Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Khảo sát điều kiện lên men chủng xạ khuẩn hiếm (non-actinomyces) nhằm thu nhận một số hợp chất có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành nhằm lên men các chủng xạ khuẩn hiếm Cl, VI, Alđược lưu trữ tại phòng Vi Sinh Ứng dung của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học vaMôi trường, Trường Đại họ

; BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TAO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHẢO SÁT ĐIÊU KIỆN LÊN MEN CHUNG XA KHUAN HIẾM (non-actinomyces)

NHAM THU NHAN MOT SO HOP CHAT CO KHA NANG

KHANG KHUAN VA KHANG NAM

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : NGUYÊN THỊ THU HÀ

Mã số sinh viên : 19126039

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thu Đức, 08/2023

; BỘ GIAODUCVADAOTAOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

KHOA LUAN TOT NGHIEP

KHAO SAT DIEU KIEN LEN MEN

CHUNG XA KHUAN HIEM (non-actinomyces) NHAM THU NHAN MOT SO HOP CHAT CO KHA NANG

KHANG KHUAN VA KHANG NAM

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS LÊ PHƯỚC THỌ NGUYEN THỊ THU HA

TP Thủ Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thành khóa luận và kết thúc khóa học, với tình cảm chân thành, em xinbày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới trường Đại học Nông Lâm Thành pho Hồ Chí Minh đãtạo điều kiện cho em có môi trường học tập tốt trong suốt thời gian em học tập vànghiên cứu tại trường.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trương Phước Thiên Hoàng và ThS

Lê Phước Thọ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và trực tiếp hướng dẫn

em hoàn thành đề tài tốt nghiệp này

Đồng thời em xin bày tỏ lòng cảm ơn đến KS Võ Trần Quốc Thắng , các anhchị, các bạn và các em trong phòng thí nghiệm VI sinh Ứng dụng đã tạo mọi điều kiện,chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Pham Đức Toàn và tập thể lớp DH19SHA —Công nghệ Sinh học khóa 45 và gia đình thân yêu luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ

em trong quá trình thực hiện đề tài

Em chân thành cảm ơn!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên là Nguyễn Thi Thu Hà, MSSV: 19126039, Lớp DH19SHA (Số di động:

0387852739, Email: 19126039(@st.hemuaf.edu.vn) thuộc nghành Công nghệ Sinh học

Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh xin cam đoan: Đây là khóa luậntốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu

là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội

đông vê những cam đoan này.

Tp Hồ Chi Minh, ngày 31 tháng 7 năm 2023

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

ul

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm lên men các chủng xạ khuẩn hiếm Cl, VI, Alđược lưu trữ tại phòng Vi Sinh Ứng dung của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học vaMôi trường, Trường Đại học Nông Lam Thành phố Hồ Chí Minh nhằm thu nhận đượchợp chất có khả năng kháng khuẩn va kháng nam Các chủng xạ khuân hiếm đượctăng sinh trong môi trường Gause I và tiến hành cho đối kháng bay chủng vi sinh vậtkiếm định Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Vibrio parahaemolyticus,

Neoscytalidium dimiatum, Candida albicans, Escherichia coli, Staphylococcus aureus

dé sang lọc hoạt tính kháng khuẩn và khang nam nhằm chon ra chủng xạ khuẩn hiếm

có hoạt tính kháng tốt nhất Kết quả chủng xạ hiếm C1 thé hiện hoạt tinh kháng với N.dimiatum, C albicans và V parahaemolyticus với đường kính vòng kháng lần lượt là4,83 mm, 5,76 mm và 4,23 mm Chủng xạ khuẩn được khảo sát trong ba môi trườnglên men (Pm4, Pm43, Pm39) với hai tốc độ lắc khác nhau (120 rpm, 150 rpm) và tiếnhành cho đối kháng với các vi sinh vật kiểm định nhằm tìm ra môi trường lên men tối

