P. multocida và S. suis phân lập đƣợc
Khả năng gây bệnh của vi khuẩn được căn cứ vào độc lực và khả năng sản sinh độc tố. Để xác định độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae, P. multocida
và S. suis phân lập được ở lợn dương tính với PRRSV, chúng tôi tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm.
3.3.3.1. Kết quả xác định độc lực các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được
Độc lực của các chủng A. pleuropneumoniae liên quan đến cấu trúc và những sản phẩm do vỏ và các độc tố tạo nên. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng A. pleuropneumoniae độc lực cao có kích thước lớn hơn và lớp vỏ bám dính hơn những chủng độc lực thấp (Inzana, 1991) [95]. Để làm rõ vai trò gây bệnh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được, sau khi đã xác định hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hóa học, serotype thì việc kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm là cần thiết. Chúng tôi đã chọn 12 chủng vi 1 2 3 4 5 6 7 M
397 bp 498 bp
303 bp
khuẩn A. pleuropneumoniae có đặc tính hình thái, nuôi cấy, đặc tính sinh vật, hoá học điển hình và đại diện cho yếu tố khu vực lấy mẫu để xác định độc lực của chúng trên chuột bạch. Mỗi chủng A. pleuropneumoniae được tiêm vào phúc xoang cho 2 chuột thí nghiệm, sử dụng canh trùng đã nuôi cấy 24 giờ ở 37o
C trong điều kiện có 5 - 10% CO2, liều tiêm 0,5 ml/con; số chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày. Kết quả kiểm tra độc lực được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn
A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc STT Ký hiệu chủng Số chuột tiêm (con) Liều tiêm phúc xoang (ml/con)
Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết sau khi tiêm
(con) 12h 18h 24h 30h 36h 48h 168h Cộng 1 AHH-BG 1 2 0,5 1 1 0 2 2 AHH-BG 2 2 0,5 1 0 1 3 AVY-BG 3 2 0,5 1 1 0 2 4 AVY-BG 4 2 0,5 1 1 0 2 5 ATY-BG 5 2 0,5 1 1 0 2 6 ATY-BG 6 2 0,5 1 1 0 2 7 AYD-BG 7 2 0,5 1 0 1 8 AYD-BG 8 2 0,5 1 1 0 2 9 ALG-BG 9 2 0,5 1 1 0 2 10 ALG-BG 10 2 0,5 1 1 0 2 11 ALN-BG 11 2 0,5 1 0 1 12 ALN-BG 12 2 0,5 1 1 0 2
Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy: Trong 12 chủng A. pleuropneumoniae kiểm tra độc lực có 9 chủng có độc lực mạnh, giết chết 100% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 12- 36 giờ; 3 chủng giết chết 50% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 18- 48 giờ. Tất cả số chuột sau khi chết được mổ khám kiểm
tra bệnh tích đều thấy phổi sưng xuất huyết phù nề, viêm dính giai đoạn đầu và phân lập lại được vi khuẩn A. pleuropneumoniae thuần khiết từ máu tim. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với với kết quả của một số tác giả như Đặng Xuân Bình và cs (2007) [3] kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae trên 15 chuột thí nghiệm, cho tỷ lệ chuột chết là 100%; Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) [12] chọn 10 chủng A. pleuropneumoniae phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm phổi - màng phổi kiểm tra độc lực trên chuột thí nghiệm, cả 10 chủng đều gây chết 100% chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian từ 18 - 48 giờ. Trong đó có 2/10 chủng gây chết chuột sau 18 giờ; 7/10 chủng gây chết chuột sau 24 giờ và 1/10 chủng gây chết chuột sau 48 giờ.
Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được và đã xác định được liều LD50 của A. pleuropneumoniae serotype 2 là LD50 = 4,3 x 107CFU và serotype 5 là LD50 = 4,8 x 107CFU.
Như vậy, vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập được có độc lực cao đối với chuột bạch và đây là một trong những nguyên nhân quan trọng gây viêm phổi cho lợn nuôi ở tỉnh Bắc Giang.
