Đề tài : áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR-RFLP) để phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn Tác giả : Hoàng văn tân Viện sốt rét kí sinh trùng trung ương
Trang 1BỘ Y TẾ
VIỆN SỐT RÉT- KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNGTRUNG ƯƠNG
BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP VIỆN
TÊN ĐỀ TÀI: -
AP DUNG KY THUAT PHAN UNG CHUO! POLYMERASE (PCR-RFLP) DE PHAN BIET
GIUN DUA NGƯỜI VẢ GIUN ĐÙA LỢN
Chủ nhiệm đề tài: Th.s Hoàng Văn Tân
Cơ quan chủ trì để tài: — Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn trùng
Trung ương
Hà Nội, năm 2007
Fu Lh
Trang 2BỘ Y TẾ
VIEN SOT RÉT- KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNGTRUNG ƯƠNG
BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP VIỆN
TÊN ĐỀ TÀI: _
ÁP DỤNG KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUÔI
POLYMERASE (PCR-RFLP) ĐỂ PHÂN BIỆT
GIUN DUA NGUGI VA GIUN DUA LON
Chủ nhiệm đề tài: Th.s Hoàng Văn Tân
Trang 3BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP VIỆN
Tên đề tài: Áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR-RELP) để
phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn
1.Chủ nhiệm đề tài: Th.s.Hoàng Văn Tân
2.Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn trùng Trung ương
3.Cơ quan quản lý đề tài: Viện Sốt rét- Ký sinh trùng- Côn
trùng Trung tơng 4.Danh sách những người thực hiện chính:
Th.s Hoàng Văn Tân Viện Sét rét-KST- CITU
Th.s.Nguyén Thi Huong Binh Viện Sốt rét-KST- CTTƯ PGS.TS.Nguyễn Đức Mạnh Viện Sốt rét-KST- CTTƯ Th.s Lê Đức Đào Viện Sốt rét-KST- CITƯ
Th.s Hà Viết Viên Viện Sốt rét-KST- CTTƯ
Trang 4CAC CHU VIET TAT
PCR-RELP: Phản ứng chuỗi Pholymerase phan tich tính đa hình độ
đài đoạn phân cắt giới hạn KST : Ký sinh trùng
§L : Số lượng
ITS-1 : Vung phiên mã trong TTS-2 : Vùng phiên mã trong
ADN : axit dezoxyribonucleic
dNTP, : dezoxy nucleotide triphophate dATP : dezoxy adenosine triphophate dGTP :.dezoxy guanidine triphophate ‘ dCTP : dezoxy cytosine triphophate dTTP : dezoxy thymidine triphophate
Taq - Polymerase: enzym polymerase cua Themophilus Buffer : Dung dich dém
Primer: Méi
TE: (Tris-base + EDTA)
EB: Extraction buffer
PBS _: phophate buffered saline (Dém phốt phát) bp : base pair ( Doi bazo nit )
- HỈ : microlit
Trang 5Loi cam on
Đề tài được hoàn thành tại Khoa Sinh học Phân tử Viện Sốt rét - Ký
sinh trùng - Côn trùng Trung Ương
Hoàn thành đề tài này tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của Th.s
Nguyễn Thị Hương Bình, sự giúp đỡ chu đáo của GS.TS Nguyễn Đức Mạnh,
sự cộng tác nhịp nhàng của Th.s Hà Viết Viên và các anh chị em trong Khoa Chúng tôi vô cùng cảm ơn sự tạo điều kiện thuận lợi của Lãnh đạo
Viện, đặc biệt là sự giúp đỡ và tạo điều kiện của Khoa Sinh học Phân tử,
Phòng Quản lý Khoa học Viện, Phòng Kế hoạch Tổng hợp và Phòng Kế Toán tài chính, cùng các phòng chức năng có liên quan đã giúp chúng tôi
hoàn thành đề tài đúng tiến độ
Tôi xin trân trọng cảm ơn mọi sự giúp đỡ qúi báu đó !
Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2007
[Ue
Lo
Trang 6MỤC LỤC
PHẦN A.TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI me
1.KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 2.2 n2 1 ve, 1
2.ÁP DỤNG VÀO THỰC TIỀN SẲN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG XÃ HỘI 2
3.ĐÁNH GIÁ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN ˆ CỨU ĐÃ ĐƯỢC DUYỆT - 1 1 1112 2211 1112121211211 2
4 CÁC Ý KIẾN ĐỂ XUẤT - G1 SE1E112152112111121111 1x1 xe 2
PHAN B NO! DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIÊN CỨU 3
>0 1/020 3
2.TỔNG QUAN TAI LIEU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 4
2.1.Nghiên cứu trong nước . -‹- sàn nọ n* He nàn HH Hàn Hàn hen
2.2.Nghiên cứu nước ngoài
3 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
211" 8
3.1.Thời gian nghiên eee entree et nee renee nent tenet res 8
3.2.Địa điểm nghiên cứu - HH HH ng HH nh ng nh kh 8 3.3 D6i tugng nghién CUU cece cece e tence cee ee nae te etree a see ene teeees 8
3.4.Phương pháp nghiên CỨU - on nh nh Hà 8
3.4.1 Thiết kế nghiên cứu - .c- cu SH HY nh nh nh nhe oe 9
ky» l1 eet teperes 7
3.4.3.Các kỹ thuật sử đụng trong nghiên cứu .- - sàn cà ec 8 3.4.3.1.Thu thập mẫu và bảo quản mẫu nàn se 8
3.4.3.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng dấu hiệu hình thái 8
3.4.3.3 Phân biệt giun đữa người và giun đữa lợn bằng kỹ thuật PCR 8
Trang 74.1:Tình hình nhiễm giun tại điểm nghiên cứu cà cse 12
4.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn à cà nànseehheneeeiee 13 :_4.2.1.Phân biệt hình thể giun đữa người và giun đữa lợn : kim 13
4.2.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR-
REP ooo cence eect eee nà TH TK TK SH Tà kh cà th nh ác cơn l6
4.2.2.1 Sản phẩm PCR của giun đũa người và giun đữa lợn khi chưa cắt enzym Hately ha ee eeeeeeteeeteeeanebbeaeeeweneereeeegs 16 4.2.2.2.Sản phẩm PCR của giun đũa người và giun đũa lợn đã cất enzym 210 e ic cccecne eee eect e eee nee ten een ete ees neeegeneceaeseeteseesetenaeetiees 17 5 BÀN LUẬN L2 S2 22221 1H 1 2 tk te 18 S.1.Kích thước g1un - -c HH ni ch kg 18 5.2.Hinh ảnh răng của ascaris lumbricoides và asCariS suum
5.3.Phan biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật
Trang 8PHẦN A.TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1.KẾT QUÁ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
1.1.Đóng góp mới của đề tài: Đã bổ sung cho phương pháp định loại một phương pháp chẩn đoán mới (Phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR)
1.2 Kết qủa cụ thể của đề tài:
Chúng tôi đã tiến hành phân tích 119 mẫu giun đũa, trong đó có 68 mẫu giun đũa người
(Ascaris lumbricoides) và 51 mẫu giun đũa lợn của hai xã Phương Trung, huyện Thanh Oai
và xã Phụng Châu, huyện Chương Mỹ tỉnh Hà Tây, bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR - RFLP)
Áp dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng phiên mã thứ nhất (ITS-1) ở giun đũa, sau đó cắt sản phẩm PCR bang enzym Haelll tai vị trí 358 đối với giun đữa người cho ra 2 băng, với kích thước các băng lần lượt là 610 bp và 370 bp Enzym HaelII cat san phẩm PCR của giun đũa lợn tại hai vị trí 131 và 358 cho ra 3 băng, với kích thước các băng lần lượt là 610 bp, 230 bp va 140 bp
Dựa vào số lượng băng cắt và kích thước của các băng, ta có thể phân biệt được giun đữa người, giun đũa lợn Tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi phát hiện được 14,7% giun đữa người có 4 băng, trong đó có một băng chung cho cả giun đũa người và giun đữa lợn (kích thước 610 bp) và một băng của giun đũa người (kích thước 370 bp), hai băng còn lại có kích thước trùng với kích thước hai băng của giun đũa lợn (230 bp và 140 bp)
1.3 Hiệu quả tào tạo: Nâng cao trình độ thực hành kỹ thuật PCR cho các cán bộ nghiên cứu
1.4 Hiệu quả kinh tế và xã hội
Áp dụng phản ứng chuỗi polymerase (PCR - RELP) phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn đã khấc phục được những khó khăn mà phương pháp định loại bằng hình thái gặp phải Mặt khác thông qua kỹ thuật này ta có thể xác định được khả năng nhiễm chéo giun đũa lợn trên người và ngược lại -
2 AP DUNG VAO THUC TIEN SAN XUAT VA DOI SONG
Ứng dụng thực tiễn tại các labo sinh học phân tứ về ky sinh trùng đường ruột trong việc
chẩn đoán phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn
3 ĐÁNH GIÁ ĐỀ TÀI VỚI ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC DUYỆT
a Dé tài đã thực hiện đúng tiến độ ( từ tháng 5/ 2006 -L2/ 2007)
b Da thuc hiện thành công phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR
c Dé tai đã có báo cáo tiến độ và báo cáo tổng kết đúng thời hạn d Đánh giá về sử dụng kinh phí
Đề tài đã sử dụng kinh phí đúng mục đích chuyên môn và đúng nguyên tắc tài chính Tổng số kinh phí được duyệt 46.000.000 đồng kinh phí đã sử dụng 46.000.000 đồng
4.ĐỀ NGHỊ :
Cần tiến hành điều tra tình hình nhiễm chéo giun đũa người và giun đũa lợn trên một quy mô mở rộng lớn hơn và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định loại thành phần
Trang 9PHAN B NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN CUU 1.DAT VAN DE
Bệnh giun đũa là một bệnh xã hội Bệnh nhiễm ở hầu hết mọi lứa tuổi, mọi
giới, từ nông thôn, thành thị đến các vùng núi cao Tác hại bệnh chủ yếu là chiếm chất bổ đưỡng từ thức ăn của vật chủ, làm chậm lớn, chậm phát triển trí
tuệ, bệnh có thể gây tử vong do giun chui ống mật, tắc ruột đo giun v v
Nước ta là nước nông nghiệp, nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa có điều kiện khí hậu, nhiệt độ, ẩm độ và thổ nhưỡng rất thích hợp cho các bệnh ký sinh
trùng đường ruột phát triển, đặc biệt là bệnh giun truyền qua đất rất phổ biến và
nhiễm ở hầu hết mọi lứa tuổi, mọi giới nhưng cao hơn ở lứa tuổi trẻ em Vì vậy
việc phòng và chống bệnh giun đường ruột là một việc làm rất cần thiết và đã từ
lâu là nỗi mong mỏi của nhiều người Trước tình hình đó, nhiều nhà khoa học đã
đi sâu nghiên cứu để tìm ra các biện pháp phòng chống bệnh thích hợp nhằm
làm giảm tỷ lệ và cường độ nhiễm giun trong nhân dân, đặc biệt là lứa tuổi học
sinh
Các nghiên cứu về giun truyền qua đất trước đây chủ yếu nghiên cứu về
bệnh học, điều tra và điều trị bệnh, song do dân cư sống tập trung, điều kiện vệ sinh môi trường còn yếu, môi trường sống quanh ta bị ô nhiễm trứng giun rất
trầm trọng (Võ Viết Hưu và cộng tác viên,1960; Đỗ Dương Thái, Nguyễn Phan
Long, 1973; Hoàng Thị Kim và cộng tác viên, 1987 )[2,3,4] Vì vậy ở miền Bắc
chỉ sau một thời gian ngắn 6 tháng sau điều trị có tới 90% số người bị tái nhiễm
giun đũa ( Đễ Dương Thái và CS (1976) [5]
Trong những năm gần đây, tình hình các bệnh giun truyền qua đất ở nước ta vẫn chưa được cải thiện đáng kể Theo điều tra của Viện Sốt rét Ký sinh trùng-
Côn trùng trung ương (KST-CT.TƯ)1998, cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh giun truyền
qua đất vẫn còn cao ở cả 3 miền Ở miền Bác tỷ lệ nhiễm giun đũa từ 50-95%,
giun tóc từ 58-89%, giun móc từ 3-67% Ở miền Trung tỷ lệ nhiễm giun đũa từ 12,5-70,5%, giun tóc từ 12,7- 47%, giun móc tit 36- 69% Ở miền Nam tỷ lệ
nhiễm giun đũa từ 10- 60%, giun tóc từ O,5-1,7%, giun móc từ 47- 68% [1]
Mặt khác, ở nước ta giun đũa người và giun đũa lợn luôn song song tồn tại Để góp phần vào công tác phòng chống bệnh có hiệu qủa cao, việc phân biệt hai
loại giun đũa nói trên có một ý nghĩa hết sức quan trọng trong công tác phòng
Trang 10loại giun này giống nhau, do vậy khó có thể phân biệt được bằng hình thể giữa hai loại giun nói trên Để giải quyết vấn đề này, việc áp dụng kỹ thuật phân tích
tính đa hình độ dài đoạn phân cắt giới hạn từ sản phẩm PCR để phân biệt giun đũa từ người và từ vật chủ lợn là rất cần thiết Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Áp dụng kỹ thuật phản ững chuỗi polymerase (PCR- RFLP) để phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn '°