ưu nhất Qua khảo sát nhận thấy, chủng xạ khuẩn hiếm C1 thé hiện hoạt tính kháng tốtnhất trong nghiệm thức Pm4 120 với Phytophthora sp C albicans, V.parahaemolyticus với đường kính vòng kháng lần lượt là 5,46 mm, 7,03 mm, 7,96 mm

và kháng tương đối yếu với E coli Sau đó tiến hành thu nhận hợp chất có trongnghiệm thức Pm4 120 bằng quy trình tách chiết với ba loại dung môi khác nhaumethanol, ethyl acetate, petrolium ether Kết qua thu được ba cao chiết, thử nghiệmđối kháng với các vi sinh vật, nhận thấy các hợp chất có trong cao chiết với dung môiethyl acetate và methanol thể hiện hoạt tính khang với C albicans, V.parahaemolyticus, S aureus va E coli.

Từ khóa: xa khuẩn hiếm, hợp chat, kháng khuẩn, kháng nam

1H

The study was conducted to ferment rare actinomycetes Cl, VI, Al which are stored in the Applied Microbiology Department of the Research Institute of Biotechnology and Environment, Nong Lam University, Ho Chi Minh City compounds with antibacterial and antifungal properties were obtained Rare actinomycete strains were proliferated in Gause I medium and antagonized seven strains of the test microorganisms Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Vibrio parahaemolyticus, Neoscytalidium dimiatum, Candida albican, Escherichia coli, Staphylococcus aureus to screen antibacterial activity to select the rare actinomycete strains with the best antibacterial activity The results of the rare radiation strain Cl showed activity against N dimiatum, C albicans and V parahaemolyticus with ring diameters of 4,83 mm, 5,76 mm and 4,23 mm, respectively Actinomycetes were

investigated in three fermentation media (Pm4, Pm43, Pm39) with two different

shaking speeds (120 rpm, 150 rpm) and conducted for antagonism with test microorganisms to find out the environment the most optimal fermentation field Through the survey, it was found that the rare acttnomycete strain Cl showed the best

resistance activity in the treatment Pm4 120 against Phytophthora sp., C albicans, V parahaemolyticus with ring diameters of 5,46 mm, 7,03 mm, respectively, 7,96 mm

and relatively weak resistance to E coli Then proceed to collect the compounds in the treatment Pm4 120 by extraction process with three different solvents methanol, ethyl

acetate, petrolium ether The results obtained three extracts, tested against

microorganisms, found that the compounds contained in the extracts with ethyl acetate and methanol solvents showed activity against C albicans, V parahaemolyticus, E coli and S aureus.

Keywords: rare acttnomycetes, compounds, antibacterial, antifungal.

IV

MỤC LỤC

TrangLỜI CẢM COIN CỔ Co NWggỤỢỢAỰ i

OG li TT ca ra cac can cản con cả l (ẤT Tế cu iii

a ivDANH DÁCH CHỮ VIET TẮTT 2 2¿222E+2E++2EE2E+2EEE2EEEEEEEEEEtEEErrrrrrrrres ViiDANH SÁCH HINH o0 2 ssssssssssssscsvesseessessvesesesssssitsseessesssesisssisesseessessseeeseesseeeseee xiDÁNH RÃCH TAIN oe scsscsscccsunacsscnneennacrnannieanaonuarssomianaautscrannaareoneannamsannaniaml x(0) 5 1 OLO)\( Cas BY (5 2): \ Cnn | _—_—_————— ee 11.2.Mục tiêu đề tài 2-52 + 2221 E2212212121211211111121111211211112112111121121111211111 212 cay g

TS IN Gi eur CN NC see carers econ cố mops mE 2

CHƯƠNG 2: TONG QUAN TÀI LIỆU 2 22+S22S2S22E£2E£2E£ZE22E22E22E22E222z2Eeze, 3

2.1 Khang stb eee 3

2.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh - 2-2 22222+2EE2EE2E+2EEEEE2EEEEESEEerxrrrrerrres 33,13, Đặc điểm chưng wis KHÔNG BÌHNcssessveeeseesieoeolsttoieLG02208306G81342:.g153001488523u1g00066g0.s90 41.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 2-5: 5

