Khóa luận tốt nghiệp Hóa học: Khảo sát thành phần hóa học của cây phèn đen Phyllanthus Reticulatus POIR., họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

Các nghiên cứu trước đây cho thấy những loài thuộc chỉ Phyllanthus chứa nhiều loại hợp chất có hoạt tính sinh học như: alkaloid, triterpenoid, tannin, lignan, sesquiterpen,...Ngoai ra, Y

—— = De SK oec= -©—

Bee BO GIAO DUC VA DAO TAO St

a TRUONG DAI HOC SU PHAM TP HO CHi MINH SN

Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ

THAU DAU (EUPHORBIACEAE)

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Sinh viên thựchiện : Trần Thanh Vương

Lớp : Hóa Hữu Cơ 4C

MSSV : 35106059

Tp H6 Chi Minh, thang 05 nam 2013

s* Cảm ơn Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã theo sát, tan tình hướng dẫn, giúp đỡ, cung

cấp kiến thức và động viên em trong suốt thời gian thực hiện dé tai khóa luận tốt

nghiệp Được Cô hướng dẫn là một may mắn lớn của em trong năm học cuối cùng

nay tại trường Dai học Sư phạm Em xin cam ơn Cô!

Cảm ơn Thầy Dương Thúc Huy, Cô Lê Thị Thu Hương đã giúp đỡ và cho em

những ý kiến quý báu dé em hoàn thành đề tải của mình.

Cảm ơn tat cả quý Thay Cô khoa Hóa đã tận tinh day đỗ em trong suốt bốn năm qua để em có kiến thức hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình.

Cam ơn các bạn Liêu Diệp Han, Tran Thị Kim Liên, Luong Thị Thủy đã giúp đỡ,

chia sẻ cùng em những khó khăn, vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đẻ tải.

Cảm on ba mẹ va cả gia đình đã nuôi nang, dạy đỗ, là chỗ dựa tinh thân vững vang

nhất giúp em vượt qua mọi khó khăn và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất dé em hoàn

thành dé tài khóa luận tốt nghiệp này.

Xin gửi lời chúc tốt đẹp nhất đến mọi người!

MỤC LỤC

NGHI 260210662400222256111002210022216221-100220502213203121022252322312231219321336223930114195243922132053530 ii

DANH MỤC CÁC TU VIET TAT ooo -ccccsscssssesssssecsssveessseessssecsssveseneeessusecssneeensescaseeen V DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU 2- 22 ©2222222St92S222192212221922122222222212221272122c12 e vi

DANH 10/909 - aaaa Vii

DANH MỤC CÁC SO BO) ccssssisesscssssssisecsssassonssessivesssnassonsdessivesisassonsssseaivesisassonsdeonase viii

0 9I.000/ve (ae 01a ix 0Ð9):0)00Ie\(e.0000 11 x

LOL MO Ó4ŸỶỒIĨIĨIẶĨẶẶẶI 1 CHƯNG, TOINE HO LAN cscccacoassseazesssesasscesscesoossasansesssssstevarsnsasssstesssaeeqqssnoesnsnesseacssesis 3

1.1 ĐẶC DIEM THỰC VAT CAY PHEN ĐEN -.ccccccieccceecce 4

MIU, ÍNHGHRIBDNIE isciiiiisiioiiisiiziiiniiitsiiiiiiiii2i000201020122101212121102410831202015830321630182436 4

1.12 Vùng phân bố, thu hái - 22222222 2EEE22E2222522112222222223112111 21222222 xe 4

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VE DƯỢC TÍNH -222-5552Sc2vzsrrreerree 4

1.2.1 Dược tính theo y học cễ truyền ¿5222 22222222122 E2S E22 ctrrZxrcsrrrcee 5 1.2.2 Các nghiên cứu vẻ dược tinh của một số loài thuộc chi Piiyllanthus 5

1.3 CÁC NGHIÊN CUU VE THÀNH PHAN HOA HỌC 6

1.3.1, PjjWiliniili§iđ6125::-:::::::s:::-:::s::s:siiepiiiiitiiiiiigitiAL1211112311631183385511633953433453583332338 7I.3:2 PBhYÌHHIRWS:GCHUHHGĂHE iiosaoiaaoioiiioitiodiiiE3136148432138138313343081303830545683855818881853858818 7

I.3:3 Phyllanthusiameares ¡¡sosooeoooeeioiiiostiisiiiitiiniiiiBEiiSi1815105136533856158556855888152555535858318 7

