Đang tải... (xem toàn văn)
PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng tương đương với việc khám phá ra các enzyme hạn chế (xem chương 1) và kỹ thuật Southern blot (xem chương 5). PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1). PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200-3.000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Các phương pháp cơ bản của việc xây dựng DNA tái tổ hợp in vitro 1. Phương pháp sử dụng các đầu dính Bất kỳ đoạn DNA nào nếu được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn (ví dụ, EcoRI) cho các đầu dính thì có thể dính líp lại với nhau và được nối bởi DNA ligase (hình 1). Phương pháp thành lập phân tử DNA tái tổ hợp kiểu này lần đầu tiên được đưa ra bởi J.Mert và R.Davis năm 1972 bằng thực nghiệm trên các virus. Và sau đó, lần đầu tiên năm 1973, H.Boyer và nhóm nghiên cứu của S.Cohen đã tạo ra được phân tử DNA tái tổ hợp gồm vector là plasmid nhỏ pSC101 của E. coli và DNA ''ngoại lai'' là một plasmid khác. Chính sự kiện này đã đặt nền móng và mở ra triển vọng to lớn cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp sau này. Hình 1 Hai phân tử DNA khác nhau được cắt bởi cùng một enzyme giới hạn EcoRI tạo ra các đầu dính bổ sung nhau, bằng cách đó có thể khâu nối thành phân tử DNA tái tổ hợp in vitro nhờ xử lý với DNA ligase. 2. Phương pháp nối trực tiếp hoặc tổng hợp các đầu bổ sung Đối với các đoạn DNA được tạo ra bằng cách xử lý enzyme giới hạn cắt thẳng như HindII chẳnghạn, thì việc nối các đoạn DNA có đầu bằng được tạo ra có thể thực hiện theo hai cách sau: Nối trực tiếp bằng DNA ligase của phage T4 hoặc tổng hợp thêm các đầu dính vào các đầu 3' một số nucleotide bổ sung bằng cách sử dụng các enzyme end-transferase, rồi sau đó các đoạn DNA như thế sẽ được nối với nhau bởi DNA ligase của vi khuẩn. Cơ sở của phương pháp kết hợp DNA này được thực hiện lần đầu tiên giữa DNA của virus SV40 với DNA của phage l bởi L.Lobban và D.Kaiser (1972), và D.Jackson và P.Berg (1972) . phân tử DNA tái tổ hợp in vitro nhờ xử lý với DNA ligase. 2. Phương pháp nối trực tiếp hoặc tổng hợp các đầu bổ sung Đối với các đoạn DNA được tạo ra bằng. cắt thẳng như HindII chẳnghạn, thì việc nối các đoạn DNA có đầu bằng được tạo ra có thể thực hiện theo hai cách sau: Nối trực tiếp bằng DNA ligase của