án TỔ lo pee ee re ee ie eee ee 6

2.2.1 Các đặc điểm chung - 2-22 ©2222222S2222221221122122112112211211211211211211211 221211 xe 62.2.9 Kha nine sith các hợp chất tht 0p ce ceseiAc2 BE H140 531001 510060.10.3 06 72.2.3 Tach chiết kháng sinh từ xạ khuẩn - 2-2 ©222222E22E122E251221221122122122222 2e 82.2.4 Xa khuẩn biG ee cecceccccccsceececseseesecseseesesseseceessesecsessesssscssssessesseseesessessseseeeeeeeeees 82.3 Tình hình nghiên cứu trong va ngoai NUGC - +52 eeceeeeeeseaeeeeaeeeees 10

2.3sxÌ\DHIEH GỮU/HOITE HƯỚIỔ bang bstiidianGlS 6618135580 G008335ã938089388gE30S31Cl3AGESE1335HĐ-SSSÿBSQSã038S8DU08Ả8 10

2:3.2.1\ghiÊn:cỨÚu UGC NBO sec? s6cv 5601688 C3943 E8D44100,818046360053010500000015005933519380401430300.355408 11

CHƯƠNG 3: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2-©22222+222+22x2zxszxcee 133.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2¿2+22+222++22E22E22EEEEEEEEEEEErrrrrrrrrre 13EAA/ 800/090) 13

3.2.1 Vật liệu -¿+2222+222225112222111227111122211127T21E2.2T.22rrree 13

3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm 2-2 2+S+S2S£SEEE2E9212123121212121211212121211121211121211 2121 2xe 133.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ - 2-5252 S22222222522125121221211212212112121121121212112111 2122 6 13

52:1: MOM HWDTTĐsneeenedioiidibilisÐEESGIEEIEISBEESSSGEIGSREMESIXS-ISBDEES-JTSE-DGS098820000S83E2EA 13

3.2.1.4 Vi sinh vật sử dụng để kiểm định hoạt tính kháng sinh - -55- 14

3.2.2 PHEOnE phap HEMET (ếHÙosesineseedinnddseostisisgRGGITEEGGIGSIGESHGISGSSEBUEDGIGIGLIUESSS.1000/801035E 14

3.2.2.1 Khảo sát hoạt tinh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn hiém 143.2.2.2 Khảo sát tốc độ lắc và môi trường lên men ảnh hưởng đến quá trình lên mentạo hợp chat thứ cấp của chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng -. 2-52 ©5252+522 15

§3.3.5 Tin viifn: sản gibt Tổn ssc cancion omissions sceaaits l6

3.3 Xử lý số liệu © +2222222221121121121121121121121121121121121121121121121121121121121121 xe 17CHƯƠNG 4: KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 2 22S2+E2E2E2EE2EE2EE2EzEezree 17

4.1 Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng xạ khuẩn hiếm - 2-5254 18

4.2 Khảo sát môi trường lên men tối ưu cho chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng 194.3 Thu nhận hợp chất có khả năng kháng khuẩn va nắm bệnh - - 23CHUONG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ, 2 2+S2+E2E2E2EE2E2E2Ezrrcer 26TÀI LIEU THAM KHẢO -¿-2-S2S22E£SE£EE2E£EEEEE2EEEEEEE2E71EE1211712121171 111.2 xe #7

VI

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Fus : Fusarium oxysporum

Can : Candida albican

Vib : Vibrio parahaemolyticus

Eco : Escherichia coli

Sta : Staphylococcus aureus

LB : Luria Bertani

PDA : Potato dextrose agar

ISP2 : International Streptomyces Project 2 Pm4 : Môi trường lên men

Pm43 : Môi trường lên men

Pm39 : Môi trường lên men

CFU : Colony - forming unit

EA : Ethyl acetate

PE : Petrolium ether

ppm : past per milion (một phan triệu)

rpm : round per minute (vong/phut)