1.3.4 Phyllanthus Giscoides ssccsccsssessscssscersscssscssscssssccsscssscesecsssessenccsscssscessecssosssenssnees 8H512: T9 (AnTHHSHIDIGGI 2.:032.102:23222252220213132223222232321215152013201392322233033312401225382:3 §1.3:6 PhylfnnilhiusTEXHDEHS:-:::-::::-:::::::eicssioiiiieiiiiiitiaiiiliiL501143126315525103335353263558633583536358 §l.3:§ PhylanihuemyTIWOUS-:::-::::::::::::::: ii-<cicsiioiniioiieniieiiiaEiES511.3152811565185355838853885580 9

13:9 PhyNtniliu$:HfUFOÌEES:o::ococoooaiia-ianisniatiiaiiiliioEi1414554126518534583856254548883888388 9

1:3.I0! (Pray HN T11S(RITHTTLHD:.(.á::00002111422140123321151102115623143115312031105331163134146314351355131411125558611 9

il

1.3.1 P.YfBHNHHHS+0XYPHWÍHS:iccpotpoipoipiotiiitiiitiiisiii6114651165115613555163518261885515350555883559555 91.3.12 Phyllanthus PỌy(HÏHS - co 0H nS10Á856K8944894489444996Á89486848845 9456 91`3:13: FWNENIDUS:SEITDWIGTIHS: -:-::::::-:-:si:‡2221221155325219520162205233853852250588562255.536505555 101.3.14 Phylanthits: Simplex qc: cscscasscesesaasssscesosseosssoasseasacssseasseesesaassassecasseasseassosseostseasees 10

|3 5 EhylWaniliit$:H€ÌHS:oococaaoadiioditiaiiiigiL0124111410611213415434384336388868863388438550158435568358 101:53:10, PRY [GHIIHISIHFHHÍH:tiitiiitiiitiiittiisiii8110313084316301331388358858883858813831588538835883858855855383 101.3.17 Phyllanthus 4@1SOTH cĩc HH HT HẠ HH S41 8488844884188808801 14 10

CHƯƠNG!I THƯC NGHIỆM -2 LC-LL-Lceeececeee 24 2.1 NGUYÊN LIỆU 2 22222222222222EE2EEECEEECEEEErECErrrsrrrrreee 25

ZL: “ThụBáinguyênIỆU:::::-:::-::: :::‹:::c:-cccgbsiinniirsiiostiistiiaSiiE81251203116531560186518858ã55 25

2.1.2 Xử lý mẫu nguyên liệu -¿ 5-2222 S 2210232222112 1171112112312 1e se 25

23 HƠACHATVA THIẾT ¿sosssoaesrosaannsuarrannnnnaannnuaananaỷ 25

DI, [EU GHAI, 0221000 106206390000100002220330022/230020001027100021000203003300032100023302 25

cu na HpHHpH, ƠỎ 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP TIEN HÀNH 22-22222222222222S22zctxecvvrcrrrrerres 26

2.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chắt 2-52-2222 2222 S223 2x22 26 2.3.2 Phương pháp xác định cau trúc hố học các hợp chất . : :.- 26

PA ĐỊBHUCHPCACLOATCẤOsseoooeooenioaoneoonionooeoanaoroanee 26

2.5 CƠ LẬP CÁC HỢP CHAT HỮU CO TRONG CAO ETHYL ACETATE 27 2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate - 2-22©22zScxzccvrcrvrrcrrrerree 27

2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng L - - 2555-52 2§

2.5.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bảng 2 - - - 28

2.5.4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 29 CHƯƠNG IIL KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 22222222222 222222222222322222 2e 32

3.1 KHẢO SÁT CÁU TRÚC HĨA HOC CUA HỢP CHAT V3 33 3.2 KHẢO SÁT CÁU TRÚC HOA HỌC CUA HỢP CHAT VI 35

CHƯƠNGIV KET LUAN VA DB XUẤT ciecoocooeooeneooeaoenionioeooeaaee 41

4.1 4080897901 42

42 — ĐÈXUẤÁT 2.2 02 HH ng n2 n1 xe, 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22222 2222531211 122215211221215211211221211 2112212222112 EXC 44

PHU LỤCC 2 22 2221121251215 11211221111 21121212 211211221211 211221212 211211021211 211 21212211112 cxee 49

IV

Par per million Retention factor

Heteronuclear Single QuantumCoherence

Heteronuclear Multiplet BondCoherence

Pha đảo C-18

Mot phan triệu

Độ dịch chuyên hóa học Phô cộng hưởng từ hạt nhân

cua proton (1)

Phô cộng hưởng từ hat nhân

Phô tương tác di nhân qua một

liên kết

Phỏ tương tác dj nhân qua hai,

ba liên kết Phô tương quan giữa proton-

proton

DANH MỤC CÁC BANG

Bang 1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA) -2-522©5sc5sccsccczccczcres 30

