Phản ứng chuỗi polymerase (pcr) pptx

Phản ứng chuỗi polymerase (pcr) TÓM TẮT : Thử nghiệm PCR đã thật sự làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử với các áp dụng kỳ diệu trong mọi lãnh vực. Ngày nay PCR có thể được triển khai áp dụng tại bất cứ một phòng thí nghiệm nào thử nghiệm được thực hiện tương đối đơn giản, giá thành của thử nghiệm không còn quá cao đến nỗi không thể chấp nhận được như trước đây. PCR, THE GREAT REVOLUTION IN MOLECULAR BIOLOGY SUMMARY With the fantastic applications in all scientific fields, PCR has really done a great revolution in molecular biology. Today PCR can be set up at any laboratory because the PCR technique is very simple, and the price cost of one test in not unacceptable as before. Vào năm 1985, trong một đêm trăng sáng ở tiểu bang California , trên đường lái xe dọc theo bờ biển, một ý tưởng chợt xuất hiện trong đầu của một nhà sinh hóa học rất tầm thường, làm việc cũng tại một phòng thí nghiệm hết sức tầm thường. Ý tưởng này khi trở thành hiện thực, chính là thử nghiệm PCR, đã làm một cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử và đã đưa tác giả của nó, K.B Mullis, đến giải Nobel y học. THỬ NGHIỆM PCR LÀ GÌ ? Nguyên tắc của thử nghiệm PCR PCR là một thử nghiệm nhằm khuếch đại chuỗi nucleic acid đích thành hàng tỷ bản sao để sau đó có thể phát hiện được. Ðể thực hiện được việc khuyếch đại acid nucleic đích, thử nghiệm PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt mà mỗi chu kỳ có 3 bước (hình 1), mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút, tuần tự như sau : (1) Ðầu tiên là nhiệt độ được nâng lên khoảng 94 0 C để làm biến tính nucleic acid đích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), đây là giai đoạn làm biến tính (denaturation) DNA đích (11) . Kế đó là giai đoạn bắt cặp (anealing), lúc này nhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuống khoảng 55 0 C để các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu thì những sản phẩm PCR (PCR product) sẽ đặc hiệu (111) Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension), lúc này nhiệt độ được nâng lên khoảng 72 0 C là nhiệt độ tối hảo để men polymerase chịu nhiệt xúc tác phản ứng tổng hợp bản sao của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung trên khuôn là các sợi đơn (ssDNA) đích đã được đoạn mồi bắt bặp vào trước đó (ở giai đoạn bắt cặp). Sự tổng hợp này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside tri phosphate (dNTP), và chiều của sự tổng hợp là 5� � 3� (đoạn mồi) hay 3�� 5� (ssDNA đích) [1,3] . Sau 30 đến 40 chu kỳ nhiệt, để hoàn tất thử nghiệm PCR, thường nên có thêm một giai đoạn gọi là bù thêm (soaking). Giai đoạn này nhiệt độ được giữ 72 0 C trong thời gian tương đối lâu, từ 10 phút đên 1 giờ. Ðây là giai đoạn để một số các bản sao của DNA đích vì một lý do nào đó trong các giai đoạn kéo dài của các chu kỳ PCR, không kéo dài được một các đồng bộ như các bản sao khác, có thể kéo dài hoàn tất nốt chiều dài của nó. Trong những chu kỳ nhiệt đầu, sản phẩm PCR thường có kích thước không đều nhau vì chuỗi bổ sung được tổng hợp trên khuôn mẫu của chuỗi đích có trong bệnh phẩm. Càng về sau thì khuôn mẫu để tổng hợp chuỗi bổ sung chính là các sản phẩm PCR, nên kích thước của các sản phẩm PCR rất đều nhau (hình 1). Hình 1 : Nguyên tắc của thử nghiệm PCR. Như vậy từ một số lượng N DNA đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR đã tổng hợp được N.2 n bản sao. Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là sản phẩm PCR (PCR product) hay amplicon, lớn như vậy (trên 10 9 bản sao sau 30 chu kỳ), chúng dễ dàng được phát hiện bằng các phương pháp phát hiện nucleic acid (điện di phát hiện kích thước của sản phẩm bằng probe tóm bắt, Southern blot rồi phát hiện sản phẩm). Các thành phần tham gia thử nghiệm PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau đây :  DNA hay nuceic acid đích, tức là chuỗi acid nucleic (ví dụ đoạn acid nucleic đặc hiệu của vi khuẩn gây bệnh, của gene bệnh lý, của dấu ấn di truyền,. ) mà phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên để chúng có thể được phát hiện trong bệnh phẩm. Phản ứng PCR sẽ không xảy ra được nếu bệnh phẩm không có nucleic acid đích. Một trường hợp khác là trong bệnh phẩm có nucleic acid đích, nhưng do bệnh phẩm được sửa soạn không thích hợp hoặc không đúng cách nên nucleic acid đích không bộc lộ ra ; hoặc trong bệnh phẩm hãy còn các chất ức chế phản ứng PCR. Trong những trường hợp này kết quả PCR sẽ âm tính, nhưng là âm tính giả. Vì vậy vấn đề sửa soạn bệnh phẩm cho thử nghiệm PCR phải được coi trọng, đặc biệt trong các phòng thí nghiệm áp dụng PCR để chẩn đoán phát hiện bệnh.  Primer hay đoạn mồi, tức là những đoạn DNA đơn (oligonucleotide) có kích thước chỉ vài chục base (18-30), có thể bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đan. Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu. (11) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3�, (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Thông thường trong phản ứng PCR, người ta dùng một cặp mồi, gọi là primer set, trong đó có một mồi lên gọi là up-stream primer và một mồi xuống gọi là down-stream prime. Cặp mồi này quyết định nên kích thước củasản phẩm PCR. Chúng càng bắt cặp trên chuỗi đích xa nhau bao nhiêu thì kích thước của sản phẩm PCR càng lớn bấy nhiêu và ngược lại, càng gần nhau bao nhiêu thì kích thước càng nhỏ bấy nhiêu.  dNTP, deoxy nucleoside triphosphate, tức là đơn vị để có thể tổng hợp được các bản sao của DNA đích. DNTP có cấu tạo gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là adenine (dATP) hay thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay guanine (dGTP) , ở carbone số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3� của chuỗi bổ sung trên chuỗi đích. Năng lương để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lương của triphosphate trên dNTP. Ðó cũng chính là lý do tại sao phải là dNTP chứng không phải là dNDP (diphosphate) hay dNMP(monophosphate).  Men polymerase, phải là men polymerase chịu được nhiệt độ. Ngày nay có nhiều loại polymerase chịu được nhiệt độ đã được ly trích hoặc tổng hợp, tùy mục đích sử dụng mà chúng ta có thể chọn polymerase thích [...]... Thường dùng nhất trong các phòng thí nghiệm là men Taq polymerase Là men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus, là các vi khuẩn sống được trong các suối nước nóng Dung dịch đệm cho phản ứng PCR, thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl�2 1.5mM Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide nữa Trong... Cũng nhờ sự sử dụng các men polymerase chịu nhiệt mà giai đoạn bắt cặp của đoạn mồi vào nucleic acid đích được đặc hiệu hơn vì được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, do đó phản ứng PCR trở nên đặc hiệu hơn Cho đến nay, đã có hàng chục loại polymerase chịu nhiệt đã được phát hiện và tổng hợp ra [1] Có những men polymerase trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Thermus aquaticus (Taq polymerase) , Thermus thermophilus... lần (đầu pipette, ống nghiệm phản ứng, ống nghiệm