vi khuẩn P multocida phát triển trên môi

trường YPC thạch máu sẽ tạo nhiều kháng nguyên quan trọng hơn khi cấy trong các môi trường tổng hợp khác, đây cũng là môi trường giúp tái tạo giáp mô của

vi khuẩn Shivachandra (2006) [145] cho thấy vi khuẩn P multocida còn có khả

năng mọc trên môi trường đậu phụ, tuy nhiên chúng không phát triển trên môi trường MacConkey và thạch Citrate Trong môi trường giàu chất dinh dưỡng thì các gen liên quan đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn hoạt động mạnh

* Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn P multocida lên men đường glucose, mannitol, sorbitol,

galactose; không lên men đường lactose, arabinose, maltose Phản ứng sinh Indol, Catalaza và Oxydaza: Dương tính; phản ứng Urease: Âm tính; không mọc trên môi trường MacConkey (Carter, 1984 [59]; Đỗ Quốc Tuấn, 2008 [46])

* Cấu trúc kháng nguyên

Kháng nguyên của vi khuẩn P multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại luôn thay đổi Cho đến nay, người ta đã xác định được P multocida có 2 loại

kháng nguyên là kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên thân (O) Kháng nguyên

O của vi khuẩn P multocida được cấu tạo từ gluxit, lipid và protein Về đặc điểm sinh học, kháng nguyên O của vi khuẩn P multocida không khác với

kháng nguyên O của các vi khuẩn khác Kháng nguyên này có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch Kháng nguyên K bao quanh thân vi khuẩn giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên thân O và kháng thể O Carter (1955) [57] đã sử dụng phản ứng kết tủa và dùng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp cũng xác định vi

khuẩn P multocida có 4 serotype nhóm kháng nguyên K đánh theo chữ cái in

hoa A, B, C, D Vào năm 1961, Carter [58] đã xác định thêm serotype mới đặt tên là E, sau này đến năm 1963, Carter đề nghị bỏ serotype C

Kháng nguyên thân O có hai thành phần đặc hiệu và không đặc hiệu, các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau theo kháng nguyên thân Theo phân loại của Namioka và Murata (1961) [124], kháng nguyên thân có 16 serotype đánh số

từ 1 - 16 và cho rằng khuẩn lạc của P multocida chuyển từ dạng S sang dạng R

thì vi khuẩn giữ được kháng nguyên thân O và cũng theo tác giả cho biết ở Nhật

Bản bệnh do P multocida gây ra ở lợn thuộc serotype A1 và D2

Nguyễn Vĩnh Phước và cs (1986) [30] cho biết ở lợn serotype B là serotype chủ yếu gây bệnh Tụ huyết trùng trên lợn ở miền Nam Việt Nam, serotype A gây

ra viêm phổi với thời gian bệnh kéo dài và tỷ lệ chết thấp hơn

Theo Rimler và Rhoades (1987) [140] bằng phản ứng IHA đã bổ sung thêm

một serotype giáp mô mới của vi khuẩn P multocida ký hiệu là F Các tác giả

còn cho biết phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp là thích hợp cho việc định serotype theo kháng nguyên K mà hiện nay nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang dùng Tại Nhật Bản, nghiên cứu của Iwanmatsu và Sawada (1988) [96]

cho thấy trong 116 chủng vi khuẩn P multocida phân lập từ phổi lợn có bệnh

tích nhục hóa, áp xe phổi và viêm màng phổi có 81,9% thuộc serotype A; 18,1% thuộc serotype D Kang-Hee O và cs (1990) [108] khi phân lập vi khuẩn từ 155

phổi của lợn thịt đã cho biết các chủng vi khuẩn P multocida được xác định

serotype A chiếm phần lớn 60,4%; serotype D chiếm 18,6%; còn lại 21,0% chưa xác định được serotype Đỗ Ngọc Thuý và cs (2007) [42] đã tiến hành xác định

serotype giáp mô của chủng vi khuẩn P multocida phân lập được từ vật nuôi

Kết quả cho thấy hầu hết các chủng phân lập được từ dịch ngoáy mũi của lợn khoẻ, phổi hoặc dịch hầu họng của lợn tại lò mổ đều thuộc serotype A trừ một chủng phân lập từ lợn bị viêm phổi thuộc serotype D