Bang 2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng L - - 30

Bang 3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.4 của bang 2 31

Bang 4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2 - - 32 Bảng 5 Số liệu phô NMR của VÂ 222 222 222222112122222212221.271 E11 11 cxe 42 Bang 6 Số liệu phố NMR của VÌ 2S 0 0 1002102210011 tt H1 1 1 1y nu 43

vũ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐÒ

Sơ đồ 1 Qui trình điều chế cao ether dau hoa va ethyl acetate (EA) 29

Sơ đô 2 Sơ đô cô lập các chất hữu cơ trong cao ethyl acetate của cây Phén den 33

vũ

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 TráipBêDiđEN:;::::: :-:-::-::::s:::sccccc c2 22 02iDtiiniiitiititisaiiiagi2sg2r25325g5228 5358 4

Hinh 2 Thân, lá Phen Gen sisisisscsisessicsissssisassassssaseraieosivessieassvessvasveraieosivassiensssasssesieaaseesi 4

Hình 3 Tương quan HMBC của hợp chất V3 - ¿So c2 22202 37

Hình 4 Tương quan HMBC của hợp 011A 41

ix

Phụ lục 7a Phô 'H-NMR của hợp chat V1

Phụ lục 7b Phô 'H-NMR của hợp chat V1

Phụ luc 8 Pho '°C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 8a Pho "C-NMR của hợp chat VI

Phụ lục 8b Pho ‘C-NMR của hợp chất V1

Phụ lục 9 Ph6 DEPT của hợp chất V1

Phụ lục 10 Phô COSY của hợp chất V1

Phụ lục 11 Phỏ HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 11a Pho HSQC của hợp chất V1

Phụ lục 11b Phô HSQC của hợp chat V1

Phụ lục 12 PhO HMBC của hợp chat VI

Phụ lục 12a Phô HMBC của hợp chất VI

Phụ lục 12b Phỗ HMBC của hợp chất V1

Phụ lục 13 Phô HR-ESI-MS của hợp chất VI

LOI MỞ DAU

Ngày nay, cùng với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật, ngành hóa học

đóng một vai trỏ rất quan trọng trong sự phát triển của xã hội Băng những con đường

khác nhau, các nhà hóa học đã tạo ra những sản pham có ứng dụng trong các lĩnh vực

như: y học, được học, sinh học va nông nghiệp, Tuy nhiên, những sản phẩm được tao

ra bang cách tông hợp mặc dù có kết quả nhưng lại gây ra nhiều tác dụng phụ cho con

người và môi trường Vì thế, hóa học các hợp chất thiên nhiên ngày càng được quan tâm hơn Các nha hóa học đã tiến hành tách chiết, cô lap, ban tông hợp ngày cảng nhiều

những hợp chat có hoạt tính sinh học dé tạo ra những sản phâm hữu ích từ cây cỏ để

nâng cao chât lượng cuộc sông

Các nghiên cứu trước đây cho thấy những loài thuộc chỉ Phyllanthus chứa nhiều

loại hợp chất có hoạt tính sinh học như: alkaloid, triterpenoid, tannin, lignan,

sesquiterpen, Ngoai ra, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây co có khả nang

chữa trị viêm gan, đặc biệt trong đó là các loài thuộc chỉ Phyllanthus (họ Thau dau,

Euphorbiaceae) [4]

Cay Phén den (Phyllanthus reticulatus Poir.) là thực vật thuộc chỉ Phyllanthus

được dùng trong Y học cô truyền của Việt Nam va nhiều nước trên thế giới Các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ Phén den thường được dùng trị ly, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và trẻ em bị cam tích Lá thường dùng chữa sốt, kiết

ly, tiêu chảy, phù thing, ứ huyết do đòn ngã, huyết nhiệt sinh đỉnh nhọt Vỏ thân được

dùng để chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn

Với mong muôn đi sâu hơn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong đân gian, nângcao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học

hon và có thé day mạnh khai thác sứ dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh

cho nhân dân trong cộng đồng nên chúng tôi quyết định chon cây Phyllanthus reticulatus

Poir dé làm đề tài nghiên cứu Hy vọng rằng kết quả nghiên cứu sẽ mang lại những hiểu

biết mới về mặt hóa thực vật của cây Phén đen cũng như qua đó góp phan lam tăng giá

trị ứng dụng của cây vào thực tế cuộc sống.

CHƯƠNG 1

TÔNG QUAN

1.1 ĐẶC DIEM THỰC VAT CÂY PHÈN ĐEN [2]

Tên thông thường: Phèn đen

Tên gọi khác: N6, Sap trang thao, Tảo phan diệp Diệp hạ châu mạng.

