BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SPP GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT Ở CÁ RÔ PHI NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SPP GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT Ở CÁ RÔ PHI NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 06.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN KHOA TS HUỲNH THỊ MỸ LỆ HÀ NỘI - 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Đồng thời tất thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả Phạm Hồng Quân i LỜI CẢM ƠN ! Để hoàn thành nội dung luận văn tốt nghiệp này, nỗ lực cố gắng thân nhận giúp đỡ không nhỏ nhiều tổ chức, quan cá nhân Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Văn Khoa – Cục Thú Y, TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ - Đại học Nông nghiệp Hà Nội người định hướng trực tiếp hướng dẫn hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Vũ, ThS Hồ Thu Thủy anh chị Trung tâm nghiên cứu – Công ty Hanvet tạo điều kiện tốt để thực đề tài Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn chân thành tới thầy cô giáo trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, suốt hai năm học trường, nhận dạy dỗ, dìu dắt tận tình thầy cô giáo trường Nhân đây, xin gửi lời cảm ơn tới tất bạn bè, bạn đồng nghiệp người góp ý chân thành, giúp đỡ động viên suốt thời gian hoàn thành luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn bố mẹ, anh chị em cổ vũ, động viên lúc khó khăn giúp có thêm nghị lực để có ngày hôm Tác giả Phạm Hồng Quân ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ! ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài: 1.3 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.4 Ý nghĩa thực tiễn đề tài TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm sinh học cá rô phi 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm môi trường sống tập tính dinh dưỡng 2.2 Tình hình nuôi cá rô phi 2.2.1 Tình hình nuôi cá rô phi giới 2.2.2 Tình hình nuôi cá rô phi Việt Nam 2.3 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh cá rô phi 2.3.1 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh cá rô phi giới 2.3.2 Tình hình nghiên cứu dịch bệnh cá rô phi nước 10 2.4 Tình hình sử dụng thuốc nuôi trồng thủy sản 15 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 17 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 17 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 17 iii 3.2 Nội dung nghiên cứu 17 3.3 Vật liệu nghiên cứu 17 3.3.1 Dụng cụ, thiết bị phục vụ nghiên cứu 17 3.3.2 Môi trường, hóa chất phục vụ nghiên cứu 18 3.3.3 Vật liệu nghiên cứu 18 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh 19 3.4.2 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng 19 3.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptococcus spp có mẫu bệnh phẩm 20 4.4.4 Phương pháp đếm mật độ vi khuẩn 21 3.4.5 Phương pháp định danh vi khuẩn Streptoccocus spp 21 3.4.6 Phương pháp xác định độc lực chủng vi khuẩn Streptococcus spp 26 3.4.7 Phương pháp xác định tính kháng nguyên 29 3.4.8 Phương pháp kiểm tra khả mẫn cảm với kháng sinh vi khuẩn 32 3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 33 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Streptoccocus spp 34 4.1.1 Kết thu mẫu 34 4.1.2 Kết phân lập vi khuẩn 35 4.2 Kết xác định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn Streptoccocus spp phân lập 37 4.2.1 Kết xác định số đặc tính sinh học 37 4.2.2 Kết định danh vi khuẩn 38 4.3 Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập 4.3.1 40 Kết gây bệnh thực nghiệm vi khuẩn Streptococcus agalactiae cá rô phi 4.3.2 40 Kết tăng cường độc lực chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae 44 iv 4.4 Kết xác định tính kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập 46 4.4.4 Kết tạo kháng nguyên cho chủng vi khuẩn: 46 4.4.2 Kết tạo kháng thể kháng S.agalactiae cá rô phi 46 4.4.3 Kết phản ứng ngưng kết 47 4.5 Kết kiểm tra khả mẫn cảm với kháng sinh vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 5.1 Kết luận 51 5.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 55 BÀI BÁO KHOA HỌC 73 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ctv: Cộng tác viên KS: Kháng sinh VK: Vi khuẩn vi DANH MỤC BẢNG STT 2.1 Tên bảng Trang Vi khuẩn gây bệnh cá rô phi nuôi khu vực Đông Nam Á (Lauke Labrie, 2007) 3.1 10 Thuốc thử cách đọc kết phản ứng sinh hóa API 20 Strep 3.2 25 Bố trí thí nghiệm xác định độc lực vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá rô phi 27 3.3 Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn chuẩn 33 4.1 Kết thu mẫu cá nghi bị bệnh xuất huyết 35 4.2 Thành phần loài vi khuẩn phân lập từ mẫu cá bệnh 36 4.3 Kết phân lập vi khuẩn Streptococcus spp từ quan cá rô phi 37 4.4 Kết giám định định danh vi khuẩn Streptococcus spp 39 4.5 Kết gây bệnh thực nghiệm chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae thu Hải Dương 4.6 41 Kết gây bệnh thực nghiệm chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae thu Hà Nội 4.7 42 Kết gây bệnh thực nghiệm chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae thu Hải Phòng 4.8 42 Kết gây bệnh thực nghiệm chủng vi khuẩn Streptococcus agalactiae thu Quảng Ninh 43 4.9 Bảng kết tăng cường độc lực chủng vi khuẩn S.agalactiae 45 4.10 Kết kiểm tra phản ứng ngưng kết với kháng thể pha loãng 48 4.11 Kết thử kháng sinh đồ 52 chủng S.agalactiae với 10 loại thuốc kháng sinh thường dùng 49 vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus) 2.2 Cá rô phi đỏ (cá điêu hồng) 2.3 Tác nhân gây bệnh cá rô phi giai đoạn nuôi 10 3.1 Cách mổ xoang bụng cá 20 3.2 Cách mổ não cá 20 3.3 Sơ đồ nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Streptococcus spp 21 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm gây bệnh cho cá rô phi 28 3.5 Cá rô phi thí nghiệm 30 4.1 Dấu hiệu bệnh lý cá lúc thu mẫu A: Mắt cá bị lồi, đục B: Nội tạng cá bị xuất huyết C: Cá bơi lờ đờ, hoạt động chậm chạp D: Bụng cá trướng to xuất huyết 4.2 34 Hình thái khuẩn lạc Streptococcus spp nuôi cấy môi trường thạch máu 38 4.3 Vi khuẩn Streptococcus spp 38 4.4 Hình thái khuẩn lạc Streptococcus spp nuôi cấy môi trường BHIA 38 4.5 Kết thử kít API 20Strep định danh Streptococcus agalactiae 38 4.6 Cá rô phi có dấu hiệu bệnh lý sau 24 gây nhiễm với vi khuẩn Streptococcus agalactiae 4.7 44 Vi khuẩn bất hoạt formalin trước ly tâm (A); sau li tâm (B); pha với nước muối sinh lý (C) 4.8 46 Hình ảnh thu huyết cá (A): Máu cá; (B): Máu cá sau giữ lạnh ly tâm 47 4.9 Kết phản ứng ngưng kết nhanh phiến kính 47 4.10 Hiện tượng ngưng kết quan sát kính hiển vi (40X) 48 4.11 Kiểm tra khả mẫn cảm với kháng sinh 50 viii