Tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng saccharomyces để sản xuất chế phẩm probiotic trong chăn nuô

LỜI CẢM ƠN Sau tháng thực tập khóa luận tốt nghiệp Bộ mơn Cơng nghệ Vi sinhHóa sinh, Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp, trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam dƣới hƣớng dẫn khoa học PGS.TS Bùi Văn Thắng môn Công nghệ gen ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trong thời gian làm khóa luận tơi nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ bảo thầy cô giáo động viên giúp đỡ từ gia đình, bạn bè Lời cảm ơn đầu tiên, xin đƣợc gửi đến PGS.TS Bùi Văn Thắng môn Công nghệ gen ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung – thầy ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn Thật vinh dự tự hào đƣợc thầy cô giao đề tài hƣớng dẫn thực đề tài khóa luận Thầy tận tình hƣớng dẫn tơi suốt thời gian thực tập làm đề tài khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện công nghệ sinh học – Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam truyền đạt cho kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Cảm ơn gia đình bạn học khóa 59-CNSH giúp giúp đỡ, động viên suốt q trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Mặc dù cố gắng để hoàn thành đề tài song hạn chế mặt thời gian, kinh nghiệm thân điều kiện nghiên cứu nên tránh khỏi thiếu sót tồn định Tơi kính mong nhận đƣợc lời nhận xét, đóng góp ý kiến thầy Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2018 Sinh viên thực Mai Thị Thu i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Lịch sử định nghĩa probiotic 1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp 1.1.3 Đặc điểm chung probiotic 1.1.4 Cơ chế tác động chung probiotic 1.1.5 Vai trị probiotic vật ni 1.1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt Nam 1.2 Tổng quan Nấm men 1.2.1 Đặc điểm hình thái, cấu tạo sinh sản 1.2.2 Thành phần hóa học tế bào nấm men 11 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 13 2.2 Nội dung 13 2.3 Vật liệu nghiên cứu 13 2.4 Môi trƣờng nghiên cứu 14 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 2.5.1 Phân lập bảo quản giống 15 2.5.2 Tuyển chọn chủng có đặc tính probiotic 16 2.5.3 Xác định đặc tính sinh lý sinh hóa chủng vi sinh vật 18 2.5.4 Xác định yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến khả thu nhận sinh khối nấm men 20 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 ii 3.1 Phân lập bảo quản giống 23 3.2 Tuyển chọn chủng có số đặc tính nấm men 24 3.2.1 Xác định hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nấm men 24 3.2.2 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm men 26 3.2.3 Khả đề kháng kháng sinh chủng nấm men 27 3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa nấm men 28 3.3.1 Khả lên men loại đƣờng 28 3.3.2 Kết phân giải urea khử nitrat nấm men 29 3.3.3 Hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men Saccharomyces lựa chọn 30 3.4 Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng đến tạo sinh khối tế bào chủng nấm men 31 3.4.1 Ảnh hƣởng thời gian tới tạo sinh khối tế bào chủng nấm men31 3.