Mục đích đề tài:
Ấp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi pholymerase (PCR-RFLP) để phân biệt giun
đũa người và giun đũa lợn
2.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Nghiên cứu trong nước
Định loại dựa vào các đấu hiệu hình thái được áp dụng từ xa xưa và rất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Phương pháp này đã đóng góp to lớn vào việc xác định thành phần loài trong nghiên cứu nói chung và nghiên cứu các bệnh ký sinh trùng nói riêng, phương pháp dựa vào dấu hiệu hình thái vừa kinh tế, vừa đơn giản, lại nhanh và có thể áp dụng ngay tại thực địa Tuy nhiên, phương pháp này
cũng bộc lộ những hạn chế nhất định trong những trường hợp mẫu vật không
điển hình, mẫu vật không còn nguyên vẹn, các mẫu vật có mức độ tương đồng cao v.v thì việc xác định thành phần loài cũng gặp phải những khó khăn nhất định
Đỗ Dương Thái,(1971) khi nghiên cứu về hình thể trứng, ấu trùng và giun trưởng thành thấy rằng hiện vẫn còn khó khăn, chưa phân biệt được giữa giun đũa người và giun đũa lợn, do vậy chưa giúp được cho dịch tế học một cách có hiệu quả Ở nước ta, giun đũa người và giun đũa lợn rất phổ biến và song song tồn tại
Việc xác định hai loại giun là đồng nhất hay tách rời vẫn còn là một vấn đề
nghiên cứu rất cần thiết, vừa có tính ứng dụng trong phân loại, vừa ứng dụng
trong địch tế, bệnh học[ 1]
Theo nghiên cứu của Đỗ Dương Thái (1973), hình thể bên ngoài của trứng,
ấu trùng giun đũa và giun đũa trưởng thành được tác giả mô tả không có gì đặc biệt so với tài liệu cổ điển Theo tác giả, mầu sắc của giun trưởng thành có sự
thay đổi tuỳ theo từng cơ thể và từng mẫu giun Thường giun đũa có mầu sắc thay đổi từ mầu trắng sữa đến mầu hồng nhạt, mầu sắc có liên quan đến sức để
kháng của giun Tác giả cho biết, giun có mầu hồng nhạt thường có khả năng
sống lâu hơn trong môi trường bảo tổn gồm nước sinh lý và glucoza, mầu sắc
Trang 11Một số tác giả lại dựa vào vị trí lỗ sinh duc va 16 bài tiết của giun cái để xác định, nhưng các đặc điểm này thường không ổn định và có thay đổi giữa giun
đũa người A iumbricoides và giun đũa lợn A.suwm Do vậy Krotor, Phạm Hoàng
Thế (1973) đề xuất không dựa vào đặc điểm này để định loại [1]
Ở một số giun đũa người phần đuôi có mấu thịt hình cánh, nhưng mấu thịt
này chỉ có trên một số giun (20%) và chưa xác định được tính chất liên quan đến
định loại (Đỗ Dương Thái, Phạm Hoàng Thế, 1973) So với tài liệu cổ điển,
những dẫn liệu mới và cấu tạo cơ quan sinh dục của giun đũa không có gì khác trước và không có gì sai khác với tài liệu nước ngoài Ngay cả những hình thể của
mẫu vật cắt mảnh cũng không sai khác với kết quả nghiên cứu của thế giới (Đỗ Dương Thái và CS,1973) đo vậy cũng không thể dựa vào những đặc điểm đó để
định loại [1]
Những nghiên cứu phân loại bằng hình thể giữa giun đũa người và giun đũa lợn trước đây chưa thực sự có tính thuyết phục cao, mặt khác nhằm mở ra triển vọng nghiên cứu về gen học trong tương lai, Đoàn Hạnh Nhân (1971) đã bắt đầu nghiên cứu thể nhiễm sắc trên giun đũa của người Tác giả đã dùng tinh hoàn
của giun đực để tách và đếm số thể nhiễm sắc, sau đó cố định thể nhiễm sắc với dung dịch carnoy rồi nhuộm Giêm sa và quan sát Theo tác giả, nhân tế bào của
giun đũa có 24 nhiễm sắc thể, mặt khác hình dạng thể nhiễm sắc giun đũa người
có hình thể từng đôi dạng V, dạng chấm, đạng que, dạng chùy thắt [1]
2.2 Nghiên cứu ngoài nước:
Đã nhiều năm qua, những tranh luận về giun đũa từ người Ascaris
lumpricoides (Linnaeus, 1758) với A.suum (Goeze, 1782) từ lợn có phải là cùng
loài hay là hai loài riêng biệt đã được hàng loạt các nghiên cứu khác tìm đến địa chỉ của câu hỏi này [9,14 ] Với những điều tra cắt ngang, chứng minh giun đũa
ở người có thể nhiễm sang lợn và ngược lại, người cũng có thể nhiễm giun đũa từ vật chủ lợn [14,16,27] Để làm rõ vấn đề này, một số tác giả khác đã nghiên cứu
hai loại giun nói trên dựa vào hình thể {[16, 17, 25, 26], hình thể của ấu trùng giun đũa rất đơn giản và nhỏ, do vậy việc xác định chính xác loài là gặp nhiều khó
khăn [24,26]
Một số nghiên cứu dựa vào răng của giun đũa (Linnaeus,1758;
Sprent,1952; By W.Crewe va David H.Sminth,1970) Theo tác gia Linnaeus
Trang 12Sri S.Abdulrachimax và Lie kian Joe (1954) [25] cũng đồng ý với Sprent, răng của hai loài này là khó xác định, từ nhiều góc độ khác nhau của răng, cả về
hình thái cũng như về kích cỡ nhiều khi không rõ ràng Theo tất giả, răng của giun đũa người có chiều dài 2-7H (thường thường 4-5H) và chiều rộng 2-6 H
(thường thường 4-5H) Trong khi đó giun đũa từ lợn răng có chiều đài 2-11 H (thường thường 5 Ù), chiều rộng 3.9 H (thường thường 5-6H) Các tác giả cho rằng răng của giun đũa lợn thường lớn hơn và có thể nhìn rõ hơn răng của giun
đũa người khi soi dưới kính hiển vi [25]
Khi nghiên cứu 93 mẫu giun đũa trong đó có 50 mẫu giun đũa từ người và
43 mẫu giun đũa từ lợn, tác giả chỉ thấy 38/50 mẫu giun đũa từ người có răng trong đó có 12 mẫu có kiểu răng điển hình còn 26 mẫu có kiểu răng của loại
khác
Ở giun đữa lợn phát hiện 31/ 43 mẫu có răng trong đó có 3 mẫu có răng nhỏ kiểu giun đũa người còn lại 28 mẫu có kiểu răng của loại khác Tuy nhiên, cũng khá nhiều trường hợp răng của giun đũa người thường khó nhìn thấy được do nó có lớp màng có các hạt nhỏ bao phủ còn ở giun đũa lợn, răng gần như nhìn
thấy rõ hơn [25]
Theo đánh giá của Sri S Abdulrachimax va Lie kian Joe (1954), nhin
chung rang của giun đũa người có kích cỡ nhỏ hơn răng giun đũa lợn và sự khác biệt về răng của hai loại giun nói trên là không rõ ràng[25]
Ngoài việc dựa vào răng để phân biệt giun đữa người và giun đũa lợn, M
Ansel và M.Thibaut (1972) còn dựa vào miệng giun đũa để định loại Theo các tác giả, lỗ miệng của giun đũa lợn hình lục giác còn giun đũa người lỗ miệng có hình
tứ giác [8]
Một nhóm nghiên cứu khác lại giám định Ascaris lumbricoides va Ascaris suum bằng các protein Trong quá trình nghiên cứu, các tác giả đã phát hiện ra 6 protein đặc trưng cho giun đũa Ascaris iumbricoides mà không có ở giun đũa lợn Theo các tác giá thì 6 protein đặc trưng đó là:1, 2, 3, 4, 5, 6 tương ứng
118kDa, 116kDa, 110kDa,105kDa, 25kDa va17kDa [29]
Bằng kỹ thuật PCR, các tác giả sử dụng enzym phân cắt giới hạn HaelII, cắt sản phẩm PCR của giun đũa Sau đó, các tác giả sử dụng kỹ thuật điện di,
thấy giun đũa lợn có 3 băng, trong khi đó giun đũa người cho ra 2 băng từ đó tác
giả có thể nhận biết được giun đũa người và giun đữa lợn, thông qua số lượng
băng và kích thước của các băng khi soi dưới đèn cực tím [27, 28]
Anderson 1994, bằng kỹ thuật PCR cho thấy ở Bắc nước Mỹ đã tìm thấy
Trang 13sử dụng bón cây ở vườn và cây nông nghiệp Mặc dù vậy, sự nhiễm chéo trong tự nhiên là có giới hạn (Anderson và CS, 1997), khi tác giả không phát hiện ra trường hợp nào người bị nhiễm giun đũa lợn ở làng Guatemala[7]
Năm 2004, nhóm nghiên cứu hợp tác giữa Đan Mạch và Bangladesh gồm Perter Nejsum, E Davis Parker, Jane Frydenbeng đã tiến hành phân tích 135
mẫu giun đũa ở 5 quốc gia khác nhau trên thế giới, gồm 71 mẫu thu thập từ người
và 64 mẫu thu thập từ lợn, trong đó có 32 mẫu từ 29 người Đan Mạch Khi phân tích 32 mẫu này bằng PCR-RFLP thì có 27 trường hợp do bị nhiễm giun đũa có nguồn gốc từ lợn nội địa Trong số này có trên 80% được biết có tiếp súc với lợn hoặc phân lợn Từ đó các nhà nghiên cứu ra khuyến cáo Đan Mạch cần quan tâm
nhiều đến các bệnh từ thú [23]
Ở Trung Quốc, nghiên cứu về sự thay đổi gen của quần thể giun đũa người
và lợn ở cùng điểm phân bố WelDong Peng; TJ.C Anderson; Xingquan Zhu va
Wkennedy1998, đã chỉ ra một vấn đề quan trọng là có rất ít gen bắt nguồn giữa
quần thể KST người và quần thể KST lợn, mặc đầu lịch sử tiếp súc giữa người và lợn đã có từ rất lâu ở Trung Quốc, đồng thời qua nghiên cứu này các tác giả cũng
Trang 14`
3 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Thời gian nghiên cứu : 18 tháng (5/2006-12/2007) 3.2 Địa điểm nghiên cứu:
- Địa điểm thu mẫu: xã Phương Trung, huyện Thanh Oai và xã Phụng Châu,
huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây
- Địa điểm phân tích mẫu: Labo Sinh học Phân tử Viện Sốt rét- KST- CTTƯ Khái quát một số nét về điểm nghiên cứu:
a/ Xã Phương Trung:
Xã Phương Trung, huyện Thanh Oal, tỉnh Hà Tây là một xã nông nghiệp, có dân số 14 nghìn dân (theo thống kê 3/2006), diện tích lúa nước là chủ yếu chiếm 4/5 diện tích canh tác, diện tích trồng mầu chỉ chiếm 1/5 diện tích canh tác Ngoài vấn đề làm nông nghiệp, nhân dân ở xã còn có nghề phụ làm nón, làm lá và buôn bán, kinh doanh nhỏ
bí Xã Phụng Châu:
Xã Phụng Châu, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây có diện tích trồng mầu
chiếm khoảng 2/3 điện tích canh tác.Trong nông nghiệp, hầu hết các gia đình sử
dụng hai nguồn phân chính là phân chuồng và phân hoá học Nguồn phân chuồng được sử dụng để bón lót là chính và đều quan trọng là phân chuồng hầu hết được ủ kỹ trước khi sử dụng Tuy nhiên thỉnh thoảng vẫn còn một vài gia đình còn dùng phân tươi hoà nước lã để tưới cho ngô, bầu, bí và lúa
3.3 Đối tượng nghiên cứu:
- Giun đũa nhiễm ở người Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758)
- Giun đũa từ vật chủ lợn Áscaris suwm (Goeze,1782) 3.4.Phương pháp nghiên cứu :
3.4.1.Thiết kế nghiên cứu : Nghiên cứu mô tả cắt ngang
3.4.2 Cỡ mẫu: Cỡ mẫu được chọn theo cỡ mẫu sinh học, tối thiểu 30 mẫu mỗi loại Tổng số 60 mẫu, trong đó có 30 mẫu giun đũa nhiễm ở người và 30 mẫu
Trang 153.4.3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 3.4.3.1.Thu mẫu vật và bảo quản mẫu
-Thu thập mẫu giun đũa người (Ascaris lumbricoides): (Theo phương pháp
thường quy của Viện Sốt rét -KST-CTTU)
Xét nghiệm phân tìm người nhiễm giun đũa bằng phương pháp Kato
(Theo WHO, 1991), sau đó tiến hành tẩy giun và thu thập mẫu giun đũa từ người bằng đãi phân tìm giun đũa sau uống thuốc tẩy giun trong thời gian từ l-5 ngày, nếu không thu được giun thì thôi không phải đãi phân những ngày tiếp theo
Phác đồ điều trị giun đũa:
Thuốc tẩy giun đữa trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại, tuy nhiên
chúng tôi chọn những thuốc đặc hiệu với giun đũa như thuốc pyrantel pamoate
125mg/viên do Canada sản xuất tiến hành điều trị theo hướng dẫn của nhà sản xuất và được Bộ Y Tế cho phép lưu hành tại Việt Nam Ngồi ra chúng tơi còn
sử dụng thuốc đã được Viện Sốt rét KST- CTTƯ và Dự án Phòng chống giun sán do WHO tài trợ điều trị hàng loạt nhiều năm tại địa phương đó là thuốc :
Mebendazonle 500mg liều duy nhất
(Phác đồ điều trị theo Dự án Phòng chống giun sán do WHO tài trợ giai đoạn
2002-2005)
-Thu thập mẫu giun đũa trên vật chủ lợn (Ascaris suum):
Tại địa điểm mổ lợn của điaạ phương ( Phương thức thu mẫu giun đũa lợn và bảo quản mẫu giống như giun đũa người)