G+C : Guanine + Cytosine

MC : Mycelrum

CF : Culture Filtrate

VI

Vill

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hinh 2.1 Kháng sinh được phát hiện qua các nắm -+©-+++ 4

Hình 3.1 Quy trình chiết địch lên menn 2-2 2 52+S22E£SE£EE2E22E£EE2EEZEzEEzzzzed 17Hình 4.1 Các chủng xạ khuẩn hiếm được hoạt hóa trên môi trường ISP2 18Hình 4.2 Dịch tăng sinh các chủng xạ khuẩn hiếm trong môi trường Gause L 18Hinh 4.3 Bình lên men ở các nghiệm thức khảo sát sau 10 ngày lên men Z1Hình 4.4 Cao chiết sau khi cô quay 2-2 22S22S222E22E2EE2EE22E2EE22E22E 222cc 23Hình 4.5 Biéu đồ biểu dién vòng kháng của các cao chiết sau khi cô quay 24

1X

DANH SÁCH BANG

TrangBảng 2.1 Các nhóm kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học 6Bảng 3.1 Môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ thích hợp cho các VSV kiểm định 14Bang 3.2 Kí hiệu nghiệm thức khảo sát điều kiện lên men chủng xạ khuẩn hiếm 16Bảng 4.1 Bảng phân hạng đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩnhiếm đối với các VSV kiểm định 2-52 +22+S2E12E12E12E1221211221211211211211 21121 xe 19Bảng 4.2 Bảng mô ta đặc điểm dich lên men ở các nghiệm thức khảo sát 19Bang 4.3 Bảng so sánh thành phần các loại môi trường lên men xạ khuẩn hiếm .20Bang 4.4 Bang phân hạng đường kính vòng kháng khuẩn của các nghiệm thức đối với(die VSV Keir 1 t8 1Ẻ 7 22

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nghiên cứu thuốc kháng sinh là một quá trình tất yêu dé chống lại khả năng tan

công của VSV gây bệnh và các bệnh truyền nhiễm đối với sức khỏe con người, cây

trồng và vật nuôi Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật đã có những đóng góp đángkinh ngạc cho quá trình phát hiện và phát triển thuốc kháng sinh trong bảy thập kỉ qua

Các báo cáo của Waksman về Streptothricin (1942) và Streptomycin (1943)

(Najafpour, 2007) đã giới thiệu xạ khuẩn là nguồn sản xuất kháng sinh quan trọng Xakhuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, có khuẩn lạc khô và phần lớn có dạng hình phóng xạ(actino) nhưng khuẩn thẻ lại là dạng sợi phân nhánh (myces) Xạ khuẩn thuộc nhóm vikhuẩn gram dương và phân bồ rộng rãi trong đất Xa khuẩn có tần suất phân lập bangcác phương pháp thông thường nhanh, sinh trưởng nhanh (4-7 ngày) Vào cuối thé ky

20, một số sản phẩm tự nhiên của xạ khuẩn đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vựclâm sàng như chất kháng khuẩn, kháng nam, chống ký sinh trùng và chống ung thư

Và xạ khuẩn trở thành nhà sản xuất kháng sinh tự nhiên chính với con số hơn 80% cácchất kháng sinh được tạo ra Tuy nhiên, khả năng tìm thấy các chất kháng sinh mới từcác xạ khuẩn đã giảm đi đáng kể, cơ hội tìm được những chất kháng sinh mới từStreptomyces ngày càng ít Mặt khác, sự xuất hiện của các bệnh truyền nhiễm mới vatình trạng kháng kháng sinh gây ra trong các bệnh truyền nhiễm trước đó đã làm tăngnhu cầu về kháng sinh mới