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới tạo sinh khối tế bào chủng nấm men 32 3.4.3 Ảnh hƣởng dải pH ban đầu tới tạo khối chủng nấm men 33 3.3.4 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến tạo sinh khối tế bào 33 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic CFU Colony-Forming Unit CMC Carboxymethiylcellulose ĐC Đối chứng FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức nông nghiệp lƣơng thực Liên Hợp Quốc G- Gram âm G+ Gram dƣơng MT Môi trƣờng OD Optical Density Mật độ quang STT Số thứ tự VK Vi khuẩn WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 24 Bảng 3.2: Hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh nấm men 25 Bảng 3.3: Khả sinh enzyme ngoại bào chủng nấm men 26 Bảng 3.4 : Khả kháng kháng sinh chủng nấm men 28 Bảng 3.5 Khả lên men loại đƣờng chủng nấm men 29 Bảng 3.6: Khả khử nitrat phân giải ure nấm men 29 Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố chủng 31 Bảng 3.8: Ảnh hƣởng thời gian đến tạo sinh khối chủng nấm men 32 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng yếu tố nhiệt độ đến tạo sinh khối nấm men 32 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng pH ban đầu đến tạo sinh khối chủng nấm men 33 Bảng 3.11: Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến tạo sinh khối chủng nấm men 34 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo tế bào nấm men Hình 1.2 Hình thái nấm men Hình 3.1: Hình ảnh khuẩn lạc chủng nấm men phân lập đƣợc 23 Hình 3.2: Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định nấm men 25 Hình 3.3 Khả sinh enzyme amylase chủng nấm men 27 Hình 3.4 Khả sinh enzyme protease chủng D3, M1 27 Hình 3.5 Khả sinh enzyme cellulase chủng D3, M1 27 Hình 3.6: Khả đối kháng kháng sinh nồng độ 30 (50) µg/ml chủng nấm men 28 Hình 3.7: Khả phân giải urea nấm men 30 Hình 3.8: Khả phân giải nitrat nấm men 30 Hình 3.9 : Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng nấm men 30 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong dinh dƣỡng động vật, việc tăng cƣờng sức khoẻ hệ thống tiêu hố vật ni thơng qua tác động tới hệ vi sinh vật đƣờng ruột đƣợc coi giải pháp hữu hiệu Hệ vi sinh vật đƣờng ruột vật nuôi phong phú chủng loại số lƣợng, biến động cấu, số lƣợng loài vi sinh vật đƣờng ruột nguyên nhân chủ yếu dẫn đến rối loạn tiêu hoá hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn nuôi dƣỡng nhằm tạo nên cân tối ƣu loài vi sinh vật đƣờng ruột theo hƣớng có lợi cho vật chủ hƣớng nghiên cứu đƣợc nhà nghiên cứu ngồi nƣớc quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân nhóm vi khuẩn có lợi có hại đƣờng tiêu hoá gia súc, gia cầm Biện pháp cổ điển đƣợc ứng dụng rộng rãi từ năm 1950 kỷ trƣớc sử dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi ngày bị hạn chế, nên nhu cầu tìm giải pháp thay kháng sinh ngày trở thành cấp bách Một giải pháp hữu hiệu probiotic Các sản phẩm probiotic nhập dùng chăn nuôi có mặt thị trƣờng Việt Nam nhiều nhƣng đáp ứng tích cực cho vật ni chƣa đƣợc rõ ràng Các nhà khoa học cho vi sinh vật khơng phù hợp với hệ vi sinh vật đƣờng ruột vật chủ địa Mặt khác, nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn ni nƣớc ta cịn hạn chế Tôi thực đề tài: “Tuyển chọn nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng Saccharomyces để sản xuất chế phẩm probiotic chăn nuôi”, lấy nguồn vật liệu nƣớc để ứng dụng tạo chế phẩm sinh probiotic có hiệu việc chăn nuôi CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan probiotic 1.1.1 Lịch sử định nghĩa probiotic a Lịch sử probiotic Những nghiên