Phương pháp này dựa vào việc xác định đoạn ADN đích (một đoạn trong gen invA) có được khuếch đại hay không. Quá trình xác định được thực hiện bằng cách điện di sản phẩm khuếch đại trên gel agaroza, nhuộm màu ADN bằng etyl bromua và quan sát bằng đèn cực tím (UV) ở bước sóng 302 nm. Nếu trong mẫu có gen đích, trên bảng gel điện di sẽ xuất hiện sản phẩm khuếch đại có kích thước phù hợp với độ dài của đoạn ADN đích đã định. Nếu trong mẫu không có gen đích, trên gel diện di không xuất hiện sản phẩm khuếch đại hay sản phẩm khuếch đại có kích thước không phù hợp với đoạn ADN đích.
TIấU CHUN QUC GIA TCVN 8342 : 2010 THU SN V SN PHM THU SN ( PHT HIN SALMONELLA BNG K THUT PHN NG CHUI POLYMERAZA (PCR) Fish and fishery products Detection of Salmonella using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique Li núi u TCVN 8342 : 2010 Cc Ch bin, Thng mi nụng lõm thu sn v ngh mui biờn son, B Nụng nghip v Phỏt trin nụng thụn ngh, Tng cc Tiờu chun o lng Cht lng thm nh, B Khoa hc v Cụng ngh cụng b Phm vi ỏp dng Tiờu chun ny quy nh phng phỏp nh tớnh Salmonella sn phm thu sn bng k thut phn ng chui (PCR) Nguyờn tc Phng phỏp ny da vo vic xỏc nh on ADN ớch (mt on gen invA) cú c khuch i hay khụng Quỏ trỡnh xỏc nh c thc hin bng cỏch in di sn phm khuch i trờn gel agaroza, nhum mu ADN bng etyl bromua v quan sỏt bng ốn cc tớm (UV) bc súng 302 nm Nu mu cú gen ớch, trờn bng gel in di s xut hin sn phm khuch i cú kớch thc phự hp vi di ca on ADN ớch ó nh Nu mu khụng cú gen ớch, trờn gel din di khụng xut hin sn phm khuch i hay sn phm khuch i cú kớch thc khụng phự hp vi on ADN ớch CH THCH: Tt c cỏc kiu huyt Salmonella u mang cm gen inv (invasion) giỳp cho quỏ trỡnh xõm nhim vo thnh rut ca ngi v ng vt, m u ca tin trỡnh gõy bnh Cm gen ny nm h thng gen SPI-1 (Salmonella pathogenicity island) cú mt tt c cỏc Salmonella, t nhúm tin hoỏ thp nht l S bongori n nhúm tin hoỏ cao nht l S enterica I InvA l mt bn gen luụn cú mt h thng gen inv Thuc th, mụi trng v vt liu Ch s dng thuc th loi tinh khit phõn tớch, nc c s dng l nc ct hoc nc cú tinh khit tng ng, tr cú quy nh khỏc 3.1 Cp mi Gm hai mi invA1 v invA2 c thit lp cỏch 520 bp gen invA cú vai trũ quỏ trỡnh xõm nhim Salmonella vo thnh rut ng vt v ngi Trỡnh t ca hai mi nh sau: invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'; invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nng mi s dng phõn tớch c pha loóng thnh pM m TE m TE cú thnh phn nh sau: 10 mM Tris-HCl (pH = 8) v mM EDTA 3.2 Mụi trng nuụi cy Khuyn khớch s dng mụi trng nuụi cy dng bt khụ v cỏc vt liu dựng cho phn ng khuch i PCR c tng hp thnh kit ang c lu hnh trờn th trng cú thnh phn phự hp nh di õy Quỏ trỡnh pha ch, bo qun, s dng phi tuõn th theo hng dn ca nh sn xut Trong trng hp s dng cỏc vt liu hoỏ cht riờng l, tinh khit ca cỏc thnh phn v nc pha ch phi m bo cht lng dựng cho vi sinh v sinh hc phõn t 3.2.1 Dung dch m pepton 3.2.1.1 Thành phần Pepton (C5H10O5) 10,0 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) 3,6 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,5 g Nc 000 ml 3.2.1.2 Chuẩn bị Ho tan cỏc thnh phn nc, un tan, phõn phi vo cỏc bỡnh cha phự hp Hp kh trựng nhit 121 0C 15 min, pH sau kh trựng l 7,0 0,2 25 0C 3.2.2 Hn hp dựng khuch i PCR 1,1x 3.2.2.1 Thành phần 0,025 U/àl (1,25 U/50 àl) Taq polymeraza Tris - HCl (pH = 8,8 nhit 25 C) 75 mM Amoni sulfat [(NH4)2SO4] 20 nM Tween 20 