-Bdo quản mẫu: (Bảo quản mẫu theo theo Anderson va CS, 1993a)
Giun sau khi thu thập được rửa bằng nước muối sinh lý 0,9/%, sau đó cho vào lọ có đựng sẵn cồn 70C, nghi rõ ngày thu mẫu, nguồn gốc lợn từ đâu và bảo
quản mẫu ở tủ lạnh sâu (-20°C đến - 30 °C) cho đến khi sử dụng
3.4.3.2 Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng dấu hiệu hình thái
Phương pháp định loại bằng hình thể có sử dụng kính lúp, kính hiển vi đối pha để quan sát và chụp ảnh nghỉ hình
Dùng thước đo có chia vạch, đo chỉ tiết từng giun, làm tiêu bản phần miệng để quan sát chỉ tiết răng và so sánh giữa hai loài Asccaris lumbricoides, Ascaris suum (Tiêu bản làm theo kỹ thuật thường qui của Viện Sốt rét-KST-CTTU) 3.4.3.3 Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR
Áp dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase phân tích tính đa hình độ dài đoạn
Trang 16-Dụng cụ, trang thiết bị và hoá chát: +Dụng cụ và trang thiết bị:
-Một bộ micropipet loại Gilson, máy khuấy từ, máy lắc (Robolab) -Tube eppendorf: 1,5 ml, 0,5ml ,đầu típ loại:10 1, 200 1, 1000 1 -Tủ sấy, tủ lạnh, ly tâm tốc độ cao
e Buéng PCR
- May luan nhiét
e Thiét bi buéng phan tich san phdm
- Đèn tử ngoại soi gel, lò vi sóng; Máy điện di + bộ nguồn
- Một micropipet loại 5-50 ]; đầu tube loại:10.1, 200.1, 1000 1 - Hệ thống máy chụp ảnh và phân tích kỹ thuật số GDS-8000 +Hoá chất:
e_ Hoá chất dùng để tách, tinh khiết ADN:
- Dung dịch tách EB (extraction buffer) - Cén ethanol 70°, 99°, lạnh - TE(Tris-base + EDTA), Kac 8M Hoá chất dùng cho phản ứng PCR - dNTP,(dATP, dTTP,d CTP, dGTP) - Taq polymerase, méi - Đệm PCR10X Hoá chất dùng cho điện di
- Tris-base, axit boric - EDTA, agarose gel - Loading buffer Enzym phan cat Haelll - Enzym Haelll - Dung địch đệm phân cắt Dung dịch nhuộm ADN ~ Ethidium bromide 10mg/1
-Tách chiết ADN: (AND được tách chiết từ gien dich ITS-1 va ITS -2)
Tách chiết ADN của mẫu vật theo phương pháp cia Collin va CS (1987), có điều chỉnh cho phù hợp với từng đối tượng nghiên cứu tóm tắt các bước như sau:
Trang 172 Dùng kéo nhỏ, sắc cắt một phần của cơ thể giun ở bất kỳ vị trí nào, mẫu cắt nhỏ có kích thước (10-20 mg) Đưa mẫu vật vào tube eppendorf 1,5ml, mở nắp
tube để cồn bay hơi hết, sau đó cho thêm 200u1 dung dịch tách (EB) và nghiền
bằng chày chuyên đụng đến khi mẫu vật ở đạng hỗn dịch tế bào 3 Ủ các tube eppendorf có chứa mẫu ở 659 C trong 30 phút
4.Thêm vào méi tube 30 pl Kac 8M để kết tủa phức hợp protein SDS
5 Chuyển các tube eppendorf có chứa mẫu vào đá 30 phút
6 Ly tâm trong vòng 20 phút ở tốc độ 12.000g, chuyển dịch nổi sang một tube sạch 7.Thêm vào mỗi tube 300 Ll cồn tuyệt đối, lạnh, sau đó chuyển vào đá ít nhất 5 phút 8 Ly tâm trong vòng 20 phút ở tốc độ 16.000g, nhẹ nhàng loại bỏ dịch nổi 9, Rửa cặn lắng lần 1 bằng 500 H1 cồn 70°, lạnh
10 Để các ống khô tự nhiên ngồi khơng khí hoặc ly tâm chân không
11 Bổ xung 100 HÍ TE vào mỗi tube để hoà tan ADN, bảo quản ADN đã tách chiết trong tủ lạnh sâu —20 đến -30° C cho đến khi sử dụng
~-Tiến hành phan tg PCR:
+Tiến hành kỹ thuật PCR:Trình tự mồi xuôi và mổi ngược được chọn để nhân bản gien đặc hiệu của Ascaris là:
- NC5 mồi xuôi; 5 GTAGGT GAACCTGCGGAAGGATCATT-3:
- NC2 môi ngược; 5' TFAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3: +Thành phần phản ứng: - dNTP : 2,5 pl - Buffer :2,5 pl - Primer :2.0p1 - Taq :2 đv(đơn vi) - ADN :5.0 ul - HO cho đủ 25uI +Chu trình nhiệt (Điều kiện tối ưu của phản ứng) -Bước 1: 94°C trong 5 phút -Bước 2: 94C trong 30 giây
-Bước 3: 60°C trong 30 giây |x 30 chu kỳ -Bước 4: 72°C trong 30 giây
~Buéc 5: 72°C trong 5 phút
-Duy trì sản phẩm 6 25°C -Điện di kiểm tra sản phẩm PCR:
Trang 18Sau khi thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt xong, ta tiến hành
điện di kiểm tra sản phẩm trên thạch agaro nồng độ 2,5% trong môi trường điện
di TBE 0,5% có chứa chất nhuộm mầu ethidium bromide với cường độ dòng điện
120 mA trong 30 phút Sử dụng marker chuẩn để đo kích thước sản phẩm Đọc
kết quả điện di dưới đèn tử ngoại thấy giun đũa người cho một băng và giun đũa lợn cho một băng có kích thước bằng nhau và bằng 980 bp Sau đó chụp ảnh sản phẩm điện đi trên Gel bằng máy chụp ảnh kỹ thuật số GDS-8000
-St dung enzym Haelll cat sản phẩm PCR của giun đãa để tìm ra sự khác biệt
giữa hai loài giun nói trên
Sản phẩm PCR của giun đũa sau khi kiểm tra đã có ADN, ta tiến hành sử
dụng enzym #jazelTI dé cắt sản phẩm PCR đó với thành phần phản ứng gồm:
-H,O : 24,5 pl
-Buffer : S5nl
-Enzym Haelll : 0,51
-ADN : 20n1
Điều kiện tối ưu cho phản ứng: Ù & nhiét dd 37°C 16 giờ, sau đó điện di, kiểm
tra sản phẩm trên thạch agaro nồng độ 2,5% trong môi trường điện di TBE 0,5%
có chứa chất nhuộm mầu cthidium bromide với cường độ dòng điện 120 mA
trong 30 phút Sử dụng marker chuẩn để đo kích thước sản phẩm Đọc kết quả
điện di dưới đèn tử ngoại thấy:
- Giun đũa lợn cho 3 băng chiếm 79,31% ( với kích thước các băng là: 610bp và 230bp và 140bp) còn 20,68% giun đũa lợn cho ra 4 băng ( với kích thước các băng là: 610 bp, 370bp, 230bp và 140bp)
- Giun đũa người cho 2 băng chiếm 84,2% ( với kích thước các băng là: 610 bp và 370bp) và 15,8% cho ra 4 băng ( với kích thước các băng là: 610 bp, 370bp, 230bp và 140bp) Sau đó chụp ảnh sản phẩm điện di trên
Gel bằng máy chụp ảnh kỹ thuật số GDS-8000
-Xử lý số liệu và bình ảnh: Theo phương pháp thống kê sinh học, phần mềm EPI TNFO 6.0 và máy ảnh kỹ thuật số GDS-8000