cứu probiotic bắt đầu vào kỷ 20, Henry Tisser (1900), bác sỹ ngƣời Pháp quan sát thấy phân đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có vi khuẩn lạ hình trứng hình chữ Y đứa trẻ khỏe mạnh Sau năm 1907, Elie Metchnikoff - ngƣời Nga, đạt giải Nobel – chứng minh đƣợc việc tiêu thụ Lactobacillus hạn chế nội độc tố hệ vi sinh vật đƣờng ruột Ơng giải thích đƣợc điều bí ẩn sức khỏe ngƣời Cô-dăc Bulgary, họ sống khỏe mạnh tuổi thọ lên tới 115 tuổi hơn, nguyên nhân họ tiêu thụ lớn sản phẩm sữa lên men, điều đƣợc ông báo cáo sách “sự kéo dài sống” – The Prolongation of life (1908) Có thể nói Tisser Metchnikoff ngƣời đƣa đề xuất mang tính khoa học probiotic, làm sở cho nghiên cứu probiotic [25, 34, 35] Năm 1930, nhà khoa học ngƣời Nhật, Minoru Shirota phân lập vi khuẩn lactic từ phân em thiếu nhi khỏe mạnh [26] Nghiên cứu Luc Shiming (1980) cho thấy chế phẩm Lactobacillus đƣợc phân lập từ gà khoẻ mạnh có tác dụng phịng trị bệnh tiêu chảy cấp tính ác tính hàng loạt gà Reverdin (1996) cho Saccharomyces cerevisiae có tác dụng làm nâng cao chất béo sửa dê Nghiên cứu khác cho thấy sử dụng chế phẩm probiotic gà đẻ làm tăng sản lƣợng 5% (mohal et al., 1995) Cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển biến thức ăn, trọng lƣợng trứng chất lƣợng lòng đỏ (Tortuero Fernandez, 1995) Nghiên cứu Tortuero (1989) cho thấy bổ sung hỗ hợp L acidophilus S faecium cho gà thịt giai đoạn 5-8 tuần cải thiện 2% tăng trọng hiệu sử dụng thức ăn chăn nuôi Ngày nay, nghiên cứu chế phẩm probiotic ngày đƣợc ứng dụng rộng rãi nƣớc b Định nghĩa probiotic Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa “vì sống” Thuật ngữ probiotic đƣợc Parker đề nghị sử dụng lần vào năm 1974 để “những vi sinh vật chất làm cân hệ vi sinh vật ruột” (Fuller, 1989) Từ đến thuật ngữ probiotic đƣợc giới sử dụng để chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích đƣợc đƣa vào thể động vật thông qua thức ăn nƣớc uống tạo nên ảnh hƣởng có lợi cho vật chủ Kể từ xuất hiện, khái niệm probiotic chƣa có định nghĩa thống Tuy nhiên, có hai định nghĩa đƣợc cho phản ánh đầy đủ chất probiotic đƣợc sử dụng nhiều ấn phẩm khoa học [35, 36] Theo Fuller (1989), probiotic “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa theo hƣớng có lợi cho vật chủ” Theo định nghĩa FAO/WHO năm 2002, “Probiotic vi sinh vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” Đây định nghĩa đƣợc chấp nhận nhiều 1.1.2 Các vi sinh vật probiotic thƣờng gặp Chế phẩm probiotic tập hợp chủng vi sinh vật có ích Đó tế bào sống chủng vi sinh vật, sống hợp sinh sản sinh số hợp chất sinh học có tác dụng đến đời sống trồng, vật ni, cải thiện mơi trƣờng, đồng thời có tác dụng dƣơng tính sức khỏe ngƣời đƣa chế phẩm vào đƣờng ruột Chế phẩm probiotic thƣờng gồm nhóm vi sinh vật sau:  Nhóm vi khuẩn Lactic Các vi khuẩn Lactic có lợi giữ vai trị đƣợc sử dụng nhƣ L Acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subs, Lactobacillus casei, L plantarum, L bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium , S faecalis, [24]  Nhóm vi khuẩn Bacillus Trong chế phẩm probiotic, ngƣời ta thƣờng sử dụng chủng thuộc giống Bacillus sau: B subtilis, B mesentericus, B megathericum, B licheniformis, B clausii [27] Các chủng có ích, khơng gây bệnh cho ngƣời vật nuôi  Nấm men Saccharomyces Để sản xuất probiotic, ngƣời ta thƣờng dùng chủng sau: S cerevisiae, S carlsbergensis, S vini S pombe, đặc biệt S Boulardii, S boulardii có tác động hiệu điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp, ngừa tiêu chảy trị liệu phối hợp nhiễm trùng H pylori [25]  Nấm mốc Điển hình Aspergillusp oryzae, Aspergillusp niger Trong chế phẩm probiotic, chúng có vai trị sản sinh enzym amylase, protease, cellulase, … Nhằm tăng cƣờng khả tiêu hóa thức ăn ngƣời vật ni, đồng thời đƣợc bổ sung vào chế phẩm để hỗ trợ trình phân hủy hợp chất hữu thức ăn thừa hay phân vật nuôi tiết [24] 1.1.3 Đặc điểm chung probiotic  An toàn cho ngƣời động vật, không gây bệnh không tạo độc tố  Có khả sống sót đƣờng ruột vật chủ, chịu đƣợc pH thấp dày muối mật đƣờng ruột, …  Có khả bám dính vào tế bào biểu mơ ruột để làm giảm số lƣợng vi sinh vật gây bệnh  Có khả ức chế vi sinh vật gây bệnh nhờ khả sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột  Có lợi cho q trình tiêu hóa vật chủ nhờ khả sinh số loại enzyme ngoại bào, …  Có khả tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch sức đề kháng vật chủ Hình 3.3 Khả sinh enzyme amylase chủng nấm men Hình 3.4 Khả sinh enzyme Hình 3.5 Khả sinh enzyme protease chủng D3, M1 cellulase chủng D3, M1 Từ bảng kết trên, nhận thấy có chủng nấm men có khả sinh loại enzyme ngoại bào M1, D3 Các chủng nấm men có khả sinh enzyme ngoại bào mức độ trung bình - Các chủng nấm men N2, D2, D4 có khả sinh enzyme protease mức độ trung bình – khá, riêng N2 cịn có khả sinh enzyme amylase yếu, cịn lại chủng nấm men khác khơng có khả sinh enzyme ngoại bào 3.2.3 Khả đề kháng kháng sinh chủng nấm men Mục đích việc tạo chế phẩm probiotic thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm để hạn chế, thay việc lạm dụng thuốc kháng sinh Nên việc chủng nấm men đƣợc tuyển chọn cần khả kháng kháng sinh Tiến hành xác định khả kháng kháng sinh thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.4 hình 3.6 27 Bảng 3.4 : Khả kháng kháng sinh chủng nấm men STT Chủng GE30 GE50 TT30 TT50 ST30 ST50 D3 + + + + + + M1 + + + + + + Ghi chú: (+): kháng mạnh GE: Gentamycin GE50 (30): (-): không kháng ST: Streptomycin Gentamycin nồng độ TT: Tetracylin 50 (30) µg/ml Hình 3.6: Khả đối kháng kháng sinh nồng độ 30 (50) µg/ml chủng nấm men Vớ i kết thu đƣợc bảng 3.4 hình 3.6, thu đƣợc kết chủng nấm men D3, M1 có khả kháng kháng sinh mạnh Đây tính chất quan trọng chủng probiotic Trong trình điều trị có mặt kháng sinh khơng làm ảnh hƣởng đến hoạt tính nhƣ tồn chủng nấm men M1, D3 đƣờng ruột  Kết hợp với khả đối kháng với vi sinh vật gây bệnh nhƣ khả sinh enzyme ngoại bào nấm men, tuyển chọn đƣợc chủng nấm men M1và D3 có chứa đặc tính chủng vi khuẩn hữu ích ứng dụng tạo chế phẩm probiotic 3.3 Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa nấm men 3.3.1 Khả lên men loại đƣờng 28 Bảng 3.5 Khả lên men loại đường chủng nấm men Loại đƣờng Khả lên men Glucose + Saccarose + Fructose + Maltose + lactose - Ghi chú: (+) dƣơng tính, có khả lên men (-) âm tính, khơng có khả lên men Từ bảng cho thấy, chủng nấm men có khả lên men với hầu hết loại đƣờng không lên men đƣợc với đƣờng lactose 3.3.2 Kết phân giải urea khử nitrat nấm men Urea nguồn nitrat tự nhiên dễ gặp, việc phân giải urea khử nitrat sinh khí NH3, NO2 q trình phản ứng, chất không tốt cho sinh sống vật nuôi Tiến hành thực