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Magiờ clorua (MgCl2) 0,01 % (th tớch) 200 àM (mi loi) 1,5 mM 3.2.2.2 Chuẩn bị Tt c cỏc thnh phn trờn c pha ch nc ct ln v bo qun nhit 0C thỏng Cú th bo qun nhit 20 0C nm Khụng nờn ró ụng v tỏi ụng dung dch ó pha ch nhiu ln 3.3 Thang ADN Nờn s dng thang o phự hp cú th c lng c on khuch i 520 bp Cú th s dng sn phm khuch i cú kớch thc 520 bp ó bit trc lm thang o phng phỏp ny 3.4 Agaroza Agaroza s dng k thut ny l loi dựng in di ADN cú kớch thc nh hn 000 bp 3.5 m in di TAE 1x 3.5.1 Thành phần Tris Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0 Axit axetic bng Nc va 4,84 g ml 1,14 ml 000 ml 3.5.2 Chuẩn bị Nờn pha ch thnh dung dch 10x (m c 10 ln), s dng mi pha loóng vi nc thnh dung dch 1x 3.6 m ti mu 6x 3.6.1 Thành phần Glyxerol Xanh bromphenon Tris 30 % 0,25 % 200 mM Na2EDTA 20 mM 3.6.2 Chuẩn bị Cỏc thnh phn trờn c pha nc, bo qun nhit 0C 3.7 Thuc nhum AND, dung dch etyl bromua nng 10 mg/ml CNH BO Thuc nhum etyl bromua l mt cht c cú th gõy ung th cho ngi v ng vt Do ú, s dng hoỏ cht ny phi cú gng tay v kớnh bo h Dung dch sau s dng phi cho chy qua than hot tớnh trc b Thit b, dng c Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thờng cụ thể nh sau: 4.1 T m, cú th trỡ nhit 37 0C 4.2 Mỏy luõn nhit 4.3 Mỏy ly tõm, loi dựng cho ng eppendorf 1,5 ml 4.4 Mỏy lc ng nghim 4.5 Thit b in di ngang v b ngun in di, cú in th hot ng t 80 V n 150 V 4.6 Hp ốn soi UV, cú kớnh lc 302 mm CNH BO Ch c bt ốn UV quan sỏt ADN sau ó úng kớnh bo v 4.7 B chp nh trờn ốn UV 4.8 ng Eppendorf, 0,2; 0,5 v 1,5 ml, loi chuyờn dựng cho PCR Ly mu v chun b mu th iu quan trng l mu gi n phũng th nghim phi l mu i din Mu khụng b h hng hoc thay i thnh phn quỏ trỡnh chuyn v bo qun Vic ly mu v chun b mu th khụng qui nh tiờu chun ny Nờn ly mu v chun b mu th theo tiờu chun c th liờn quan n sn phm Nu khụng cú tiờu chun c th liờn quan n sn phm thỡ cỏc bờn t tho thun v ny Cỏch tin hnh 6.1 Phn mu th Cõn chớnh xỏc 25 g mu th (hoc mt lng chớnh xỏc tu theo yờu cu) ri cho vo bỡnh nún hoc bao PE vụ trựng 6.2 Tng sinh Giai on tng sinh c tin hnh mụi trng khụng chn lc v trờn nguyờn tc c mt phn lng mu s b sung phn lng mụi trng tng sinh Nu ly 25 g mu, phi b sung 225 g mụi trng tng sinh dung dch pepton m mu cú mụi trng tng sinh nhit 37,0 0C 1,0 0C khong 18 h h 6.3 X lý mu gii phúng ADN Giai on ny nhm thu nhn sinh sau tng sinh, sch mụi trng sau nuụi cy, phỏ v t bo gii phúng ADN Cỏch x lý nh sau: a) Lc u canh khun tng sinh Hỳt 0,5 ml vo ng eppendorf cú th tớch 1,5 ml, ly tõm vi tc 10 000 r/min ri loi b phn nc Ra sinh vi nc ri tip tc ly tõm vi ch nh trờn loi b phn nc b) Pha loóng huyn phự sinh ng vi 0,5 ml nc un sụi cỏch thu 10 Ly tõm huyn dch sau un vi tc 10 000 r/min lng cỏc mnh v t bo xung ỏy Phn dch bờn trờn c coi l khuụn ADN tin hnh phn ng khuch i 6.4 Khuch i Giai on ny nhm lm tng s lng bn on ADN ớch trờn mỏy luõn nhit bng hai mi c trng Quỏ trỡnh khuch i c tin hnh khong 30 chu k CNH BO Nghiờm cm s dng cỏc dng c liờn quan n sn phm sau khuch i cho vic tng sinh hay chun b mu Phũng th nghim phi c b trớ tỏch khu chun b mu trc khuch i v khu x lý sn phm sau khuch i trỏnh hin tng nhim chộo gõy kt qu dng tớnh gi 6.4.1 Chun b ng khuch i Hỳt 45 àl hn hp khuch i PCR 1,1 x cho vo ng nghim PCR dung tớch 0,2 ml hoc 0,5 ml, thờm vo àl mi mi invA1 v invA2 cú nng pM v àl mu khuụn ADN Tng dung tớch mt ng khuch i l 50 ml i chng dng: thay dch khuụn