Trong bối cảnh đó xạ khuẩn hiếm hiện cũng đang được phân lập từ các môitrường khác nhau và được nghiên cứu chuyên sâu dé tìm ra tiềm năng cho các chươngtrình khám phá kháng sinh Xa khuẩn hiếm thường khó phân lập, khó bảo quản và sinhtrường chậm (3 tuần) Trong số hơn 8000 sản phẩm kháng sinh được mô tả trong cơ sở

dữ liệu ABK, 16% sản pham được sản xuất bởi các chủng thuộc các giống xạ khuẩnquý hiếm Xa khuẩn hiếm được xem như nhà sản xuất hợp chất độc đáo và đa dạng.Đôi khi tạo ra các hợp chất phức tạp thể hiện khả năng kháng khuẩn tuyệt vời vàthường có độc tính thấp (Bérdy, 2004) Xạ khuẩn hiếm trở thành cơ hội có triển vọngtrong việc làm đa dạng nguồn dược liệu Hơn nữa, kiến thức về môi trường sống, sinh

lý học và sự đa dạng chất chuyền hóa thứ cấp của khuẩn hiếm đang

dần dần tăng lên (Tiwari va Gupta, 2011) Do đó đề tài được thực hiện nhằm thu nhậnmột số hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng, góp phan tìm ra các nguồn dược phẩm từ

xạ khuẩn hiếm

1.2 Mục tiêu đề tài

Thu nhận các hợp chất có khả năng kháng khuân và kháng nắm gây bệnh trên

con người, thực vật và động vật.

1.3 Nội dung thực hiện

Khao sát hoạt tinh kháng vi sinh vat của một số chủng xạ khuẩn hiếm

Khảo sát môi trường lên men tối ưu cho chủng được chọn

Thu nhận hợp chất có khả năng kháng khuẩn và nắm bệnh

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Khang sinh

2.1.1 Khai niém

Theo dinh nghia truyén théng thi khang sinh (antibiotic) con duge goi 1a tru sinh,

là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩnmột cách đặc hiệu Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ Hy Lạp: “anti” là kháng lại,

“bios” là sự sống Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị tri

quan trọng của vi khuẩn hay một phan ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn

Theo định nghĩa hiện nay, kháng sinh được hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vậtsinh ra và ở nồng độ thấp xạ khuẩn có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt (các)

vi sinh vật khác (Nduka, 2007) Hiện nay các chất có hoạt tính sinh học có khả năngdiệt khuẩn gồm các chất kháng sinh truyền thống, các sản phẩm trao đổi chất như các

acid lactic do các vi khuẩn lactic sinh ra, các chất phân giải như lysozyme, các loại

ngoại độc tố có bản chất protein, các bacteriocin Cac “vũ khí sinh học” này được quantâm đặc biệt do tính đa dạng và cả do chúng có nhiều trong tự nhiên (Margaret vàMilind, 2007) Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khảnăng kháng vi khuẩn, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư, có vai trò vô cùng quantrọng trong các cuộc giải phẫu mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng lên một nhóm

vi sinh vật nhất định

2.1.2 Lịch sử phát triển kháng sinh

Việc sử dụng các chất kháng sinh bắt nguồn từ rất sớm khi khám phá ra các chấtchống vi trùng Kể từ năm 2500 trước Công nguyên, người Trung Quốc đã sử dụngnhiều loại thảo mộc truyền thống để chữa vết thương và nhiễm trùng (Petrovska,2012) Nghiên cứu kháng sinh hiện dai trong thé kỷ 17 đến thé ky 20 đã dẫn đến hiểubiết tốt hơn về sự hiện điện của các chất kháng khuẩn Năm 1877, Louis Paster lần đầutiên phát hiện ra đặc tính của các hợp chất kháng khuẩn với khả năng ức chế bệnh than

do vi khuẩn hoại sinh Sau đó, Fleming đã thảo luận chi tiết về phan ứng kháng sinhvào năm 1928 Fleming đã quan sát thấy rằng sự phát triển của S aureus trong đĩapetri bị ức chế bởi các chất do nam Penicillium chrysogenum tạo ra, dan đến việc pháthiện ra loại kháng sinh đầu tiên, penicillin (Aminov, 2017)