Thuộc họ Thau dau (Euphorbiaceae)

Hình 1: Trai phẻn den Hình 2: Thân, lá phén den

1.1.1 Mô tả chung [2]

Phèn đen là cây bụi mọc tự nhiên ở bở bụi, ven đường, ven rừng, cây cao 2-4m,cành gay manh đen nhạt, đôi khi họp từ 2 đến 3 cành trên cùng một đốt dài 10-20cm.

Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bau dục hay hình trứng ngược nhọn,

hay tù ở hai đầu, phiến lá rất mong, dài 1,5 - 3cm, rộng 6 - 12mm, mặt trên có màu sam

hơn mặt dưới, lá kèm hình tam giác hẹp

Cụm hoa hình chùm, mọc đưới nách lá, riêng lẻ hay xếp 2-3 cái một Quả hình

cầu, khi chín màu đen, dai 5 mm, rộng 3 mm Hạt hình 3 cạnh, màu nâu có những đốm

rat nhỏ Cây ra hoa kết qua từ tháng 8 -10 hàng năm.

1.1.2 Vùng phân bố, thu hái [2]

Phèn đen là loài cây nhiệt đới nên có phân bố rất rộng, vùng Đông Nam A, Nam

Trung Quốc, Tây và Nam Phi.

O nước ta, Phèn den mọc thành bụi tự nhiên, có thê tìm dé dàng ở bờ bụi ven

đường, ven rừng

1.2 CÁC NGHIÊN CUU VE DƯỢC TÍNH

Các loài cây thuộc chỉ Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng rộng rãi trong y

học dan tộc của nhiều nước như chữa bệnh thận, tiêu đường, viêm gan B, [8] Trong đó,

4

các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L., PhyÏlanthus

reticulatus Pow và Phyllanthus amarus Schum et Thonn [5]

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền [2,6]

Phèn đen vị đắng chát, tính mát, có tác dụng lam se, giảm dau, sát khuân, giải độc.

Chủ trị làm thuốc cam máu, chữa đậu mùa, chữa viêm cau thận, chữa ly, tiêu chảy Trong

đó rễ phẻn đen có vị chát, tính lạnh, có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, chi ta Lá Phén den

có tác dụng thanh nhiệt giải độc, sát trùng, lợi tiểu

Chữa kiết ly: dùng rễ cây Phén đen, đây mơ lông, cỏ seo ga, có tranh băng nhau,

mỗi vị 20g, gừng 2 lát 2g - sắc uéng (Nam dược thần hiệu).

Chữa bị đòn máu ứ ở trong nguy cấp: lá Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào và vắt lay nước udng (Bách gia trân tang), hoặc dùng 40g sắc rồi chế thêm một chén rượu - uống.

Chữa nhọt độc mới phát: lá Phèn đen và lá Bèo ván giã nát rồi đắp (Bách gia trân

tàng).

Chữa nhiệt tả và ly: cây Phén đen cả cành va lá, đậu đen sao, mỗi thứ 40g, dé 4 bát

nước sắc lay 1 bát, chia ra uỗng lam 3 lần (Hoạt nhân toát yêu của Hoàng Đôn Hòa).

Chữa đại tiện ra máu: cây Phẻn đen cả cảnh và lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống

(Bách gia trần tàng).

Chữa chảy máu nướu răng: lá Phèn đen phối hợp với lá Long não và lá Xuyên

tiêu phơi khô, chế thành viên rồi ngậm.

Trị rắn cắn: lá Phén đen tươi nhai nát nuốt hết nước rồi lay bã đắp lên chỗ rắn cắn.

1.2.2 Các nghiên cứu về dược tinh của một số loài thuộc chỉ Phyllanthus

Ở Quảng Tây Trung Quốc, cây Phyllanthus reticulatus Poir (Euphorbiaceae) là

một loại thuốc được sử dụng đề chống viêm khớp và điều trị bệnh thấp khớp [44].

Năm 1997, E Omulokoki và cộng sự [14] đã sử dụng dịch chiết từ lá của loài Phyllanthus reticulatus Poir để khảo sát khả năng chống ký sinh trùng sốt rét

Plasmodium falciparum ở nồng độ thừ nghiệm cho kết quả IC50 < 10ug/ml.