nghiệm, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.5 hình 3.9, 3.10 Bảng 3.6: Khả khử nitrat phân giải ure nấm men Chủng M1 D3 Phân giải Urea - - Khử nitrat - - Khả Chú thích (-): âm tính - khơng có khả phân giải urea, nitrat (+): dƣơng tính – có khả phân giải urea, nitrat 29 Hình 3.7: Khả phân giải Hình 3.8: Khả phân giải nitrat urea nấm men nấm men Từ hình 3.7 hình 3.8, nhận thấy chủng nấm men khơng có khả phân giải urea khử nguồn nito nitrat 3.3.3 Hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men Saccharomyces lựa chọn Sau phân lập, tinh nấm men, tiến hành nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào khuẩn lạc, thu đƣợc kết nhƣ hình dƣới D3 D3 M1 M1 Hình 3.9 : Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng nấm men Tổng hợp kết nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh lý sinh hố chủng nấm men đƣợc tóm tắt bảng 3.7 30 Bảng 3.7 So sánh đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hố chủng nấm men M1, D3 với chi Saccharomyces Đặc điểm chi Các đặc điểm Chủng M1 Chủng D3 Saccharomyces (Bergey, 2004) Hình thái khuẩn Hình trịn, lạc bóng Hình thái tế bào Hình trịn, elip Hình trịn, elip Trịn, elip Khả lên lên men: lên men: Có khả lên men men loại glucose, glucose, loại đƣờng khác đƣờng maltose, maltose, fructose, fructose, saccarose; saccarose; không lên men không lên men đƣờng lactose đƣờng lactose không khơng khơng khơng khơng khơng rõ Khả sử Hình trịn, bóng Khuẩn lạc dạng bột nhão, bóng dụng nitrat Khả phân giải urea So sánh đặc điểm chủng nấm men D3, M1 với đặc điểm chung chi Saccharomyces theo khoá phân loại Bergey, 2004, chúng có đặc điểm tƣơng đồng Vậy, kết luận chủng nấm men M1, D3 thuộc chi Saccharomyces 3.4 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến tạo sinh khối tế bào chủng nấm men 3.4.1 Ảnh hƣởng thời gian tới tạo sinh khối tế bào chủng nấm men Thời gian yếu tố quan trọng định đến tạo sinh khối chủng vi sinh vật Tại thời điểm khác tạo sinh khối chủng vi 31 sinh vật khác Tiến hành xác định ảnh hƣởng yếu tố thời gian đến tạo sinh khối tế bào nấm men thu đƣợc kết nhƣ bảng dƣới đây: Bảng 3.8: Ảnh hưởng thời gian đến tạo sinh khối chủng nấm men Thời gian Sinh khối tế bào chủng thời điểm khác (mg/ml) Chủng giờ 12 18 24 M1 ± 0,125 40 ± 1,137 47 ± 1,122 60 ± 2,010 53 ± 1,713 D3 ± 0,111 35 ±1,011 43 ± 1,133 54 ± 1,313 43 ± 1,108 Theo kết qủa bảng 3.8 thu đƣợc, thời điểm 18 thu đƣợc lƣợng sinh khối tế bào lớn nhất, thời điểm khác lƣợng sinh khối thu đƣợc Vậy chọn thời điểm 18 để tiến hành khảo sát yếu tố 3.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới tạo sinh khối tế bào chủng nấm men Sau tiến hành nuôi chủng nấm men Saccharomyces môi trƣờng Hansen dịch thể dải nhiệt độ 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, với pH = 7, tốc độ lắc 200 vòng/phút 18 giờ, thu dịch sinh khối, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.9 dƣới Bảng 3.9: Ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ đến tạo sinh khối nấm men Nhiệt độ Sinh khối tế bào chủng nhiệt độ khác (mg/ml) Chủng 250C M1 D3 60 ± 2,215 56 ± 2,112 300C 350C 60 ± 1, 118 66 ± 1,112 55 ± 1,123 62 ± 1,723 400C 450C 40 ± 1,141 37 ± 0,712 35 ± 0,987 30 ± 0,863 Từ kết thu nhận, nhiệt độ 350C, thu đƣợc khối lƣợng sinh khối lớn Vậy, chọn nhiệt độ 350C để khảo sát ảnh hƣởng yếu tố 32 3.4.3 Ảnh hƣởng dải pH ban đầu tới