Trong những thế kỷ tiếp theo, việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn khác

nhau như sulphonamide, aminoglycoside, tetracycline, lipopeptide, oxazolidinones,

glycopeptide, streptogramin va quinolone đã mở ra kỷ nguyên vàng của thuốc khángsinh Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được xácđịnh hầu hết từ xạ khuẩn (Hình 2.1)

Mitomycin

Novobiocin

Amphotericn Vancomycin

Neomycin Cephalosporin

Virginiamycin Chlortetracycline Gentamicin

Candicidin Monensin

Chloramphenicol Tylosin Adriamycin Spiramycin Pristinamycin Teicoplanin Bacitradin Tetracycline Avoparcin

Erythromycin Kasugamycin Thienamycin Streptomycin Oleandomycin Fosfomycn Lovastatin

Streptothricin Griseofulvin Polyoxin Rapamycin

Actinomycin Rifamycin Cyclosporin Avermectin Spinosyn

Penicillin Oxytetracycline Bleomycin Bialaphos Nikkomycin £pothilone

Gramicidin Nystatin Kanamycin Lincomycin Tacrolimus

1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

Hình 2.1 Khang sinh được phát hiện qua các nam (Hopwood, 2007).

Vào những năm 1993-2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên, sựxuất hiện của các vi khuẩn đa kháng thuốc và thiếu hụt nguồn kháng sinh mới, conngười đối mặt với “ thời kì hậu kháng sinh” (Levy và ctv, 1992; Levy và ctv, 1998)

Và ngày nay, tình trạng “siêu vi khuẩn” đang xảy ra với tốc độ nhanh hơn tốc độ tạo ra

thuốc mới của con người Chính vì thế, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp khángsinh là thúc đây nghiên cứu và phát triển để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơchế mới

2.1.3 Đặc điểm chung của kháng sinh

Chất kháng sinh là đo vi sinh vật sinh ra nên có đặc tính trước hết là chống vikhuẩn Trong điều kiện tối ưu, thì các chủng vi sinh vật sẽ tích lũy chất kháng sinh làcực đại, do đó, khi sản xuất kháng sinh ở quy mô công nghiệp, muốn tạo ra nhiều sảnphẩm thì phải tạo môi trường tối ưu

Chat kháng sinh rat đa dạng về thành phan hóa học, có thé cầu tạo mạch vòng, divòng, vòng thơm, có thể là acid, kiềm hay polypeptide Nghiên cứu bản chất hóa học

của chất kháng sinh giúp hiểu được cơ chế tác dụng của chất kháng sinh, biết được conđường sinh tổng hợp Bên cạnh đó, các chất kháng sinh khác nhau có tính chất vật lýkhác nhau như độ hòa tan dung môi, khả năng bền vững với acid, kiềm, nhiệt độ.Nghiên cứu những tính chất này có ý nghĩa trong việc xác định được các phương pháptách chiết, cô đặc, tinh sạch các chất kháng sinh.

Cơ chế tác động của kháng sinh là những cách thức mà chất kháng sinh tác độnglên các vị trí đích khác nhau trong tế bào qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi

sinh vật Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học và nồng

độ của chất kháng sinh (Bùi Thị Việt Hà, 2006)

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển va khả năng tổng

hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt ở 28°C — 30°C, nhiệt

độ tối ưu cho tong hợp chat kháng sinh nằm trong khoảng 18°C — 30°C

pH môi trường: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất lớn vào pH môitrường Sự thay đổi của pH ảnh hưởng đến sự hiện diện của chất kháng khuẩn ở ngoài

dịch lỏng và trong sinh khối của tế bào

Độ thông khí: xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu cầu thông khí cao hơn sovới sinh vật khác nhất là trong giai đoạn nhân giống (khoảng từ thời gian thứ 6 - 12của quá trình nuôi cay) Do đó yếu tô thông khí có ảnh hưởng quyết định đến sinh tổnghợp chất kháng sinh