sửa soạn bệnh phẩm,.) Ngoài ra còn phải áp dụng nhiều biện pháp để loại trừ ngoại nhiễm Hiện nay có lẽ hiệu quả nhất là sử dụng phương pháp nội tại loại trừ ngoại nhiễm : đó là trộn sẵn trong ống nghiệm làm phản ứng PCR men Uracil N Glycosylase (UNG) là men có khả năng phá hủy các sản phẩm PCR ngoại nhiễm trước khi phản ứng PCR xảy ra[4] Chính nhờ việc... đúng mục đích của mình Máy chu kỳ nhiệt Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, thử nghiệm PCR được thực hiện bằng cách liên túc chuyển các ống nghiệm phản ứng PCR vào các máy các thủy có nhiệt độ khác nhau để tạo ra được các chu kỳ nhiệt cho phản ứng Dau đó công việc bằng tay nhàm chán và nặng nhọc này được thay thế bằng các robot tương đối cồng kềnh và đắt tiền Ngày nay, thử nghiệm PCR được thực... MẠNG SINH HỌC PHÂN TỬ Sự phát hiện ra các men polymerase chịu nhiệt độ Chính việc phát hiện được các men polymerase chịu nhiệt là bước tei61n đầu tiên đã làm thử nghiệm PCR trở nên đơn giản hơn Thử tưởng tượng nếu không men polymerase chịu nhiệt thì thử nghiệm PCR sẽ phức tạp và kém hiệu quả bao nhiêu một khi mà cứ sau mỗi chu kỳ nhiệt lại phải thêm men polymerase mới vào vì men cũ đã bị hủy bởi nhiệt... thể thêm tween hay formamide nữa Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất Ngoài ra, một thiết bị hết sức quan trọng cho thử nghiệm PCR là máy chu kỳ nhiệt (thermal cycler) là máy có thể đưa nhiệt độ... thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu), Có những men polymerase chịu nhiệt được tổng hợp từ các ci khuẩn không chịu nhiệt nhưng mang gen tái tổ hợp từ các vi khuẩn chịu nhiệt như Ampli Taq, Vent (exo), Có những men polymerase chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai (proofreading) khi tổng hợp chuỗi nucleic acid bổ sung (3-5exonuclease) như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu, Nhờ vậy... phương pháp thứ hai này, nhờ vậy mà máy trở nên rất gọn nhẹ, giá thành rẽ hơn gấp nhiều lần so với trứơc đây Ví dụ hiện nay chúng ta có thể trang bị cho phòng thí nghiệm máy chu kỳ nhiệt nhỏ có 16 giếng phản ứng, với giá chỉ khoảng 1800 USD (minicycler của hãng MJ research) so với hàng chục ngàn USD như trước đây PCR Ðà LÀM NÊN MỘT CUỘC ÐẠI CÁCH MẠNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ PCR và các áp dụng của nó hiện... các vi sinh vật này, không cần phải nuôi cấy được vi khuẩn Ðây là một đóng góp rất lớn trong nghiên cứu dịch tễ học tìm hiểu mối liên quan của các tác nhân gây bệnh trong cộng đồng Một chứng minh hết sức nỗi tiếng trong ứng dụng này là trường hợp "nha sĩ Florida" (Florida dentist) : Nhờ có PCR mà người ta đã xác định được 3 bệnh nhân khám điều trị răng đã bị nhiễm HIV từ một nguồn gốc là vị nha sĩ nọ... máy đo nhiệt độ điện tử : Khi áp hai mãnh kim loại vào nhau và khi có sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại thì sẽ sinh ra một dòng điện và chính sự lưu thông của dòng điện này khi đo lường ra sẽ phản ánh sự cách biệt nhiệt độ giữa hai mãnh kim loại Hiệu quả Peltier ngược lại vận hành theo kiểu ngược lại, nghĩa là khi tạo ra một dòng điện giữa hai mãnh kim loại thì sẽ tạo ra được một sự cách biệt . Phản ứng chuỗi polymerase (pcr) TÓM TẮT : Thử nghiệm PCR đã thật sự làm một cuộc đại cách mạng trong. đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc. tử deoxyribose này và đây chính là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3� của chuỗi bổ sung trên chuỗi đích. Năng lương để cho phản ứng này xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàu năng lương của triphosphate