tạo khối chủng nấm men Trong môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn, nồng độ pH ban đầu môi trƣờng làm thay đổi áp suất tế bào, ảnh hƣởng đến sinh trƣởng trao đổi chất vi sinh vật Tiến hành xác định ảnh hƣởng dải pH ban đầu tới tạo khối chủng nấm men môi trƣờng Hansen dịch thể 18 giờ, nhiệt độ 350C, tốc độ lắc 200 vòng/phút, thu nhận đƣợc kết bảng sau Bảng 3.10: Ảnh hưởng pH ban đầu đến tạo sinh khối chủng nấm men PH Sinh khối tế bào chủng pH khác (mg/ml) Chủng 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 M1 125 ± 3,33 125 ± 2,12 140 ± 2,15 120 ± 2,67 115 ± 2,45 D3 120 ± 2,17 119 ± 3,14 134 ± 1, 77 114 ± 1,03 110 ± 1,98 Trong độ pH sinh khối tế bào cao độ pH = 6,5 vào thời điểm 18 nhiệt độ 350C đạt sinh khối 140, 134 mg tƣơng ứng với chủng M1, D3 Còn lại pH khác lƣợng sinh khối tế bào thấp 3.3.4 Ảnh hƣởng tốc độ lắc đến tạo sinh khối tế bào Tốc độ lắc ảnh hƣởng đến cung cấp oxy cho vi sinh vật, ảnh hƣởng đến trình trao đổi chất, sinh trƣởng tạo sinh khối chủng nấm men Sau 18 nuôi môi trƣờng Hansen dịch thể với nhiệt độ 350C, nồng độ pH ban đầu = 6,5; thu đƣợc kết bảng dƣới 33 Bảng 3.11: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến tạo sinh khối chủng nấm men Tốc độ Sinh khối tế bào chủng tốc độ lắc khác lắc (mg/ml) Chủng 100 150 200 vòng/phút vòng/phút vòng/phút vòng/phút M1 80 ± 1,27 90 ± 2,43 125 ± 2,15 145 ± 1,77 D3 74 ± 1,13 83 ± 1,97 120 ± 2,63 138 ± 2,01 Theo kết nhƣ bảng 3.11, nhận thấy thu hồi sinh khối nấm men chủng điều kiện nuôi cấy máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút: 145 mg (M1) 138 mg (D3) tối ƣu so với chế độ lắc tiến hành khảo sát Vậy điều kiện tối cho sinh trƣởng phát triển chủng Saccharomyces là:  Môi trƣờng Hansen  Thời gian thu sinh khối tốt vào thời điểm 18 Nhiệt độ ni cấy 350C  Tốc độ lắc 200 vịng/phút  PH ban đầu = 6,5  Kết tƣơng đồng với kết Ngô Mỹ Yến, Trần Thanh Thủy, “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm men Saccharomyces sp.02” in tạp chí Khoa học, tháng 8, 2006 (18 giờ, 350C, pH = 6,5; 170 vịng/phút) Hồng Văn Hải, “Nghiên cứu điều kiện sinh trƣởng tối ƣu nấm men Saccharomyces Cao Bằng”, luận văn thạc sĩ sinh học, năm 2012 (18 giờ, 350C, pH = 6, 180 vòng/phút) 34 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã phân lập đƣợc 10 chủng nấm men từ nguồn nƣớc lên men: M1, M2, N, N1, N2, D1, D2, D3, D4, L1 Đã sàng lọc đƣợc chủng D3, M1 có hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định, có khả kháng loại kháng sinh, có khả sinh enzyme ngoại bào Đã xác định đƣợc đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng D3, M1: khơng có khả phân giải urea, khơng có khả khử nitrat, khơng có khả lên men đƣờng lactose, có khả lên men đƣờng: glucose, saccarose, fructose maltose Đã xác định đƣợc điều kiện ni cấy thích hợp cho tạo sinh khối chủng nấm men đƣợc tuyển chọn M1, D3: thời gian 18 giờ, nhiệt độ 350C, pH = 6,5 tốc độ lắc 200 vòng/ phút 4.