Năm 2010, một số báo cáo đã chứng minh rằng các chất chiết xuất của lá cây

Phyllanthus reticulatus Poir có tác dụng ngăn ngừa bệnh đái tháo đường, kháng khuan

gây độc tế bào và bảo vệ gan [28].

e Dược tính của một sé cay khác cùng chi:

Năm 1961, Phòng Đông Y - Viện Vị trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng khángsinh của cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.) cho thấy kết quả tác dụng kháng

sinh như sau: Ty cau tring (0,5 cm), Salmonella typhi (0,9 cm), Shigella flexneri

(I.lcm) Shigella sonnei (0 cm), Shigella shigae (icm), Bacillus subtilis (04 cm),

Escherichia coli (0 em) [7]

Năm 1988, Blunberg và cộng sự [1] đã nghiên cứu tác dụng của hai loài cay chó

đẻ răng cưa là Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri trên các bệnh nhan viêm gansiêu vi B Kết quả cho thấy có 22/37 bệnh nhân âm tính sau 30 ngày điều trị bằng hai loài chó đẻ răng cưa trên Các tác giả còn chứng minh cây Phyllanthus amarus có chứa chất

làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B.

Năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự [3] công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng

trên bệnh nhân viêm gan mãn tính Chế phẩm LIV/94 được sản xuất tir 3 loại thảo được:chó dé rang cưa (Phyllanthus urinaria L.), cay chua ngút (Embelia ribes Burn) và cò nhọ

noi (Ecliptaprostrata L.) được dùng dé điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính

trong 2 năm (2001-2002) Kết quả nghiên cứu cho thấy thuốc có tác dụng làm giảm và

sạch HBsAg của bệnh nhân

Bên cạnh đó, năm 2007 các nhà khoa học An độ đã khảo sát khả năng chỗng oxi

hóa từ dich chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus Kết quả cho thấy các địch chiết nay đều thé hiện tinh kháng oxi hóa [24].

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VE THÀNH PHAN HOÁ HỌC

Chi Phyllanthus, họ Thau dau (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý

nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus

Poir (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đẳng).

Thanh phan hoá học cúa chi nay rất phong phú và đa dạng [10].

Năm 1976, Wai-Haan Hui va cộng sự [46] đã cô lập được

21-ơ-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61), B-sitosterol (43), friedelin-1$,22-diol (58) và glochidonol (60) khi

nghiên cứu trên loài Phyllanthus reticulatus Poi

Năm 1981, Joshi va cộng sự [19] đã phan lập được các hợp chất kém phân cực

như friedelin (57), betulin (55) và P-sitosterol (43) từ ré và thân cay Phyilanthus

reticulatus Poir.

Năm 2009, Phan Văn Dân [7] khảo sát thành phần hóa học cây Phyllanthus

reticulatus Poir Kết quả cho thay rằng cây Phyllanthus reticulatus Poir cô chứa các hợp chất B-sitosterol (43), ƒ-sitosterol-3-Ø-J-D-glucopyranosid (44), 2-acetamido-3-

phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (76).

Năm 2012, J Xiong Ma va cộng sự [21] đã phân lập được hai arylnaphthalene

lignan glycoside từ dịch chiết methanol của cây Phyllanthus reticulatus Poir., đó là

reticulatusides A (40) và reticulatusides B (41) Ngoài ra, tác giả còn dé cập tới sự hiện

điện của syringaresinol (42) trong cây này

Do chưa có nhiều công trình nghiên cứu trên cây Phén đen (Phyllanthus

reticulatus Poir.) nên chúng tôi chỉ trình bày thành phan hoá học của một số cây khác

cùng chi

1.3.1 Phyllanthus acidus

Năm 1966, Sengupta và cộng sự [37] phan lap được hai pentacyclic triterpenoid,

đó là: phyllanthol (74) và olean-12-en-3-ol (f-amyrin) (51)

1.3.2 Phyllanthus acuminatus

Năm 1984 - 1985, Pettit và cộng sự [31,32] đã tach được phyllanthostatin | (32)

phyllanthostatin 2 (33), phyllanthostatin 3 (34), phyllanthostatin 4 (35) và

phyllanthostatin 5 (36)

Nam 1990, Pettit và cộng sự [30] cũng da cô lập được phyllanthostatin 6 (37)

1.3.3 Phyllanthus amarus L

Năm 1995, Yeap Foo [25] phân lập được acid amariinic (45)

Năm 1996, Peter J Houghton và cộng sự [29] đã tách được 2 alkaloid mới là

isobubbialine (4) và epibubbialine (2) cùng với 3 alkaloid đã biết là phyllanthine (11), securinine (13) và nor-securinine (9) Cấu trúc của chúng được xác định dựa vào phần tích các dit liệu phô UV, IR, phô MS và NMR,

Năm 2005 va 2007, Herbert Kolodziej và Farah Naaz [15,17] cô lập được acid

shikimic (88) va epigallocatechin gallate (16).