* Độc lực của vi khuẩn

Nhiều nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P multocida cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do vi khuẩn P multocida gây ra, người ta tìm thấy dấu hiệu

hoạt động của độc tố Diallo và cs (1995) [69] khi nghiên cứu độc lực của 9 chủng

P multocida phân lập được thuộc serotype A tại Australia cho biết trong 9 chín

chủng này có 3 chủng không chứa plasmid nhưng rất độc với chuột, tiêm liều 100 CFU/con vào xoang bụng thì chuột chết trong vòng từ 10 - 24 giờ, trong khi đó 3 chủng phân lập có chứa 1 plasmid và 3 chủng có chứa 2 plasmid lại không có khả

năng giết chết chuột dù tiêm liều cao hơn Vi khuẩn P multocida thuộc serotype

D còn tạo ra dermanecrotic toxin (DNT) là độc tố gây hoại tử biểu bì, độc tố này không bền với nhiệt Trọng lượng phân tử của dermanecrotic toxin khoảng 112 -

160 kDa và có thể tách ra từ canh trùng nuôi cấy, gen toxA quy định tổng hợp

dermanecrotic toxin có chiều dài 4.381 bp Nếu nuôi cấy vi khuẩn ở 30oC thì hoạt

tính của gen toxA này bị giảm nhiều và số lượng độc tố DNT sinh ra cũng ít đi

(Hunt và cs, 2000) [93] Chung và cs (2001) [63] khi kiểm tra, đánh giá độc lực

của vi khuẩn P multocida chủng X - 73, PBA 930 và PBA 945 thuộc serotype A

trên chuột và gà đã cho thấy độc lực của chủng X - 73 đối với gà cao hơn hẳn hai chủng kia, đối với chuột thì độc lực của chủng PBA 930 là thấp nhất

Đỗ Quốc Tuấn (2008) [46] cho thấy vi khuẩn P multocida phân lập được

từ lợn ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam có độc lực gây chết chuột bạch từ

50 - 100% trong thời gian từ 20 - 48 giờ Vi khuẩn P multocida phân lập được

từ gia súc tại các tỉnh Cao Bằng và Hà Giang có độc lực mạnh, đã gây chết từ

80% đến 100% chuột thí nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc (Đặng Xuân Bình và cs, 2010) [4]

* Khả năng đề kháng với kháng sinh

Vi khuẩn P multocida gây bệnh ở gia súc tại Thái Lan chứa 2 loại plasmid

có khả năng đề kháng với kháng sinh Loại plasmid thứ nhất là pJR1 chứa 6.792

bp và loại thứ hai là pJR2 chứa 5.252 bp

- Plasmid pJR1 có 6 gen chính: gen thứ nhất (Sul II) quy định tính kháng sulfamide, gen thứ 2 (tet G) quy định đặc tính kháng tetracyclin, gen thứ 3 (cat B2) quy định đặc tính kháng chloramphenicol, gen thứ 4 (rep) quy định khả năng tái tạo protein của plasmid, gen thứ 5 và 6 (mbe Cy và deltambe Ay) quy định qúa trình tổng hợp các protein liên quan đến khả năng di chuyển của plasmid

- Plasmid pJR2 có 5 gen chính: gen thứ nhất (deltain I1) có liên quan đến khả năng hợp nhất của plasmid, gen thứ 2 (aad A1) quy định đặc tính kháng streptomycin, gen thứ 3 (bba P1) quy định đặc tính kháng ampicillin, gen thứ 4

và gen thứ 5 quy định khả năng tổng hợp của protein tham gia vào quá trình tái tạo và phân ly plasmid (Wu và cs, 2003) [159]