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, trình độ chun mơn cịn hạn chế nên thực tất nội dung nghiên cứu cách sâu sắc đầy đủ Vì vậy, có điều kiện tiếp tục nghiên cứu vấn đề này, xin đề nghị nghiên cứu tiếp số nội dung sau:  Tuyển chọn thêm số đặc tính probiotic  Định danh đến loài chủng nấm men tuyển chọn  Tạo chế phẩm thử nghiệm động vật 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Thị Chính (chủ biên), Trƣơng Thị Hoa , Vi sinh vật y học, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, 2005 [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục: tr 224 - 230, 1997 [3] Nguyễn Lân Dũng Nghiên cứu số loại nấm men phân lập Việt Nam để nâng cao chất lượng thức ăn gia súc gia cầm Tin tức hoạt động khoa học, 8.1969 [4] Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phƣợng, Lê Ngọc Mỹ, Bệnh đường tiêu hóa lợn, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, 1995 [5] Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu, "Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic," in Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 251-255, 2003 [6] Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng, Trƣơng Thị Hồng Vân., Võ Minh Sơn , "Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm," in Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, pp 75 - 79, 2003 [7] Nguyễn Thị Khả Giáo trình Vi sinh Cơng nghiệp Trƣờng Cao đẳng Công nghệ Kinh tế Hà Nội 2010 [8] Trần Thị Ái Liên, "Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic," Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, 2011, pp - 9, 39 - 40 [9] Hội Nhi khoa Tp Hồ Chí Minh, "Bacillus clausii vai trò probiotics điều trị tiêu chảy," in Báo cáo hội thảo chuyên đề probiotic, 2007 [10] Hội Chăn ni Việt Nam, Probiotic - lợi ích triển vọng, Tạp chí chăn ni: tr.5 -9, 2008 [11] Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ, in Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp.HCM, 2008, pp - 11, 17 - 19 [11] Lƣơng Đức Phẩm, Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội: 112 -152, 2008 [12] Lê Khắc Quảng, Công nghệ EM - Một giải pháp phòng bệnh cho gia cầm có hiệu quả, Báo cáo chuyên đề khoa học, 2004 [13] PGS.Ts Nguyễn Xuân Thành, T.s Nguyễn Bá Hiên, T.s Hồng Hải, Vũ Thị Hoan Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp NXBGD, Hà Nội, 2010 [14] Nguyễn Xuân Thành Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2007 [15] Hồ Trung Thông, Hồ Lê Huỳnh Châu, "Nghiên cứu khả sống mơi trường đường tiêu hóa động vật số chủng VSV nhằm bƣớc chọn lọc tạo nguyên liệu sản xuất probiotics," 82 - 84, Tạp chí khoa học, Trƣờng Đại học Nông lâm, Đại học Huế, 2009 [16] Trần Thị Thanh Thủy, "Khảo sát tác dụng thay Kháng sinh probiotic phòng ngừa tiêu chảy E.coli heo con," in Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Trƣờng ĐH Nông lâm Tp Hồ Chí Minh, 2003, pp 21 - 24 , 28 - 43 [17] Lê Ngọc Tú, La Văn Phú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, Enzyme vi sinh vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật, 1982 [18], Ngô Mỹ Yến, Trần Thanh Thuỷ, “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng nấm men Saccharomyces sp.02 ” in Tạp chí khoa học, trƣờng đại học Sƣ phạm T.p HCM [19] Nguyễn Khắc Tuấn Tuyển chọn số chủng nấm men từ bánh men cổ truyền để sản xuất số chế phẩm sinh học sử dụng chăn nuôi lợn Luận án phó tiến sĩ, Hà Nội, 1996 [20] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, Công nghệ vi sinh môi trường, NXB Giáo dục, 2009 [21] Đào Thị Thanh Xuân, in Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lý môi trường nước nuôi thủy sản, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà Nội, 2008, pp 15 - 27, 32 - 35, 47 - 53 Tài liệu nước [22] Arturo A., Mario Rosa M., and Maria A M., Probiotic for animal nutrition in the European Union, Regulation and safety assessments: pp 91-95, 2006 [23] Zhu S.Y., Zhong T., Pandya Y and Joerger R D., 16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens, Appl Microbiol: 68, pp 124–137, 2002 [24] Bula J.A, Costilow R, Sapple E.S., Biology of Bacillus popillae, Adv Appl, Microbiol: pp 1- 18, 1978 [25] Vander Wielen P.W.J, Biesterveld J S., Notermans S., Hofstra H and Van knapen F., Role of volatile fatty acid development of the cecal microflora in broiler chicken during growth, Appl Environ Microbiol: 66, pp 2536-2540, 2000 [26] Schat K.A and Myers T J., Avian Intestinal Immunity, Crit Rev Poult Biol: 3, pp 19–34, 1991 [27] Savage D.C, Factors influencing biocontrol of bacterial pathogens in the intestine, Food Technol: 41, pp 82-97, 1987 [28] Sander M.E, Morelli, L and Tompkins, T A., Sporeformers as human probiotic: Bacillus, sporolactobacillus, and Brevibacillus, Comprehensive Review in food Science and food Safety 2: pp 101 - 110, 2003 [29] Patterson J.A and Burkholder K.M, Application of prebiotics and probiotics in poultry production, J Animal Science: 82, pp 627-631, 2003 [30] McCracken V J and R G Lorenz, The gastrointestinal ecosystem: Aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota, Cell Microbiol: 3, pp 1–11, 2001 [31] Hong H.A., Duc le, H., and Cutting, S.M., The use of the bacterial spore formers as probiotics, FEMS Microbiol Rev 29: pp 813 - 835, 2005 [32] Henrich S, Acute pancreatitis: ABCs, Ann Surg: 243, pp 154–168, 2006 [33] Gong J, Forster R J., Yu H., Chamber J.R., Sabour P.M., Wheatcroft R and Chen S., Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen, FEMS Microbiol Lett: 208, pp - 7, 2002 [34] Vahjen W., Glaser V and Simon O., Influence of xylanase supplemented feed on the development of selected bacterial groups in the intestinal tract of broiler chicks, J Agr Sci.: 130, pp 489 - 500, 1998 [35] Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals” J Appl Bacteriol, 66, pp 65–78 [36] Fuller R (1992), “History and development of probiotics”, In: R Fuller (Ed.) Probiotics: The Scientific Basis pp 1−8 Chapman & Hall, London [37] Schillinger U (1996), “Potential of antagonistic microorganisms and bacteriocins for the biological preservation of foods”, Trend in food Science and Technology, 64, pp 158-164 PHỤ LỤC Pha dung dịch lugol Thành phần Khối lƣợng/ thể tích KI 2g Iodine 1g Nƣớc cất 300ml Dung dịch thuốc thử phản ứng phân giải protein nấm men Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 theo Sorensen a Dung dịch dinatri hydrophosphat: 23,9g Na2HPO 12H2O hòa tan dẫn nƣớc đến 1000ml b Dung dịch dinkaly hydrophosphat: 9,07 g hòa tan dẫn nƣớc đến 1000ml Dung dịch đệm có pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch a số ml dung dịch b theo bảng phối trộn dƣới đây: a (ml) b (ml) pH 10 990 121 879 612 388 969 31 Chuẩn bị thuốc thử Griees Dung dịch A: hòa tan 0,5 g axit sunfanilic 100ml dung dịch axit axetic 12% Dung dịch B: lấy 0,4g α-naphtylamin hòa với vài giọt axit axetic đặc trộn với 300ml axit axetic 12% Axit axetic 12%: lấy 125ml aaxit đặc hòa với nƣớc đến 1000ml Hỗn hợp dung dịch A dung dịch B theo tỉ lệ thể tích 1: gọi thuốc thử Griess Thuốc thử Diphenylamin: Hòa tan 0,5 g diphenylamine với 100ml H2SO4 đặc, thêm 20ml nƣớc cất