Năm 2008, Thales R.Cipriani và cộng sự [43] phân lập được acid thiobarbituric(14) và acid ascorbic (77)

1.3.4 Phyllanthus discoides

Năm 1973, Manske va cộng sự [26] đã tách được phyHanthin (38) và 2 alkaloid là

phyllanthine (11) và phylHantidine (12)

Nam 1983, Aripova và cộng sự [38] đã cô lập được phyllalbine (10)

Năm 1988, Calixto va cộng sự [10] phan lập được

14,15-dihydroallosecurinine-15-ol (1) tinh thé màu vàng da cam.

1.3.5 PhyHanthus emblicaL

Năm 1992, Kumar Roy va cộng sự [23] đã cô lập được acid ascorbic (77)

Nam 1995, Mekkawy [13] phan lập được putranjivain A (50)

Năm 1996, Ghosal [16] đã tách được phyllanemblinin A (48) là chất bột màu trắng, emblicanin-A (46) và emblicanin-B (47).

Năm 1988, Calixto và cộng sự [10] đã cô lập được acid 2-O-galloylgalactaric (80)

và acid galloylmalic (81)

Nam 2000, Zhang và cộng sự [Š3] đã tách được prodelphinidin Al (49).

Năm 2002, Zang và cộng sự [54] đã phan lập được

1-({2-Ø-B-D-glucopyranoside]-4.6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-l-one (82) ở dang tinh thé vả

I-({2-0-[D-apiofuranosyl)-(1>6)-D-glucopyranoside] }-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan- l-one

(83) là chất vô định hình màu vàng.

Nam 2006, Ying-Jun Zhang [51] đã tách được acid phyllaemblic (87)

Năm 2008, Xiaoli Liu va cộng sự [49] đã phân lập từ địch chiết methanol được

quercetin (22) và catechin (15) đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa cao.

1.3.6 Phyllanthus flexuosus

Nam 1993, Tanaka va các cộng sự [42] đã phan lập được 5 triterpenoid có tên gọinhư sau: olean-I2-en-3J).I5ơ-diol (70); lup-20(29)-en-3B,24-diol (66); olean-12-en-3ƒ,

24-diol (71); oleana-I1,13(18)-dien-3B.24-diol (73), olean-12-en-3B,15a,24-triol (72)

betulin (55) và lup-20(29)-en-3§, 1 5a-diol (67)

1.3.7 Phyllanthus fratermus

Nam 1988, Shunyo Matsunaga và cộng sự [40] công bé da tach duge acid

trichadenic B (75)

Năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự [33] đã tách được acid

indole-3-butyric (5) và acid 1-naphthaleneacetic (84)

1.3.8 Phyllanthus myrtifolius

Năm 1999, Chen Lui và cộng sự [12] đã phân lập và nhận danh được

4-0-brevifolincarbonyl- 1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos (78)

1.3.9 Phyllanthus niruroides

Năm 1996, Babady Bila va cộng sự [9] đã phân lập được một hợp chất mới thuộc

nhóm alkaloid là niruroidine (2,7-diepimer) (8)

Năm 2007, tại vùng Dinh Bảng, Từ Son, Bắc Ninh từ phan dịch chiết ethyl acetate

đã phân lập được hai chat là: 2,4,6-cyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy- l-one (79)

Năm 2003, Sutthivaiyakit và cộng su [41] đã tách được: acid

29-nør-3.4-seco-friedelantriterpen (68) và guaiane (85) Những hợp chat này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ IC;ạ= 0.017 + 0.001 mM.

1.3.12 PhyHanthus polyanthus

Nam 2008, Vuyelwa J.N va cong su [45] da tim ra duge mot SỐ triterpenoid gom:(20S)-3-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (54), lupenone (63) và (205)-3d-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol (53)

1.3.13 PhyHanthus sellowianus

Nam 2002, Hnatyszyn [18] đã phan lập được rutin (23) và isoquercitrin (20)

1.314 Phyllanthus simplex

Năm 1998, Rajkishor S Negi va Thawra M Fakhir [34] đã phan lập được

(14-hydroxy-4-methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) (3) va phyllanthin (38) Chat (3) da va

dang được sử dung lam thuốc Tây y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phỏ

biến trên thị trường.

1.3.15 Phyllanthus tenellus

Theo luận văn cao học của Phan Van Dân [7] năm 1971, 1972, 1974, các tác giả

lần lượt là Asakawa, Bick và Bilia đã phân lập được tenellus-1 (17) và tenellus-2 (18).