ADN mu bng dch ADN ca Salmonella chun ó bit i chng õm: thay dch khuụn ADN mu bng nc 6.4.2 Chng trỡnh khuch i Cỏc ng khuch i c t vo mỏy luõn nhit Chng trỡnh khuch i nh sau: Duy trỡ nhit 95 0C lm bin tớnh hon ton cỏc si ADN mu Tip theo l 35 chu k, mi chu k cú bc nh sau: 95 0C/60 s; 54 0C/45 s v 72 0C/60 s Sau kt thỳc 35 chu k, mu c gi nhit 72 0C 10 min, sau ú gi n nh nhit 20 0C cho n in di 6.5 in di sn phm khuch i 6.5.1 Chun b gel in di agaroza % Gel agaroza % pha m TAE 1x c un chy hon ton v vo khay in di ó cú sn cỏc lc to ging Gel in di phi cú dy khong mm n mm Gel sau chun b c ngõm chỡm hon ton m TAE 6.5.2 Chun b dch in di Mu sau khuch i c nhum vi 10 àl m ti mu 6x ri trn tht u 6.5.3 in di Mt ging gel in di c s dng cho thang ADN chun hay mu i chng dng Np 10 àl dch in di ó chun b vo gel agaroza Tin hnh in di 60 hiu in th 100 V 6.6 Nhum ADN, quan sỏt sn phm khuch i 6.6.1 Chun b dung dch nhum mu Pha dung dch nhum ADN nh sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vo 0,5 l nc, pha vo khay cha cú ming rng hn bn gel in di 6.6.2 Nhum gel Ngõm bn gel ó in di vo dung dch nhum 10 Ra gel bng nc khong n loi b phn etyl bromua d 6.6.3 Quan sỏt, chp hỡnh Cho bn gel ó nhum lờn hp ốn soi UV, úng kớnh bo v, bt ốn ri quan sỏt cỏc vch sỏng ca ADN xut hin trờn bn gel Sau ú, chp hỡnh lu tr kt qu c v din gii kt qu Kt qu phõn tớch ch c xem xột kt lun mu i chng dng tớnh cú sn phm khuch i ADN vi kớch thc 520 bp v mu i chng õm khụng cú sn phm ny Mu c kt lun l dng tớnh Salmonella cú sn phm khuch i 520 bp trờn bn gel Mu c kt lun l õm tớnh khụng cú sn phm khuch i, hay sn phm khuch i cú kớch thc khỏc hn 520 bp Bỏo cỏo th nghim Bỏo cỏo th nghim phi ghi rừ: a) mi thụng tin cn thit v vic nhn bit y mu th; b) phng phỏp ly mu ó s dng, nu bit; c) phng phỏp th ó s dng v vin dn tiờu chun ny; d) mi thao tỏc khụng c quy nh tiờu chun ny, hoc nhng iu c coi l t chn, v bt k chi tit no cú nh hng ti kt qu; e) kt qu th nghim thu c TH MC TI LIU THAM KHO [1] CHENG HSUN CHIU and JONATHAN T.OU., Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an Enrichment broth culture multiplex PCR combination assay, Journal of Clinical microbiology, p.2619-2622 Oct 1996 [2] JS WAY, KL JOSEPHSON, SD PILLAI, M ABBASZADAGAN, CP GERBA and IL PEPPER., Specific detection of Salmonella spp by multiplex polymerase chain reaction, Appl Environ Microbiol., 59 (5) : 1473 - 1479, 1993 [3] CAROLA BURTSCHER, PAPA A FALL, PETER A WILDERER, and STEFAN WUERTZ., Detection of Salmonella spp and Listeria monocytogenes in Suspended Organic Waste by Nucleic Acid Extraction and PCR, Appl Environ Microbiol., 65 (5): 2235 - 2237, 1999 [4] Nordic commitees on food analysis (NMKL) No 71, 5th ed., 1999, Salmonella Detection in foods ... U/àl (1 ,25 U/50 àl) Taq polymeraza Tris - HCl (pH = 8,8 nhit 25 C) 75 mM Amoni sulfat [(NH4)2SO4] 20 nM Tween 20 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Magiờ clorua (MgCl2) 0,01 % (th tớch) 200 àM (mi... pepton 3.2.1.1 Thành phần Pepton (C5H10O5) 10,0 g Natri clorua (NaCl) 5,0 g Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) 3,6 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 1,5 g Nc 000 ml 3.2.1.2 Chuẩn bị Ho tan cỏc thnh phn... dng: thay dch khuụn ADN mu bng dch ADN ca Salmonella chun ó bit i chng õm: thay dch khuụn ADN mu bng nc 6.4.2 Chng trỡnh khuch i Cỏc ng khuch i c t vo mỏy luõn nhit Chng trỡnh khuch i nh sau: