Khuếch đại in vitro DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế (xem chương 1) và kỹ thuật Southern blot.

Chương Khuếch đại in vitro DNA phản ứng chuỗi polymerase (PCR) PCR (polymerase chain reaction) kỹ thuật sử dụng phổ biến công nghệ sinh học đại đóng góp lớn cho tiến sinh học phân tử, đánh dấu bước tiến vô quan trọng tương đương với việc khám phá enzyme hạn chế (xem chương 1) kỹ thuật Southern blot (xem chương 5) PCR dựa sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro nucleic acid đặc hiệu thiết bị điều nhiệt tuần hoàn (thermocycler) cịn gọi máy PCR (Hình 3.1) PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA có chiều dài từ 200-3.000 bp Đoạn DNA khuếch đại (DNA đích) nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide Hình 3.1 Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn I Nguyên tắc PCR Taq polymerase (xem chương 1) loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) dùng để tổng hợp đoạn DNA môi trường có bốn loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP dTTP) hai primer, sở khuôn mẫu đoạn DNA định biết chưa biết trình tự Các đoạn DNA hình thành lại sử dụng làm khuôn mẫu Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói nhân lên gấp nhiều lần, nhờ đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự tạo dịng Primer bên trái tác động sợi DNA 3’-5’ gọi primer thuận (forward primer, ký hiệu F) Primer bên phải tác động sợi DNA 5’-3’ gọi primer ngược (reverse primer, ký hiệu R) Nguyên tắc PCR trình bày hình 3.2 3.3 Theo đó, từ chu kỳ thứ hai Taq DNA polymerase (gọi tắt Taq pol) bắt đầu tạo đoạn DNA có chiều dài xác định Các primer thường oligonucleotide tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide Nếu biết trình tự đoạn gen cần khuếch đại tổng hợp nhân tạo primer tương ứng để thực PCR tách chúng kỹ thuật điện di PCR thường tiến hành khoảng 25-35 chu kỳ, qua từ 10-6 mg DNA ban đầu khuếch đại (amplification) lên tới mg (khoảng kb) Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Gây biến tính (denaturation) 90-95oC Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khn mẫu dạng xoắn kép tách thành hai sợi đơn (single strands) Tất phản ứng enzyme giai đoạn bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó) - Gắn mồi (annealing) 40-65oC Trong giai đoạn primer gắn vào vị trí có trình tự tương đồng DNA khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh chuyển động Brown liên kết ion tạo thành bị đứt gãy liên tục primer sợi đơn DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định tạo thành đoạn nhỏ (các primer lắp ráp xác) đoạn nhỏ DNA sợi đơi (khn mẫu primer) Taq pol bắt đầu q trình chép khuôn mẫu Ở giai đoạn phạm vi nhiệt độ sử dụng rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide primer, thơng thường khoảng 55oC, có 35oC đơi lúc lên đến 68oC - Kéo dài phân tử (extension) nhiệt độ 70-72oC Đây khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq pol tiến hành tổng hợp DNA cách bổ sung dNTP vị trí có primer theo chiều 5’®3’ Các primer có vài base gắn vào khn mẫu có mối liên kết ion mạnh lực phá vỡ liên kết không bị đứt gãy Các primer vị trí khơng bắt cặp xác lại bị rời (do nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu không tổng hợp DNA Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase Hình 3.3 Các chu kỳ kỹ thuật PCR Có ba kỹ thuật PCR thông dụng: PCR chuẩn, PCR mỏ neo PCR đảo ngược Trong PCR chuẩn (standard PCR), DNA khuôn mẫu mở xoắn kép, sau hai primer tác động hai đầu sợi đơn, DNA tổng hợp nhờ Taq pol với loại deoxyribonucleotide (Hình 3.4) Hình 3.4 Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn PCR mỏ neo (anchored PCR), kỹ thuật yêu cầu cần biết trình tự nucleotide đầu khn mẫu gắn đuôi đồng trùng hợp nhân tạo (ví dụ: dA) vào đầu (chưa biết trình tự) Sau đoạn DNA khuếch đại nhiều lần nhờ primer có trình tự biết trước primer thứ hai có oligo(dT) (Hình 3.5) PCR đảo ngược (inverse PCR), dùng để khuếch đại đoạn phân tử kế cận với đoạn có trình tự DNA biết trước, phân tử DNA cắt hạn chế nối lại nhờ enzyme DNA ligase để tạo thành vịng trịn có tính chất monomer, sau đoạn DNA khuếch đại nhờ hai primer tương đồng với đầu trình tự biết trước (Hình 3.6) II Quy trình PCR Thành phần phản ứng - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - primer (F R) - Taq pol - loại dNTP - Đệm muối khống Hình 3.5 Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo Thực phản ứng Dưới ví dụ minh họa cho phản ứng khuếch đại: 2.1 Chuẩn bị dung dịch master mix cho vào eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn thành phần sau: Đệm 10× PCR 4,5 mL Hỗn hợp dNTP (2,5 mM loại) mL Primer-F (10 pmol/mL) 2,5 mL Primer-R (10 pmol/mL) 2,5 mL Thêm H2O tới 40 mL 2.2 Chuẩn bị dung dịch pha lỗng Taq pol: Đệm ×10 mL Taq pol (5 units/mL) Thêm H2O tới mL 20 mL Hình 3.6 Sơ đồ kỹ thuật PCR đảo ngược 2.3 Bổ sung mL DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 mL dung dịch master mix tube 2.4 Bổ sung mL/1 tube dung dịch pha loãng Taq pol 2.5 Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block máy PCR để thực chế độ nhiệt theo chu kỳ sau: - Start program - 95oC/5 phút - Thực 30 chu kỳ: 95oC/30 giây, 50oC/30 giây 72oC/1 phút - 72oC/10 phút - Giữ sản phẩm PCR 4oC - Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR (Hình 3.7) - Nếu chưa chạy điện di bảo quản sản phẩm PCR -20oC Chú ý - Các thành phần điều kiện phản ứng như: Độ dài primer, chế độ nhiệt chu kỳ, số chu kỳ đối tượng thay đổi nhiều thực nghiệm Các thơng số có ý nghĩa tham khảo - Nếu làm nhiều mẫu, trộn chung thành phần khác trừ DNA Taq pol, sau chia tube cho DNA Taq pol vào sau - Thao tác tủ cấy vơ trùng (hoặc khơng) Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR SM: Chuẩn kích thước DNA Các đường số 1, 2, 3, 5: Các sản phẩm PCR khác III Tối ưu hóa điều kiện cho PCR Trình tự primer Đối với genome eukaryote người ta thường dùng primer dài khoảng 18 nucleotide trở lên Tuy nhiên, tùy trường hợp, có primer thị phân tử ngẫu nhiên RAPD1 ngắn (10-16 mer) STS2 cần primer dài (20-24 mer) Nói chung, genomic DNA khơng hồn tồn trình tự ngẫu nhiên mà cịn mang đặc tính họ gen, nhân tố có tính lặp lại (sự lặp đoạn đơn giản hay phức tạp) Tùy theo loài sinh vật tùy theo cách thể trình tự DNA khn mẫu, người ta thiết kế trình tự primer đối chiếu cẩn thận với số liệu lưu trữ trước nhằm loại trừ sai sót kỹ thuật Gần đây, người ta thường sử dụng phần mềm computer để thiết kế primer thích hợp cho mục tiêu nghiên cứu giúp loại bỏ cặp primer thiết kế không tối ưu Khi thiết kế primer cần ý số điểm sau: Cố gắng chọn trình tự primer có khoảng 50% GC Tránh G C đầu 3’ primer làm tăng hội tạo tượng primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau) Tránh chọn vùng có trình tự tương đồng để hạn chế primer tự gắn với Tính tốn nhiệt độ nóng chảy (Tm) primer với tổng số 4oC cho GC 2oC cho AT, sau trừ 5oC từ giá trị nhiệt độ ủ (Ta) primer Nói chung, nhiệt độ ủ có giá trị thấp nhiệt độ nóng chảy primer Sự khác từ 4-6oC Tm primer Ta dường không ảnh hưởng đến hiệu suất PCR Nhiệt độ trình ủ Nhiệt độ ủ thích hợp nhiệt độ cho đó 1/2 số primer gắn với DNA khuôn mẫu Công thức ứng dụng trường hợp primer có khoảng 20 oligonucleotide: Ta = (G + C) + (A + T) – 5oC (1) Tuy nhiên, cơng thức có tính tương đối, kinh nghiệm nghiên cứu có số liệu nhiệt độ cho q trình ủ Số base primer nhiệt độ thấp ngược lại Magnesium Nồng độ Mg2+ (được cung cấp dạng MgCl2) ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính DNA khn mẫu, q trình ủ primer, tính đặc hiệu sản phẩm PCR, hoạt tính Taq pol độ xác kết Nồng độ thích hợp Mg2+ từ 0,5-2,5 mM ứng với nồng độ dNTP tổng số cho Nồng độ Mg2+ cao làm cho phân tử DNA sợi đôi ổn định ngăn ngừa biến chất hoàn toàn (mở xoắn để giải phóng sợi đơn sản phẩm PCR chu kỳ) làm cho kết PCR nghèo Mặt khác, cịn làm cho tượng bắt cặp giả (tại vị trí khơng tương đồng) ổn định dẫn đến xuất sản phẩm PCR không đặc hiệu với số lượng lớn Ngược lại, nồng độ Mg2+ thấp ảnh hưởng xấu đến q trình tổng hợp DNA (Mg2+ đóng vai trị co-factor Taq pol) Do đó, cần phải xác định nồng độ tối ưu Mg2+ nhằm đảm bảo hiệu suất khuếch đại tính đặc hiệu sản phẩm PCR Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTPs) Dung dịch stock dNTP phải có pH 7, nồng độ thường dùng 10 mM (2,5 mM loại) bảo quản -20oC Hàm lượng dNTP khoảng 20-200 mM cho kết ổn định, xác đặc hiệu Bốn loại dNTP sử dụng cần có nồng độ tương đương để giảm thiểu tối đa tượng sai biệt kết hợp sai (misincorporation) mã di truyền Enzyme Taq pol Nồng độ Taq pol thích hợp từ 1-2,5 unit cho 100 mL dung dịch phản ứng Thơng thường sử dụng 0,5 unit/25 mL Nếu nồng độ Taq pol cao, xuất sản phẩm PCR không đặc hiệu làm sai lệch kết Nếu nồng độ Taq pol thấp, không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo sản phẩm PCR mong muốn Đệm ổn định hoạt động Taq pol Những chất ổn định Taq pol sử dụng gelatin Triston X-100 đệm bảo quản enzyme Nồng độ thường dùng 0,01% gelatin 0,1% (v/v) Triston X-100 Nồng độ primer Trong hầu hết ứng dụng PCR, hai primer F R phải có nồng độ Nồng độ cuối primer 0,1 mM, tương đương với 2,5 pmol (16,25 ng 20-mer) 25 mL dung dịch phản ứng Sử dụng nồng độ primer cao không cần thiết thường tạo bất lợi, thừa primer có tượng primer-dimers tượng gắn primer nhầm vị trí khn mẫu Nồng độ DNA khuôn mẫu PCR bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc giai đoạn khuếch đại Nếu chất thành phần phản ứng (bao gồm primer) có nồng độ cao DNA khn mẫu lại có nồng độ thấp giai đoạn sàng lọc PCR trở nên khó khăn hơn, tần suất để primer DNA khuôn mẫu gặp giảm rõ rệt, tiếp xúc primer primer lại tăng lên gây tương primer-dimers giai đoạn khuếch đại Thông thường, nồng độ DNA khuôn mẫu sử dụng khoảng từ 10-100 ng/25 mL dung dịch phản ứng Tỷ lệ primer DNA khuôn mẫu Một yếu tố quan trọng PCR tỷ lệ tối ưu primer DNA khn mẫu Nếu tỷ lệ q cao tượng primer-dimers xuất hiện, giống trường hợp mẫu DNA loãng Nếu tỷ lệ thấp kết sản phẩm PCR không nhiều Trong hầu hết trường hợp áp dụng PCR, người ta dùng nồng độ primer không 0,5 mM (12,5 pmol/25 mL) tính tốn nồng độ DNA khn mẫu để tránh tượng primer-dimers 10 Khởi động nóng PCR Khởi động nóng PCR (“host-start” PCR) phương pháp sản xuất sản phẩm PCR DNA khuôn mẫu primer trộn với giữ nhiệt độ ngưỡng liên kết không đặc hiệu primer khuôn mẫu Tất thành phần PCR bổ sung trước ngoại trừ chất then chốt (thường Taq pol) Chỉ trước vào chu kỳ khuếch đại, thành phần chưa có bổ sung phép phản ứng xảy nhiệt độ cao Do khơng có tượng lai khơng đặc hiệu primer với khuôn mẫu, nên băng DNA khuếch đại trở nên sáng hơn, đoạn primer khơng có hội để gắn với Kỹ thuật tiến hành cách làm lạnh tube đá tuyết (ice bath) bổ sung hỗn hợp thành phần PCR Sau đó, đặt tube máy PCR làm nóng trước bổ sung thành phần cuối Dưới ví dụ minh họa cho khởi động nóng PCR 10.1 Chuẩn bị dung dịch master mix cho vào E-tube loại 0,5 mL trộn thành phần sau: Đệm 10× PCR 4,5 mL Hỗn hợp dNTP (2,5 mM loại) mL Primer-F (10 pmol/mL) 2,5 mL Primer-R (10 pmol/mL) 2,5 mL Thêm H2O tới 40 mL 10.2 Chuẩn bị dung dịch pha lỗng Taq pol: Đệm ×10 mL Taq pol (5 units/mL) Thêm H2O tới mL 20 mL 10.3 Bổ sung mL DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 mL dung dịch master mix tube 10.4 Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heat block máy PCR để thực chế độ nhiệt theo chu kỳ sau: - Start program - “Hot start”: Khoảng 80oC/10 giây «pause» - Bổ sung mL/1 tube dung dịch pha loãng Taq pol - Restart - 94oC/5 phút - Thực 30 chu kỳ: 94oC/30 giây, 54oC/30 phút 72oC/1 phút - 72oC/10 phút - Giữ sản phẩm PCR 4oC - Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR - Nếu chưa chạy điện di bảo quản sản phẩm PCR -20oC IV Thiết kế primer Việc chọn lựa primer có ý nghĩa quan trọng muốn ứng dụng PCR có hiệu độ xác cao Vì thế, phải có thiết kế xác oligonucleotide primer Trình tự primer chọn xác định kích thước vị trí sản phẩm PCR, Tm vùng khuếch đại Primer thiết kế giúp tránh tạo sản phẩm PCR không đặc hiệu (non-specific) Mục đích việc thiết kế primer có cân hai kết quả: đặc hiệu hiệu suất khuếch đại Sự đặc hiệu xem xét sở xuất lần tượng gắn primer nhầm (mis-priming) tổng số lần gắn primer (priming) tức lai primer khn mẫu vị trí đích Hiệu suất tiếp cận với lý thuyết kết sản phẩm, chu kỳ PCR, cặp primer khuếch đại sản phẩm Với trình tự DNA cung cấp người ta phân tích primer computer để có kết cân hai mục tiêu nói Chiều dài primer Tính đặc hiệu sản phẩm PCR thường phụ thuộc vào chiều dài primer nhiệt độ ủ Các oligonucleotide có kích thước khoảng 18-24 base có xu hướng trở thành trình tự đặc hiệu nhiệt độ ủ PCR thiết kế sai khác vài độ so với Tm primer (nhiệt độ lý thuyết) Primer có chiều dài lớn khả gắn primer nhỏ Trong khuếch đại, cố q trình ủ làm giảm kết PCR Để tối ưu hóa PCR, người ta sử dụng primer có chiều dài tối thiểu cho đảm bảo Tm khoảng 54oC chút ít, điều cung cấp hội tốt để trì tính đặc trưng sản phẩm PCR hiệu suất phản ứng cao Những oligonucleotide ngắn (15 base ngắn hơn) sử dụng hạn chế nhiều quy trình PCR Chiều dài primer tối thiểu cho hầu hết ứng dụng PCR khoảng 18 nucleotide người ta thường thiết kế primer có độ dài 18-24 mer Primer ngắn q trình gắn primer khn mẫu DNA nhanh, tạo thành sợi đôi ổn định tổng hợp DNA Thơng thường, primer có 28-35 mer cần cho việc khuếch đại trình tự có mức độ dị hợp cao Đối với primer ngắn 20 mer, sử dụng cơng thức tính Tm liên hệ với base: Tm = (G + C) + (A + T) Trong primer dài cơng thức có giá trị gần Nucleotide cuối primer Vị trí đầu 3’ primer nên xác định cẩn thận, có tính chất định cho thành cơng PCR Khi xác định amino acid, hai base codon ba base trường hợp mã hóa codon đơn (methionin tryptophan) hai ba base dùng đầu 3’ Những cặp base hoàn chỉnh đầu 3’ primer khuôn mẫu cho phép có kết mong muốn, giảm thiểu tối đa tượng bắt cặp sai (mismatch) khoảng 5-6 nucleotide đầu 3’ primer Thơng thường, việc thêm vào trình tự khơng liên quan đầu 5’ primer không làm thay đổi trình gắn mồi Nhiệm vụ đầu 3’ primer kiểm soát tượng gắn primer nhầm ngăn cản tượng tương đồng cặp primer Nếu không thận trọng việc xác định đầu 3’ tượng primer-dimers xảy ra, với tính chất bổ sung cho sản phẩm PCR lúc khuếch đại primer khơng phải DNA khn mẫu mà ta mong muốn Trong trường hợp có nhiều cặp primer đưa vào phản ứng (multiplex PCR), cần phải kiểm tra gấp đôi tượng bổ sung cho tất primer Hàm lượng GC nhiệt độ nóng chảy Tm Primer PCR phải trì hàm lượng GC đến mức Những oligonucleotide có 20 base với 50% GC thường có giá trị Tm khoảng 56-62oC tạo điều kiện để trình ủ đạt kết tốt Hàm lượng GC Tm phải khớp với cặp primer thiết kế Nếu giá trị Tm lớn hội cho tượng gắn primer nhầm cao Do đó, thiết kế primer cần phải lưu ý đặc biệt đến hàm lượng GC V Kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT-PCR phản ứng khuếch đại đoạn khuôn mẫu RNA theo nguyên lý PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ Phiên mã ngược khuôn mẫu RNA thành sợi DNA thứ nhất, sau dùng sợi làm khn mẫu để tổng hợp sợi DNA thứ hai (tương tự giai đoạn thứ thứ hai trình tổng hợp cDNA-xem chương 6) Giai đoạn thứ hai Dùng DNA sợi đôi làm khuôn mẫu để thực phản ứng PCR trình bày RNA cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine uracil) liên kết với tạo thành chuỗi đơn Khi chuỗi nucleotide biến đổi thành DNA uracil (U) thay thymine (T) Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi DNA thứ phải nhờ đến enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) giai đoạn gọi phiên mã ngược (RT), sau q trình tổng hợp sợi DNA thứ hai lại nhờ enzyme khác DNA polymerase I (thường dùng đoạn Klenow) Khi có DNA sợi đơi từ khn mẫu RNA phản ứng khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR thực với ba mức nhiệt độ phù hợp chu kỳ Toàn phản ứng khuếch đại đoạn DNA từ khn mẫu RNA trải qua hai giai đoạn nói gọi RT-PCR Do tự nhiên số virus có hệ gen RNA (retrovirus) nên muốn khuếch đại đoạn gen người ta phải dùng kỹ thuật RT-PCR Một số nghiên cứu khác mRNA cần đến RT-PCR để biến đổi sợi RNA thành DNA cho q trình tạo dịng để phân tích trình tự gen (gene sequencing) hay tái tổ hợp (recombination) nghiên cứu biểu gen VI Real-time PCR Giới thiệu chung Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại phát nhờ phân tích đầu cuối (end-point) cách chạy điện di DNA agarose gel sau phản ứng kết thúc Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát định lượng sản phẩm khuếch đại tiến trình phản ứng diễn dựa sở phản ứng huỳnh quang, tăng lên số lượng DNA tương ứng với tăng lên tín hiệu huỳnh quang Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, probe primer đặc hiệu chuỗi (trình tự) đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR) Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt gắn với module phát tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khuếch đại xảy Tín hiệu huỳnh quang đo phản ánh số lượng sản phẩm khuếch đại chu kỳ Real-time PCR có ưu điểm so với PCR truyền thống cho phép định lượng số copy khởi đầu khn mẫu với độ xác độ nhạy cao phạm vi động học lớn Các kết real-time PCR chất lượng (sự có mặt khơng trình tự đích) định lượng (số copy DNA) Real-time PCR định lượng biết qPCR Số liệu real-time PCR đánh khơng cần điện di gel, thời gian thí nghiệm rút ngắn số lượng nguyên liệu đưa vào trình tăng lên Cuối cùng, phản ứng chạy số liệu đánh giá hệ thống tube đóng kín, nên hội nhiễm bẩn giảm thiểu cần thiết thao tác hậu khuếch đại loại bỏ Phân tích tổng quát phản ứng real-time PCR Để hiểu real-time PCR nào, bắt đầu đường cong khuếch đại mẫu (Hình 3.9) Trong hình này, số chu kỳ PCR trình bày trục x, tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm khuếch đại tube, trình bày trục y Đường cong khuếch đại có pha, pha hàm mũ (exponential phase) pha ổn định (plateau phase) Trong suốt pha hàm mũ, số lượng sản phẩm PCR xấp xỉ gấp đôi chu kỳ Tuy nhiên, phản ứng diễn thành phần phản ứng bị tiêu hao, cuối làm cho nhiều thành phần bị hạn chế Ở điểm phản ứng chậm lại vào pha ổn định (các chu kỳ 28-40, Hình 3.9) Hình 3.9 Đường cong khuếch đại Tín hiệu huỳnh quang trình bày trừ đường (baseline) Đầu tiên, tín hiệu huỳnh quang trì mức độ (background), việc tăng tín hiệu huỳnh quang khơng thể phát (các chu kỳ 1-18, Hình 3.9) cho dù sản phẩm tích lũy theo hàm mũ Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới hiệu suất cho phép phát tín hiệu huỳnh quang Số chu kỳ để đạt hiệu suất gọi chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, CT) Do giá trị CT đo pha hàm mũ tác nhân phản ứng không bị hạn chế, nên real-time qPCR sử dụng để tính tốn xác tin cậy số lượng khởi đầu khuôn mẫu diện phản ứng CT xác định chủ yếu số lượng khuôn mẫu diện lúc bắt đầu phản ứng khuếch đại Khi lượng khuôn mẫu nhiều cần vài chu kỳ khuếch tích lũy sản phẩm đủ cho tín hiệu huỳnh quang background Vì vậy, phản ứng có CT thấp sớm Ngược lại, lượng khn mẫu lúc bắt đầu phản ứng q ít, số chu kỳ khuếch đại cần nhiều để tín hiệu huỳnh quang tăng background Vì vậy, phản ứng có CT cao muộn Các dạng quan hệ sở cho hướng định lượng real-time PCR Một số ứng dụng real-time PCR - Nghiên cứu biểu gen Xác định hoạt động gen định lượng mức độ biểu thơng qua RNA kỹ thuật RT-PCR - Chẩn đoán phân tử Nghiên cứu mức độ nhiễm virus vi khuẩn để chẩn đoán bệnh viêm nhiễm - Xét nghiệm phân biệt allele Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối dùng để xác định kiểu gen mẫu vật (đồng hợp tử: có allele có allele 2, dị hợp tử: có hai allele 2) phân biệt đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorhism, SNP) VII Một số ứng dụng PCR PCR có phạm vi ứng dụng rộng công nghệ sinh học đại Theo nguyên tắc trên, có nhiều bổ sung cải tiến để dùng PCR cho nhiều mục đích khác Ở giới thiệu số ứng dụng chính: - Trong nghiên cứu genome + Nhân phân tử PCR + PCR tái tổ hợp + Kỹ thuật footprinting DNase I + Sàng lọc thư viện λgt11 + Multiplex PCR - Trong y học + Phát tế bào T/virus gây bệnh ung thư máu + Phát virus viêm gan B + Phát virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết + Phát vi khuẩn lao Sử dụng PCR để tạo nhanh gen tổng hợp Sử dụng phương pháp PCR hai giai đoạn (two-step PCR) để tạo nhanh gen tổng hợp Phương pháp xây dựng sở nucleotide chồng lên (overlapping), sử dụng để tạo đoạn DNA tổng hợp thơng qua nhiều vịng khuếch đại PCR Khả tạo DNA tổng hợp có nhiều ứng dụng tùy thuộc vào thiết kế Người ta thiết kế gen tổng hợp có chứa codon dùng để biểu protein thể sinh vật Phương pháp hoàn tất nhờ giải mã ngược chuỗi amino acid protein mong muốn Để thay đổi cấu trúc codon, gen tổng hợp thiết kế có vị trí cắt hạn chế thuận lợi phục vụ cho thí nghiệm tạo dịng sau Nguyên tắc PCR hai giai đoạn hai phản ứng PCR xảy liền nhau, phản ứng thứ PCR phát sinh sợi khuôn mẫu tương ứng với gen tổng hợp sau khuếch đại phản ứng PCR lần thứ hai (Hình 3.10) Trước bắt đầu trình này, người ta phải thiết kế cấu trúc xác định trình tự nucleotide gen tổng hợp mà mong muốn Sau đó, trình tự oligonucleotide (primers) theo chiều dài gen phải thiết kế tổng hợp Thông thường, người ta tổng hợp oligonucleotide theo số chẵn với chiều dài khoảng 16-30 nucleotide Tạo dòng cDNA PCR Kỹ thuật tạo dòng kinh điển cDNA đòi hỏi nhiều công sức xây dựng thư viện để bảo quản bacteriophage plasmid, cần khối lượng công việc chọn lọc số lượng lớn phage plasmid có tính chất tái tổ hợp Có ba hạn chế phương pháp này: - Cần có lượng chất (ít µg) mRNA tinh làm vật liệu khởi đầu để xây dựng thư viện với mức độ đa dạng đầy đủ cho nghiên cứu - Khó khăn thuộc chất bên phản ứng enzyme tiếp nối làm cho việc tạo dịng cDNA có kết thấp, dịng gen bị đứt đoạn - Việc sàng lọc thư viện với kỹ thuật lai đòi hỏi nhiều thời gian Kỹ thuật PCR giúp khắc phục nhược điểm nói trên, làm cho việc tạo dòng cDNA trở nên dễ dàng Sử dụng hai primer đặc hiệu gen, cDNA có trình tự biết rõ, người ta cho khuếch đại PCR Tuy nhiên, khó phân lập cDNA hoàn chỉnh (full-length) từ mRNA, sở thơng tin trình tự hạn chế Trình tự chưa biết nằm kề đoạn nhỏ trình tự biết rõ Trình tự chưa biết khuếch đại phương pháp PCR thơng thường Do đó, phương pháp PCR mỏ neo phương pháp PCR đảo ngược phát triển thời gian gần để giải vấn đề Hình 3.10 Sơ đồ minh họa phản ứng tạo nhanh gen tổng hợp thông qua phương pháp PCR hai giai đoạn Gen quan tâm khuếch đại phản ứng PCR thứ với cặp oligonucleotide đặc hiệu gen có đưa vào vùng chồng lên (primer A primer B) Trong phản ứng PCR thứ hai, primer mở rộng C D gắn với vùng chồng lên sản phẩm PCR lần thứ bổ sung tất nhân tố điều hòa cần thiết cho phiên mã dịch mã Sản phẩm PCR lần thứ pha loãng 200 lần để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR thứ hai 2.1 PCR mỏ neo Kỹ thuật PCR mỏ neo có điểm chung là: Tạo dòng DNA từ đoạn trình tự biết tới đoạn trình tự kế cận chưa biết nhờ giúp đỡ primer đặc hiệu gen đầu sợi đơn primer tổng hợp đầu sợi đơn khác Do có primer đặc hiệu gen neo PCR làm dễ dàng cho việc thu thập lượng lớn sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu so với PCR chuẩn Kỹ thuật khác với PCR chuẩn cần primer đặc hiệu cho phản ứng Trong kỹ thuật PCR mỏ neo, đuôi nhân tạo gốc dA thêm vào đoạn cuối DNA khuôn mẫu Sự khuếch đại DNA xảy có primer trình tự biết trước primer thứ hai có gốc oligo(dT) 2.2 PCR đảo ngược Phương pháp PCR đảo ngược có thuận lợi lớn nhờ khuếch đại trình tự kế cận chưa biết hai primer đặc hiệu gen PCR đảo ngược hoạt động theo ngun tắc tạo dịng sợi đơn trình tự DNA Sau đó, DNA cắt RE vị trí tương ứng để tạo DNA đích, hoạt động theo chu trình có tính chất monomer DNA khuếch đại lên primer tương đồng hai đầu sợi đơn DNA có trình tự biết Hình 3.11 Ứng dụng PCR đảo ngược Hai primer đặc hiệu gắn vào trình tự biết sau DNA khuếch đại theo chiều mũi tên Ban đầu sợi 5’®3’của mRNA cho vào phản ứng phiên mã ngược thành sợi đơn cDNA 3’®5’, tiếp tục tổng hợp sợi đơn cDNA lần thứ hai, cho sợi đơi cDNA (5’®3’và 3’®5’) Sợi có chứa trình tự biết rõ Kỹ thuật tạo dòng làm cho cDNA thẳng biến thành cDNA vòng sợi đơi Tiếp đến, mở vịng nhờ RE cắt trình tự biết làm đôi, nửa đầu sợi thẳng bên này, nửa bên Kéo thẳng sợi DNA khuếch đại PCR (Hình 3.11) Ứng dụng di truyền PCR giúp đắc lực cho việc lập đồ gen (gene mapping) sinh vật Phương pháp có tên phân tích DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) Trong phương pháp RAPD, PCR thực với primer chọn ngẫu nhiên Kết tạo số đoạn DNA có chiều dài khác đặc trưng cho loài, chí cá thể So sánh điện di sản phẩm PCR nhiều giống có đặc điểm khác lồi, với nhiều primer khác giúp xác định đồ gen sinh vật Hiện nay, ngồi RAPD cịn có nhiều loại thị phân tử (molecular marker) khác phát triển đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay gọi lặp lại đoạn nucleotide đơn giản (simple sequence repeats, SSR), đa hình chiều dài đoạn DNA khuếch đại chọn lọc (amplified fragment length polymorphism, AFLP) Các kỹ thuật xây dựng sở PCR (ngoại trừ RFLP) có triển vọng lớn nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), định vị gen (gene location) lập đồ gen chúng đơn giản mặt kỹ thuật, tiết kiệm thời gian có hiệu cao PCR cịn dùng thay cho điện di isozyme để phân loại thực vật, xác định mối quan hệ chúng cách xác Ứng dụng chẩn đốn lâm sàng Trước đây, kỹ thuật phân tích RFLP thường sử dụng để xác định đột biến dẫn tới bệnh di truyền người Tuy nhiên, kỹ thuật áp dụng trường hợp đột biến dẫn đến thay đổi trình tự phát sở độ dài đoạn DNA Ngược lại, trường hợp số đột biến gây bệnh di truyền không tạo đoạn DNA cắt hạn chế khác phân tích RFLP phát xác định trình tự đoạn DNA chứa điểm đột biến Như vậy, buộc phải xây dựng thư viện hệ gen (xem chương 5) cho người, sau tạo dịng xác định trình tự nucleotide dịng gen đột biến, phương pháp địi hỏi tốn nhiều thời gian Kỹ thuật PCR cho phép đưa chọn lựa khác đơn giản cho phép thu nhận thông tin trình tự gen nhanh cách khuếch đại đoạn gen chứa điểm đột biến sau phân tích trực tiếp sản phẩm PCR thu Khả nhận dạng nhanh đột biến không quan trọng chẩn đốn lâm sàng, mà cịn đẩy nhanh việc nghiên cứu bệnh di truyền Độ nhạy cao kỹ thuật PCR cho phép ứng dụng dễ dàng chẩn đốn bệnh nhiễm trùng Ví dụ: việc khuếch đại số lượng lớn DNA virus mẫu bệnh cho khả chẩn đoán bệnh sớm trước triệu chứng bệnh bắt đầu xuất Điều giúp cho thầy thuốc có phác đồ điều trị bệnh thích hợp, đặc biệt bệnh ung thư virus gây (ví dụ: ung thư vịm họng papillomavirus người gây ra) thơng thường có kết bắt đầu điều trị giai đoạn sớm Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA Chen BY and Janes HW 2002 PCR Cloning Protocols 2nd ed Humana Press Inc New Jersey, USA Dieffenbach CW and Dveksler GS 2003 PCR Primer: A Laboratory Manual 2nd Edition Cold Spring Habor Laboratory Press, NewYork, USA Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ 1990 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, New York, USA Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey, USA Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany RAPD (random amplified polymorphic DNA): DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên STS (sequence-tagged site): STS primer thiết kế sở trình tự RAPD markers ... phần phản ứng - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - primer (F R) - Taq pol - loại dNTP - Đệm muối khống Hình 3.5 Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo Thực phản ứng Dưới ví dụ minh họa cho phản ứng. .. nucleotide (adenine, guanine, cytosine uracil) liên kết với tạo thành chuỗi đơn Khi chuỗi nucleotide biến đổi thành DNA uracil (U) thay thymine (T) Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành sợi DNA thứ phải... sau Nguyên tắc PCR hai giai đoạn hai phản ứng PCR xảy liền nhau, phản ứng thứ PCR phát sinh sợi khuôn mẫu tương ứng với gen tổng hợp sau khuếch đại phản ứng PCR lần thứ hai (Hình 3.10) Trước