1.3.16 Phyllanthus urinaria

Năm 2000, Zhang L.Z và cộng sự [52] đã tách được một số triterpenoid như:

lupeol acetate (64), -amyrin (51), B-amyrylglucosid (52) và lupeol (62)

Nam 2003, Chang va cộng sự [II] đã cô lập được 2,3-desmethoxy

seco-isolintetralin diacetate (27), linnanthin (39), phyllanthin (38), hypophyllanthin (28),

niranthin (29), nirtetralin (30) và phyltetralin (31) Cau trúc của các hợp chất nay được

xác định bằng cách thuỷ giải và dựa vào các dữ liệu phô khối lượng và phô cộng hưởng

từ hạt nhân

Năm 2005, Wanxing Wei va cộng su [47] đã phân lập được acid

pentahydroxybenzoic (86)

1.3.17 Phyllanthus watsonii

Năm 1992, Matsunaga va Tanaka [27] đã tách được hợp chất triterpen:

26-nor-D:A-fricdooleanane (69) củng với một số hợp chat khác la: lupenyl palmitate (65),

friedelin (57), epi-friedelanol (56), glochidone (59), glochidonol (60) lupeol (62) và

lup-20(29)-en-3B,24-diol (66)

Các công thức cấu tạo một số hợp chat trong chỉ Phyllanthus

e Cac alkaloid

10

2,3-Desmethoxy secø-isolintetralin (24) Š-Desmethoxvniranthi (25)

Demethylenediox yniranthin (26) 2,3-desmethoxy seco-isolintetralin

diacetate (27)

13

OCH OCH3

HN CHạ

Glochidone (59) Glochidonol (60)

CH S Co”? HạC bạ

21-a-Hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one (61) Lupeol (62)

19

Hg bHaOH

Lup-20(29)-en-3J3,24-diol (66) Lup-20(29)-en-3J3, 1 Sa-diol (67)

Acid 29-nor-3,4-seco-friedelantriterpen (68) — 26-Noz-D:A-friedooleanane (69)

Olean-I2-en-3 I 5œ,24-triol (72) Oleana-l I,13(18)-dien-3ð.24-diol (73)

glucopyranoside]

}-4,6-dihydroxyphenyl)-2-metylpropan-l-one (83)

toto

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM

2.1 NGUYEN LIEU

2.1.1 Thu hái nguyên liệu

Mau cây dùng trong khảo sát thành phan hóa học là lá, thân và rễ cây Phèn den

(Phyllanthus reticulatus Potr.) được thu hái tại huyện Tân Uyên, Bình Dương, vào tháng

7/2012

Mẫu cây đã được GS.TS Võ Văn Chi nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus

Reticulatus Poir.”, họ Thau dau (Euphorbiaccac).

2.1.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn đem sấy đến khối lượng không đôi Sau đó tiến hành ngâm chiết

và phân lập các hợp chất.

2.2 HOÁ CHAT VÀ THIET BỊ

2.2.1 Hoá chất

Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck dùng cho cột sắc ký.

Silica gel pha đảo, Rp-18, Merck dùng cho sắc ký cột.

Sắc ký bảng mỏng loại 25DC — Aflufolein 20x20, Kiesel gel 60Fas¿ Merck;

sắc ký bảng mỏng loại 25DC, Rp-18, Merck.

Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: ether đầu hoa, cthanol, chloroform,

ethyl acetate, acetone, methanol và nước cất.

Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu co trên bang mỏng: sử dung H,SO, 30%.

Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm

Can điện tử hiệu Sartorius max 620 g.

25

2.3 PHƯƠNG PHÁP TIEN HANH

2.3.1 Phương pháp phan lập các hop chat

- Sử dụng kỹ thuật SKC silica gel pha thường, pha đảo R,-18 kết hợp SKLM.

- Phát hiện chất băng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng

thuốc thử là dung dịch H;SO, 30%.

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

- Phô cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): ‘H-NMR (500 MHz), C-NMR (125

MHz), 2D-NMR do trên may Bruker Avance tai Phòng thi nghiệm Phân tích trung tâm,

Dai học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp.Hồ Chi Minh.

- Khối phô phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Bruker micrOTOF Q-II.

2.4 DIEU CHE CÁC LOẠI CAO

Lá, thân và rễ cây Phén đen (Phyllanthus reticulatus Poir.) được phơi khô, chặt

nhỏ và nghiên thành bột mịn, sây khô đến khối lượng không đôi (m = 26.00 kg).

Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 96" bằng phương pháp ngâm dam,

sau đó đem lọc vả cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô(534.00 g)

Cao ethanol thô được chiết lỏng — lỏng với ether dầu hod, ethyl acetate thu được

cao ether dầu hoả (52.00 g), cao ethyl acetate (118.00 g) Quá trình thực hiện được tóm

tắt theo sơ đỏ 1.

Sơ đồ 1 Qui trình điều chế cao ether dầu hoa va ethyl acetate (EA)

m = 26.00 kg

- Ngâm đâm trongethanol

- Lọc

Ba khô Dich ethanol |

Cô quay thu hỏi dung môi

Cao ethanol

(534.00 g)

- Chiết lỏng-lỏng với ether

Ethanol còn lại

đầu hoa, ethyl acetate

- Cô quay thu hồi dung môi

Cao ether đầu hoa ED

2.5.1 Sie kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Thực hiện SKC silica gel trên cao cthyl acetate (118,00 g) với hệ dung môi rửa

giải ED:EA có độ phan cực tăng dan từ 20% - 100% ethyl acetate Dịch giải ly qua cộtđược hứng vao các lọ

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc ki lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thảnh 1 phân đoạn Kết quả thu được 4 phân đoạn

(BA.1 - EA.4), được trình bảy trong bang 1

Bảng 1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate (EA)

EA ED:EA =7:3 Nhiều vết, tách không rõ | Chưa khảo sát

ED:EA = 1:1 Nhiều vết, tách rõ Khảo sát

EA4 | EA= 100% Chưa khảo sát

Ghi chú: ED (ether dâu hóa), EA(ethyl acetate)

2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bang 1

Sắc kí lớp mỏng trên phân đoạn EA.3 (2.53 g, bảng 1) cho nhiều vết, các vết tách

rõ nên phân đoạn EA.3 được SKC silica gel với hệ dung môi rửa giải ED:C có độ phân

cực lần lượt tăng dan từ 80 — 90% C Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ.

Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp

mỏng giống nhau được gộp chung thành 1 phân đoạn Kết quả thu được 4 phân đoạn(EA.3.1 - EA.3.4), được trình bày trong bang 2

Bảng 2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3 của bảng 1

Dung môi Sắc ký lớp mỏng Ghi chú

giải ly

EA.3.I ED:C = 1:4 Nhiéu vết, kéo dai Chua khao sat

2.5.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.2 của bang 2

Thực hiện SKC silica gel trên phan đoạn EA.3.2 (116 mg) của bang 2 với hệ dungmôi rửa giải ED:C có độ phân cực tăng dan từ 60-90% C Dịch giải ly qua cột được hứng

vào các lọ

Theo doi quá trình giải ly bằng sắc ki lớp mong Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mong giống nhau được gộp chung thanh | phân đoạn Kết quả thu được 3 phân đoạn

28

EA.32.1| ED:C=2:3 Chưa khảo sát

EA.3.2.2| ED:C= 1:4 Vết tim, tách rõ KHẢO sát, die

được V3

EA.3.2.3 ED:C = 1:9 29 mg Vet do, mờ Chua khao sat

Ghi chú: C (chlorofom), ED (ether dâu hỏa)

Kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, hiện hình bằng H;SO, 30%, đun nóng chỉ thu được | vết rõ, màu tím, Ry = 0.4 (dung môi giải ly C100%) Hợp chất này được ký hiệu là V3.

2.5.4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2

Thực hiện SKC silica gel trên phan đoạn EA.3.3 (119 mg) của bang 2 với hệ dung

môi rửa giải ED:C có độ phân cực lần lượt tăng dan từ 60 — 100% C Dịch giải ly qua cột

được hứng vao các lọ

Theo đõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng Những lọ cho kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gộp chung thành | phân đoạn Kết quả thu được 3 phân đoạn(EA.3.3.1 - EA.3.3.3), được trình bay trong bang 4

Bảng 4 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA.3.3 của bảng 2

Dung môi Sắc ký lớp mỏng Ghi chú

giải ly

Ghi chú: C (chiorofom), ED (ether dau hỏa)

Nhận xét:

Từ phân đoạn EA.3.3 của bảng 2, sắc kí cột thu được 3 phân đoạn sắp xếp theo

thứ tự EA.3.3.1 - EA.3.3 3

Trong đó, phân đoạn EA.3.3.2 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu tím ân dưới

vết đơ mờ Thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường nhiều lần trên phân đoạn nảy thu được hợp chất dạng bột, màu trắng (25.0 mg).

Kiểm tra bang sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khác nhau, hiện hình bằng HạSO,

30%, đun nóng chỉ thu được một vết rõ, màu tím, Ry = 0,35 (dung môi giải ly C100%) Kết tỉnh lại trong MeOH thu được hợp chất ký hiệu là VI.

30