Trang 194.KET QUA
4.1.Tình hình nhiễm giun tại điểm nghiên cứu: 4.1.1.Tình hình nhiễm giun tại xã Phương Trung
Bảng 1 Tỷ lệ nhiễm giun tại xã Phương Trung Số Số Kết quả xét nghiệm XN| dương 7
tinh Don nhiém Da nhiém
Giun đũa | Giun tóc Giun Đũa Đũa Tóc
móc Tóc Móc Móc
SL} (%) | SL} (%) | SL| (%) | SL] (%) | SL] (%) | SL| (%) | SL| (%) 172 | 45 | 26,16} 26} 15,1} 8 | 4,66] 0} O {11/639} 0 | O | O 0
Tỷ 16 nhiém mot loai giun thap, giun diia chi chiém 15,11%, giun téc chiém
4,66 % va không gặp trường hợp nhiễm giun móc nào Tỷ lệ nhiễm phối hợp hai loại giun thấp và chỉ gặp giun đũa nhiễm với giun tóc chiếm 6,3% (Bang 1) 4.1.2 Tình hình nhiễm giun tại xã Phụng Châu
Bảng 2 Tỷ lệ nhiễm giun tại xã Phụng Châu Số Số Kết quả xét nghiệm X | dương tính
N Đơn nhiễm Đa nhiễm
Giun đũa | Giun tốc Giun Đũa Đũa Tóc móc Tóc Móc Móc 9L | (%) |SL| (%) |SL{ (%) | SLI (%)|SLi (%) | SL|(%| SLI (%) 74 | 53 | 71,62 | 17 | 22,97] 9 | 12,16] 0} O | 21) 28,37) 010/16, 81
Chủ yếu là nhiễm giun đũa và giun tóc, tỷ lệ đơn nhiễm với giun đũa chiếm 22,97%, giun tóc đơn nhiễm chiếm 12,16% So với điều tra ở xã Phương
12
Trang 20Trung thì tỷ lệ đơn nhiễm của giun đũa và giun tóc ở đây cao hơn (tương ứng
22,97% so với 15,11% và 12,16% so với 4,66%) p< 0,05
4.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn
4.2.1.Phân biệt giun đãa người (Asccaris hunbricoides) và giun đũa lợn
(Ascaris suum) bằng dấu hiệu hình thái
4.2.1.1 Kích thước giun
Hình 1 Hình ảnh giun đũa trưởng thành
A Giun đũa người (Ascaris lưmbricoides) cái
B Giun đũa người (Ascaris hưnbricoides) đực
C Giun dita lon (Ascaris suum) cai
D Giun dia lon (Ascaris suum) duc
4.2.1.2.Hình ảnh răng của Asccaris lumbricoides va Ascaris suum
Trang 21
Hình 2 Răng của giun đũa người (Áscaris lumbricoides)
Quan sát được 31/32 mẫu răng giun đũa người (Asccaris lumbricoides) va 34/36 mẫu rang giun dia lon (Ascaris suum) thay giun đũa Asccaris có răng là
hoàn toàn có thật (hình 2 và 3 )
Trang 22
Hình 3 Răng của giun đũa lợn (Áscaris suum)
Nhìn chung răng giun đũa lợn thô hơn răng giun đũa người, nhưng cũng có
nhiều trường hợp răng giun đũa lợn và răng giun đũa người khác nhau không rõ
ràng
Trang 234.2.2.Phân biệt giun đũa người và giun đũa lon bằng kỹ thuật PCR
- 4.2.2.1 Sdn phẩm PCR của giun đũa người (Ascasris lumbricoides) và giun đũa lợn (Ascaris suum) khi chưa cắt enzym HaelIT 1234 56 78910111213 141516 17 = 980bp 980bp Hình 4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của giun đũa khi chưa cắt enzym Hazïn `
Cột số 1, cột 9 và số 17: Thang đo trọng lượng phân tử Từ cột số 2- 8 là mẫu của giun đữa lợn
Từ cột số 10 -16 là mẫu của giun đũa người
Trang 244.2.2.2 Sản phẩm PCR của giun đũa người (Ascasris lumbricoides) và giun diia lon (Ascaris suum) da cét enzym Hae ` 1 2 3 45 678 91011121314 15 1617 610bp 610 bp 370 bp 230 bp 140 bp
Hình 5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của giun đũa đã cắt enzym HøzelTT
Cột số 1 và số 17:Thang đo trọng lượng phân tử Từ cột 2-.8 giun đũa lợn (Ascgsris suum)
Từ cột 9-16 giun dia ngudi (Ascaris lumbricoides) 123 4567 8 9 10 11 12 131415 16 610bp 610 bp 370 bp 230bp 230 bp 140bp 140 bp
Hinh 6: Cét 1,2,3 giun diia Ign (Ascasris suum ) có ba băng Cột 5, 6 giun đũa người (Ascaris lumbricoides) có hai băng
Cột 9, 10, 11, 12, 14 giun đũa người (Áscaris lưnbricoides) có bốn băng
Cột số 16: Thang đo trọng lượng phân tử
Trang 255.BAN LUAN
5.1 Phan biét giun diia ngudi (Asccaris lumbricoides) va giun dia lon (Ascaris suum) bang đấu hiệu hình thái
53.1.1.Kích thước giun
Khi nghiên cứu 68 mẫu giun đũa, trong đó có 32 mẫu giun đũa người và
36 mẫu giun đũa lợn thấy hai loại giun này đều có mầu trắng sữa hoặc mầu trắng
hồng tuỳ từng giun Tuy nhiên, khi quan sát tổng thể thì thấy giun đũa lợn có
chiều đài, đài hơn giun đũa người nhưng đường kính của giun đũa lợn lại nhỏ hơn so với giun đữa người Cụ thể là chiêu dài trung bình của 32 giun đũa người là 17,3 cm, đường kính trung bình của giun đũa người là 0,4 cm Chiều dài trung bình đo của 36 giun đũa lợn là 24,95 cm, đường kính trung bình là 0,32cm ( hình 1) Kết quả này cho thấy có sự khác nhau về kích thước của giun nhưng cũng không thể dựa vào đặc điểm này để phân biệt hai loại giun nói trên vì ta không
xác định được tuổi của giun
5.1,.2.Hinh anh rang cia Asccaris lumbricoides va Ascaris suum
Răng của Asccaris có hình tam giác hay còn gọi là hình răng cưa Trên
cùng một mẫu răng thấy các răng tương đối đều, tuy nhiên những răng ở sâu phía
trong hàm có phần mòn hơn và không nhọn bằng các răng ở cửa Quan sát này tương tự với những nghiên cứu của M.Anel and M.Thibaut,1972[8].Theo như một số tác giả Abdulrachamen & Lie Kian Joe 1954{25], thì những răng này được gọi là răng hàm Qua nghiên cứu, thấy răng của giun đũa lợn và răng của giun đũa người sai khác nhau là không rõ ràng Kết quả nghiên cứu này phù hợp với Sprent JFA, 1954[24]; Sri.S Abdulrachman & Lie kian Joe, 1954[25], do vậy nếu chỉ dựa vào răng để phân biệt Asccaris lumbricoides với Ascaris suum nhiều khi sẽ không tránh khỏi những khó khăn
5.2 Phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng kỹ thuật PCR
5.2.1.Sản phẩm PCR của giun đũa người (Ascasris lumbricoides) và giun đũa
lon (Ascaris suum) khi chưa cắt enzym Haelll
Tổng số giun đũa thu được 119 mẫu, trong đó số giun đũa người là 68 mẫu trên 68 bệnh nhân (Một số bệnh nhân không thu được giun ) Trong số 68 mẫu
giun thu được từ bệnh nhân, gồm 32 mẫu thu ở xã Phương Trung và 36 mẫu thu
ở xã Phụng Châu) Số giun đũa lợn đã được phân tích là 51 mẫu trên 51 lợn (36
mẫu giun đũa lợn thu ở xã Phương Trung và 15 mẫu giun đũa lợn ở xã Phụng
Châu)
Trang 26Khi đã tách được ADN của các mẫu giun, tiến hành chạy PCR Sản phẩm PCR lần 1 của giun đữa người và giun đữa lợn sau khi điện di đều cho một
băng có kích thước bằng nhau và bằng 980bp (hình 4}, dò vậy nếu dừng lại tại đây thì cũng chưa phân biệt được giun đũa người và giun đũa lợn So sánh với
két qua cia TJ.C.Anderson, 1994; Xingquan Zhu, Nei B Chinton, Dennis
Jacobs, Jaap Boes, Robin B Gasser, 1998 Weidong Peng T.J C Anderson,
Xiamin Zhou and W.Kenndy 1998 [7, 27, 28], kết quả này hoàn toàn phù hợp
5.2.2.Sản phẩm PCR của giun đũa người (Ascasris lumbricoides) và giun đũa lợn (Ascaris suum) đã cắt enzym HaeïlTl
Kết quả sử lý sản phẩm PCR bằng enzym phân cắt giới hạn được thể hiện ở
hình 5 và hình 6 Kết quả này của chúng tôi so với những nghiên cứu của các tác
giả nước ngoài có những điểm tương đồng và khác biệt Theo Xingquan Zhu và
các tác giả cho thấy khi giải trình tự gien của 2 loại giun nói trên chỉ phát hiện được 6 nucleotit khác biệt giữa hai loài chiếm 1,3%{4] Khi sử dụng enzym
HaeÏlTI cắt gien giun đũa người tại vị trí 358 và giun đũa lợn cũng trong điều kiện dy enzym Haelll cat gien tai hai vị trí 131 và 358
Sau khi điện di, các mẫu giun đũa người chỉ cho hai băng, băng thứ nhất có
kích thước 610 bp, băng thứ hai kích thước 370 bp (hình 5) Trong khi đó các
mẫu giun đũa lợn ( từ mẫu số 2 đến mẫu số 8) cho ra 3 băng, băng thứ nhất có
kích thước 610 bp, băng thứ hai có kích thước 230 bp và băng thứ ba 140 bp (hình 5) Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của T.J.C.Anderson, 1994; Xingquan Zhu, Nei B Chinton, Dennis Jacobs, Jaap Boes, Robin B Gasser, 1998; Weidong Peng T.J C Anderson, Xiamin Zhou and W.Kennedy1998 [7,
27, 28]
Mặc dầu vậy, trong tổng số 68 mẫu giun đữa người ( 32 mẫu thu thập tại
xã Phương Trung và 36 mẫu giun thu thập tại xã Phụng Châu) khi tiến hành kỹ thuật điện di vẫn có 10 mẫu giun đũa người cho ra 4 băng chiếm 14,7%(10 / 68) hình 6, số còn lai cho 2 băng chiếm 85,29%(58/68) hình 5 Kết quả này tương đương với nghiên cứu của Weidong Peng T.J.C Anderson, Xiamin Zhou và W.Kennedy1998, tỷ lệ giun đũa người khi chạy điện di kết quả cho ra hai băng chiếm 84,2% (48/57) và số giun đũa người khi chạy điện di cho ra bốn băng
chiếm 15,8% (9/57) (X* =76,85, P< 0,001) [28I
Một điều khác biệt với nghiên cứu của Weidong Peng T.] C Anderson, Xlamin Zhou and W.Kennedy1998, là trong 51 mẫu giun đũa lợn khi tiến hành kỹ thuật điện di không thấy trường hợp nào có 4 băng, số cho ra 3 băng chiếm tỷ lệ 100% Trong khi đó kết qủa chạy điện di các mẫu giun diia lon cha Weidong Peng T.J C Anderson, Xiamin Zhou and W.Kennedy1998 ở Trung Quốc có tới
20,68% số mẫu có 4 băng(12/58) [ 28] (p < 0,05) Trong đó có một băng chung
cho cả giun đữa người và giun đũa lợn có kích thước bằng 610 bp, một băng của
Trang 27giun đữa người có kích thước là 370 bp, hai băng còn lại là của giun đũa lợn có kích thước là 230 bp va 140 bp Theo Xingquan Zhu, Neil B, Chlton, Dennis E jacobs, Jaap Boes, Robin B, Gasser 1998 và một số tác giả nước ngoài khác cho rằng những giun đũa khi áp dụng kỹ thuật điện di cho ra bốn băng rất có thể là những con lai giữa giun đũa người và giun đũa lợn [27] Theo chúng tôi những giun đũa khi cắt enzym #jaelI cho bốn băng nói trên là những giun đũa có kiểu gien di hop tw
Nhu vậy khi cắt sản phẩm PCR lần 1 ciia giun diia bang enzym Haelll réi
điện đi và phân tích các băng đưới đèn tử ngoại ta có thể phân biệt được giun đũa người và giun đũa lợn dựa vào số lượng băng (giun đũa người có 2 băng, giun đũa lợn có 3 băng hình 5 ) Tuy nhiên trong một số trường hợp giun đũa người có
4 băng ( hình 6)
Việc phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn bằng ADN vừa có tính khoa học, tính chính xác và có sức thuyết phục cao, đồng thời sẽ mở ra một hướng mới trong việc phân biệt trứng giun đũa người và trứng giun đũa lợn ô nhiễm ở ngoại cảnh Đây là một vấn đề rất cần thiết và quan trọng để đánh giá đúng thực tế mức độ ô nhiễm của từng loại trứng giun ô nhiễm ở ngoại cảnh
Kết quả nghiên cứu ADN của giun đũa sẽ khắc phục được những khó khăn trong việc phân biệt giun đũa người và giun đũa lợn mà phương pháp hình thái
trước đây gặp phải
6 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
6.1.Kết luận
1 Kỹ thuật phân tích tính đa hình độ dài đoạn phân cất giới hạn bằng phản
ứng chuỗi polymerase (PCR-RELP) có thể phân biệt được giun đũa người Ascaris lumbricoides va giun đũa lợn Ascars suum
2 Sản phẩm PCR của 51 mẫu giun đũa lợn khi cắt ezym ae HT có 100%
giun cho ra 3 băng với kích thước các băng lần lượt là: 610bp, 230bp và 140pb
3 Sản phẩm PCR của 68 mẫu giun đũa người khi cất enzym #jzeII.có
85,29% mẫu cho ra 2 băng với kích thước các băng lần lượt là 610bp, 370bp và có 14,7% mẫu giun cho ra 4 băng, với kích thước các băng lần lượt là: 610bp,
370bp, 230bp và 140bp
6.2.Đề nghị:
Cần tiến hành điều tra tình hình nhiễm chéo giun đũa người và giun đũa
lợn trên một quy mô mở rộng lớn hơn và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để định loại thành phần loài để đánh giá dịch tế học phân tử của việc nhiễm giun diia Ascaris trong cộng đồng
Trang 28TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Lê Đình Công, 1998 Tình hình bệnh giun sán hiện nay ở Việt Nam Phương hướng kế hoạch phòng chống các bệnh giun sán năm 1998-2000 và đến năm 2005.Tài liệu tập huấn: Đặc điểm dịch tễ, bệnh học, điều trị và kỹ thuật chẩn đoán trong phòng chống một ssố bệnh giun sán chính ở Việt Nam
2.Võ Viết Hưu và ctv,1960 Điều tra tình hình nhiễm giun ở đất Kỷ yếu công
trình nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rết-KST-CT,1957-1974.Tập V, tr 97-
100
3.Hoàng Thị Kim và ctv,1987 Sự phát triển của trứng giun đũa ở ngoại cảnh qua
một năm theo dõi tại một điểm đồng bằng miền Nam Việt Nam Kỷ yếu
công trình nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rét-KST-CT, Tập II: 37-42
4.Đỗ Dương Thái, Nguyễn Phan Long,1973 Kết quả điều tra cơ bản ký sinh
trùng và côn (rùng tại xã Cao Dương,Thanh Oai, Hà Tây Kỷ yếu công trình
nghiên cứu khoa học, Viện Sốt rét-KST-CT,1957-1974, tr54-75
5.Đỗ Dương Thái và các tác giả,1976 Công trình nghiên cứu ký sinh trùng ở Việt ˆ Nam Tập I -Giun sán ở người Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà
Nội, 232 tr
6.Anderson T.J.C, Romero-Abal ME, Jaenike J Genetic structure and epidemiology of Ascaris population: patten of host affiliation in Guatemala Parasitology 1993; 107; 319-334
7.TJ.C.Anderson Ascaris infections in humans from North Amerrica: molecular evidence for cross-infection Parasitology (1994),110, 215-219
8.M Ansel and M.Thibaut.Value of the specific distinction between Ascaris lumbricoides Linne 1758 and Ascaris suum Goeze 1782, InJ Parasitology 1973;3,317-319
9.Barry JM ORourte FJ Ascarissis in pig and in man Sci proc R Dublin Soc Ser A 1967; 3: 39 -55
10.Chilton NB, Gasser RB, Beveridge I Phylogenetic ralation ship of Australiar strongloid nematodes infected from ribosomal DNA sequence data Int J Parasitology 1997; 27: 1481-1494
11.Chilton NB, Gasser RB, Bewerdge LDifferences in a ribosomal DNA
sequence of mophologieally indistinguishable species within the Hypodomtus macropi complex ( Nematoda: Strongyloidea) Int Jparasitology 1995;25;647-65
12.1 Chino Miyazaki, MD,D.M.Sc 1991 An illustrated book helminthic zoonoses International Medical foundation of Japan, Tokyo 1991: 295-305
Trang 2913.Crompton DWT Biology of Ascaris lumbricoides in Cromption DWT Nesheim MC, Pawlowski ZS editors Ascariasis and is prevention and
control London; Taylor & Francis, 1989;10-44
14.Gralvin ij Development of human and pig Ascaris in the pig ‘and rabbit J Paasitology1968,54 1085-1091
15.Kenji Ishivata va CS, 2003 Identiification of tissue-embedded ascaris larvae by ribosomal DNA sequencing.Spinger-Verlag is a part of Spinger Scien- Business Media 2003 Parasitology (2004) 92:50-52
16.Kurimoto H Mophological, biochemical and immunology studies on the differences between Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758 and Ascaris
suum Goeze, 1782 Jpu J Parasitol, 1974;23,251-267
17.Maung M Ascaris lumbricoides Linne 1758 and Ascaris suum Goeze 178;
mophological _differenes between specimens obtained from man and pig
Southest Asian J Trop Med Pub Hth 1973;4,41-45
18.Ichiro Miyazaki, M.D; M.Se International Medical foundation of Japan ToKyo 1991;493; Helminthic Zoonoses 259-305
19.Nadler SA Biochemical and immunological systematic of some ascarisdoid
nematodes genetic divegence between congeners J Parasitol 1987;73;811-
816
20.Nascetti G, Grappelli C Bulini L Ricereche sul diffrenziamento genetice di Ascaris lumbricoides Ascaris suum Rend Sci fis Mat Na Ser VHI
1979 367 ; 457- 465
21.Nichols RL( 1956a), The etiology of visceral larva migrans J Diagnostic mophology of infective second stage Toxocara larvae J Parasitology 42: 349-362
22.Nichols RL(1956b) The etiology of visceral larva migrans II Comparative larvel mophologycal of Ascaris lumbricoides Necator americanus Stronghloides stecuralis, Ancylostoma canium J Parasitology 42:363- 399
23.Peter Nejsum, E.Dvis Parker,Jr, Jane Frydeneng,Alan Roepstorff, Jaap Boes, Rashidul Haque, Ingrid Astrup, Jorgen Prag, and Ufe B Skov Soren 2004 Ascariasis is a Zoonosis in Denmark Vol 43.No3:1142-1148
24.Sprent JFA Anatomical distrintion between human and pig stains of Ascaris
nature 1952;170;627-628
25 Sri S.ABDulrachiman and Lie Kian Joe,1954 Mophologycal differences between ascaris from man and pigs Documenta DE.Medicina Geografica ET Tropica Vol:6;342-344
26.Takuta I Experimental infection of man wich Ascaris of man and the big Kitasato Arch Exp Med 1951, 2349-59
Trang 3027.Xingquan Zhu, ‘Neil B, Chiton, Dennis E jacobs, Jaap Boes, Robin B,
Gasser Characterisation of Ascaris from human and pig hosts by nuclear ribosomal DNA sequences International Journal for Parasitology 29(1999) 469-478
28.WEIDONG PENG;T.J.C ANDERSONXIANMIN ZHOU and M.W.KENNEIDY 1998 Genetic variation in sympatric Ascarts population from human and pigs in China Deparment of Parasitology, fiangxi Medical college, Nanchang 330006, China 355-361
29Wossene Abede, Naotoshi Tsuji, Harue Kasuga-Aoki, Takeharu Miyoshi, Takashi Lso, Takeshi Arakawa, Yassunhu Masunoto and Shinobu Yoshihara Species-Specific proteins identified in ascaris lumbricoides and ascaris suum using two dimensional electrophoresis Parasitology Research,voi 88.nr 9.p 868-871 Springer- Verlag 2002
Hà Nội, ngày ¢Z, thang .2 nam 2007
CHU TICH Chủ trì đề tài