Ở Việt Nam, Đỗ Quốc Tuấn và Nguyễn Quang Tuyên (2007) [45] cho biết

25 chủng P multocida phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm lợn mắc bệnh mẫn

cảm cao với các kháng sinh như chlotetracyclin, neomycin và ampicillin; đến năm

2008, Đỗ Quốc Tuấn [46] xác định mức độ mẫn cảm của các chủng P.multocida

phân lập được ở lợn tại một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam với một số kháng

sinh thông dụng đã cho thấy các chủng P.multocida mẫn cảm cao với norfloxacin,

lincomycin và neomycin Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] cũng

cho biết các chủng P.multocida phân lập được ở lợn mắc PRRS mẫn cảm cao với

các kháng sinh như amoxicillin (100%), ampicillin (66,67%), gentamicin (66,67%) và kháng mạnh các kháng sinh như streptomycin, enrofloxacin, colistin

1.2.2.2 Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P mutocida

* Triệu chứng

Bệnh viêm phổi ở lợn do vi khuẩn P multocida gây ra rất khác nhau tùy

thuộc vào chủng vi khuẩn gây bệnh, thường xuất hiện 3 thể là thể quá cấp, thể cấp tính và thể mãn tính

- Thể quá cấp tính: Lợn bệnh mệt mỏi, kém ăn, hoặc bỏ ăn, nằm một chỗ, không đứng dậy được, sốt cao (41 - 42°C), uống nhiều nước, run rẩy Xuất hiện thuỷ thũng ở cổ, họng, hầu do viêm làm cho hầu sưng, cổ cứng, má phị, mặt mũi sưng húp, có khi phía dưới bụng và giữa hai hàng vú sưng, con vật thở khó, thở khò khè, cổ duỗi thẳng, mũi phồng ra khép lại từng hồi, nhịp tim nhanh Các niêm mạc đỏ sẫm hoặc tím bầm, nốt xuất huyết, vết đỏ hay tím xuất hiện ở tai,

cổ, bụng, phía trong đùi Bệnh tiến triển từ 12 giờ đến 1 - 2 ngày, con vật chết vì ngạt thở (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1979) [29] Theo Trần Văn Bình (2008) [5], lợn mắc bệnh ở thể này có biểu hiện đang bình thường đột nhiên kêu rống lên rồi lăn ra chết, sau khi chết xác lợn tím bầm, sùi bọt mép Trường hợp này xảy ra khi mầm bệnh đã có sẵn ở cơ sở chăn nuôi

- Thể cấp tính: Lợn mắc bệnh bắt đầu ủ rũ, ăn ít hoặc bỏ ăn, sốt đến 41°C hoặc hơn Sau đó, xuất hiện các triệu chứng giống ở thể quá cấp nhưng không trầm trọng bằng Niêm mạc mũi lợn bệnh bị viêm, con vật thở khó, thở nhanh, có tiếng khò khè, ướt trong phế quản, chảy nước mũi đặc, nhờn, đục, có khi có mủ, máu; ho khan, từng tiếng, ho co rút toàn thân, khi gõ vùng ngực con vật đau, thấy

có vùng âm đục; tim đập nhanh; chảy nước mắt; trên da nổi những chấm đỏ hoặc đám tím bầm ở những phần da mềm; chỗ da mỏng ít lông thường viêm xuất huyết Quan sát thấy lợn bệnh bị phù thũng dưới da vùng hầu và lan rộng xuống

cổ Những vùng này có hiện tượng sưng to và bùng nhùng Lợn mắc bệnh lúc đầu táo sau ỉa chảy có khi có máu hoặc cục máu do xuất huyết ruột Bệnh tiến triển từ 3 đến 12 ngày, con vật gầy yếu dần, ăn ít hoặc không ăn rồi chết Tỷ lệ chết có thể lên tới 80%, nếu con vật không chết thì có thể chuyển sang thể mãn tính (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1979) [29]

- Thể mãn tính: Thể này thường tiếp theo thể cấp tính, con vật khó thở, thở nhanh và thở khò khè, hơi sốt nhẹ, các khớp bị sưng nhất là khớp gối Con vật ho nhiều khi vận động, có đám da tróc bong vẩy, niêm mạc miệng đóng màng giả gây áp xe Bệnh tiến triển 3 - 6 tuần sau đó con vật gầy yếu dần rồi chết do suy nhược (Phan Thanh Phượng và cs, 2006) [31]