3.3.3.2. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được
Để làm rõ vai trò gây viêm phổi ở lợn của vi khuẩn P. multocida, từ 42 chủng P. multocida phân lập được ở lợn dương tính với PRRSV tại Bắc Giang chúng tôi chọn 12 chủng có đặc tính sinh vật, hóa học điển hình được ký hiệu như sau: PHH-BG 1, PHH-BG 2, PVY-BG 3, PVY-BG 4, PTY-BG 5, PTY-BG 6, PYD-BG 7, PYD- BG 8, PLG-BG 9, PLG-BG 10, PLN- BG 11, PLN-BG 12 và tiến hành xác định độc lực trên chuột bạch. Mỗi chủng vi khuẩn P. multocida tiêm cho 2 chuột vào phúc xoang, với liều 0,5 ml canh trùng nuôi cấy vi khuẩn này ở 37oC/24 giờ; số chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày. Kết quả được trình bày tại bảng 3.14. Qua bảng 3.14 cho thấy có 8 chủng vi khuẩn P. multocida giết chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 12 - 36 giờ, trong đó có 2 chủng là PTY-BG 5 và PLN-BG 11 độc lực mạnh nhất, đều giết chết chuột trong
vòng 12 - 24 giờ sau khi tiêm; có 4 chủng chỉ giết chết 50% chuột thí nghiệm trong vòng 24 - 36 giờ. Kết quả thu được của chúng tôi cũng tương đồng với nghiên cứu của Đỗ Quốc Tuấn và Nguyễn Quang Tuyên (2007) [45] khi kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được ở lợn thuộc ba tỉnh Thái Nguyên, Tuyên Quang và Bắc Kạn đã cho thấy các chủng vi khuẩn P. multocida đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí nghiệm từ 50 - 100% trong thời gian từ 20 - 48 giờ; Đặng Xuân Bình và cs (2010) [4] kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn P. multocida phân lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Cao Bằng, Hà Giang đã cho biết các chủng vi khuẩn đều có độc lực mạnh gây chết chuột thí nghiệm từ 80 - 100% trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc.
Bảng 3.14: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn
P. multocida phân lập đƣợc STT Ký hiệu chủng Thuộc serotype Số chuột tiêm (con) Liều tiêm phúc xoang (ml/con)
Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết sau khi tiêm (con)
12h 18h 24h 30h 36h 168h Cộng 1 PHH-BG 1 A 2 0,5 1 1 0 2 2 PHH-BG 2 D 2 0,5 1 0 1 3 PVY-BG 3 A 2 0,5 1 1 0 2 4 PVY-BG 4 D 2 0,5 1 1 0 2 5 PTY-BG 5 A 2 0,5 1 1 0 2 6 PTY-BG 6 D 2 0,5 1 1 0 2 7 PYD-BG 7 A 2 0,5 1 1 0 2 8 PYD-BG 8 D 2 0,5 1 0 1 9 PLG-BG 9 A 2 0,5 1 0 1 10 PLG-BG 10 D 2 0,5 1 0 1 11 PLN-BG 11 D 2 0,5 1 1 0 2 12 PLN-BG 12 A 2 0,5 1 1 0 2
Chúng tôi đã tiến hành mổ khám những con chuột chết và thấy có những bệnh tích như bao tim tích nước vàng, gan, phổi sưng, các phủ tạng xuất huyết. Đây là bệnh tích đặc trưng, điển hình của chuột chết khi tiêm vi khuẩn P. multocida
cường độc. Tiến hành phân lập lại vi khuẩn P. multocida từ máu tim của những chuột chết đều cho kết quả dương tính.
Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn P. multocida phân lập được và đã xác định được liều LD50 của chủng P. multocida serotype A là LD50 = 4 x 107 CFU và serotype D là LD50 = 4,2 x 107CFU.
Như vậy, phần lớn các chủng vi khuẩn P. multocida mà chúng tôi phân lập được đều có độc lực mạnh, chúng đều có khả năng gây viêm phổi cho lợn khi gặp điều kiện thuận lợi, khi sức đề kháng của lợn giảm do thời tiết thay đổi, chăm sóc nuôi dưỡng kém hoặc bị mắc PRRS.
3.3.3.3. Kết quả xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được
Căn cứ vào kết quả xác định serotype của các chủng S. suis phân lập được chúng tôi chọn 10 chủng vi khuẩn đại diện cho 5 serotype khác nhau (2, 7, 9, 21 và 29) và 2 chủng thuộc nhóm chưa xác định được serotype đã được kiểm tra độc lực trên chuột bạch. Mỗi chuột thí nghiệm được tiêm 0,5 ml canh trùng nuôi cấy ở 37°C/24 giờ vào phúc xoang. Chuột thí nghiệm được theo dõi trong vòng 7 ngày; khi chuột chết được mổ khám, kiểm tra triệu chứng, bệnh tích và phân lập lại vi khuẩn từ máu tim. Kết quả được trình bày tại bảng 3.15.
Qua bảng 3.15 cho thấy: Các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 và serotype 9 đều gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn, từ 12 - 24 giờ. Trong khi đó, cả 2 chủng thuộc serotype 7 được kiểm tra đều chỉ gây chết 50% số chuột thí nghiệm, chủng S-BG 3 gây chết chuột trong vòng 36 giờ và chủng S-BG 4 gây chết chuột trong vòng 48 giờ sau khi tiêm. Các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 29; 21 và 2 chủng chưa xác định rõ được serotype đều không gây chết chuột. Những chuột chết được mổ khám kiểm tra triệu chứng, bệnh tích. Qua khám, kiểm tra số chuột thí nghiệm cho thấy: Tất cả các chuột chết đều có bệnh tích phổi viêm sung huyết; tim sưng, mềm, nhão, tích
nước trong xoang bao tim ; vùng xung quanh chỗ tiêm đôi khi có hiện tượng áp xe; cho tiến hành phân lập lại vi khuẩn đều thu được vi khuẩn S. suis thuần khiết từ máu tim. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với nghiên cứu của một số tác giả như: Nguyễn Ngọc Nhiên và Khương Thị Bích Ngọc (1994) [23] khi tiêm 0,2 ml vi khuẩn Streptococcus vào dưới da cho chuột bạch , chuột chết sau 24 - 36 giờ, chỗ tiêm áp xe có mủ và đã phân lập lại được vi khuẩn từ máu tim; Khương Thị Bích Ngọc (1996) [24] khi kiểm tra độc lực của vi khuẩn
Streptococcus bằng phương pháp tiêm truyền trên chuột bạch đã cho thấy vi khuẩn gây chết cấp tính đối với chuột thí nghiệm. Những chuột không chết có triệu chứng thần kinh, mệt mỏi, ủ rũ.
Bảng 3.15: Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn
S. suis phân lập đƣợc STT Ký hiệu chủng Thuộc serotype Số chuột tiêm (con) Liều tiêm phúc xoang (ml/con)
Kết quả theo dõi chuột thí nghiệm chết sau khi tiêm (con)
12h 18h 24h 36h 48h 168h Cộng 1 S-BG 1 2 2 0,5 1 1 0 2 2 S-BG 2 2 2 0,5 1 1 0 2 3 S-BG 3 7 2 0,5 1 0 1 4 S-BG 4 7 2 0,5 1 0 1 5 S-BG 5 9 2 0,5 1 1 0 2 6 S-BG 6 9 2 0,5 1 1 0 2 7 S-BG 7 21 2 0,5 0 0 8 S-BG 8 21 2 0,5 0 0 9 S-BG 9 29 2 0,5 0 0 10 S-BG10 29 2 0,5 0 0 11 S-BG11 - 2 0,5 0 0 12 S-BG12 - 2 0,5 0 0
Chúng tôi xác định liều LD50 của vi khuẩn S. suis phân lập được và đã xác định được liều LD50 của vi khuẩn S. suis serotype 2 là LD50 = 4,4 x 107CFU; serotype 7 và serotype 9 là LD50 = 4,9 x 107CFU.
Như vậy, các chủng vi khuẩn S. suis thuộc serotype 2 và serotype 9 là hai serotype chiếm ưu thế trong số các chủng vi khuẩn S. suis phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm của lợn dương tính với PRRSV tại tỉnh Bắc Giang và là những chủng có độc lực mạnh, gây chết chuột thí nghiệm trong thời gian ngắn.
3.3.4. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae, P. multocida và S. suis phân lập đƣợc