Tuôi giống: khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh còn phụ thuộc vào tuổi

sinh lý và chất lượng bào tử của xạ khuẩn Tuôi của xạ khuẩn cho hiệu suất cao nhất là

24 giờ Lượng giống cấy truyền khoảng 2 - 10%

Nguồn cacbon: cacbon là nguyên tố có mặt ở hầu hết các chat trong cơ thé xạkhuẩn cũng như trong các sản phẩm trao đối chat, do vậy các hợp chất cacbon có ýnghĩa hang đầu trong sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh Đối với xạ khuannguồn cacbon thích hợp nhất thường là tinh bột, ngoài ra còn sử dụng các loại đường

như : glucose, fructose, maltose và các loại đường rượu.

Nguồn nito: nito là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được trong quá trìnhsinh trưởng và hình thành chất kháng sinh của xạ khuan Nguồn nito hữu co và vô cơthường được cung cấp vào quá trình lên men

Nguồn photpho vô cơ: photpho là yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp chất khángsinh Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, rút ngăn

spha tông hợp và kéo dài pha dinh dưỡng

Các nguyên tố vi lượng: là một trong những thành phần không thé thiếu đượctrong môi trường lên men, làm thay đôi đáng ké kha năng tổng hợp chat kháng sinh

của xạ khuân (Trương Thị Minh Hạnh, 2007)

2.1.3 Phan loại kháng sinh

Phân loại kháng sinh dựa vào cơ chế tác động của khang sinh lên vách tế bao, ứcchế tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, ức chế các con đường trao đổi

chất; phân loại dựa trên VSV sản sinh ra loại kháng sinh đó, phân loại dựa trên con

đường sinh tổng hợp Theo Nduka (2007), phân loại dựa trên cấu trúc hóa học củakháng sinh và theo đó khang sinh được chia lam 13 nhóm.

Bảng 2.1 Các nhóm kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học

Xa khuẩn là nhóm vi sinh vật nhân so, phân bó rộng rãi trong tự nhiên, là nhóm

vi sinh vật có vai trò lớn trong sự phân hủy và hình thành các chất hữu cơ trong tựnhiên, tạo độ phì nhiêu cho đất Tên xạ khuẩn —actinomycete- bắt nguồn từ tiếng HyLạp “actys” (tia) và “mykes” (nam) và ban đầu xạ khuẩn được coi là nam nhỏ vì chúngsinh trưởng giống với nam Mạng lưới phân nhánh của thé sợi thường phát triển ở cả

bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất(Ashutosh, 2008) Đa số xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử rất khác nhau về hình dạng và

kích thước Bào tử được hình thành trên sợi khuẩn ty khí sinh chuyên hóa gọi là cuốngsinh bào tử Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có nhiều loại hình dang và kích thước

khác nhau: Thang, luon song, xoan, moc don, moc vong Cuống sinh bào tử của xạ

khuẩn là một trong những đặc điểm rat quan trọng dé phân loại xạ khuẩn Hình dangcủa bào tử xạ khuẩn rất khác nhau, có thể gặp các dạng hình tròn, hình ô van, hình que,hình trụ Trên mỗi cuống sinh bào tử thường mang từ 30 - 100 bào tử có khi nhiềuhơn, hoặc chi mang | - 2 bao tử.

Bề mặt của bào tử xạ khuẩn có dạng trơn nhẫn, xù xi, có vay, có gai, có lông.

Nhìn chung trong cùng một loài, hình dang bảo tử xạ khuẩn tương đối ôn định Vì vậy

có thê xem đây là một trong những đặc điểm quan trọng đề phân loại xạ khuẩn Đây làmột trong những đặc điểm để phân loại

Xa khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (> 55%) trong DNA Xa

khuẩn thường sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nước, bã, xác động

vật, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí trong các cơ chat mà vi khuẩn va nam mốc khôngphát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất vàthảm thực vật Trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn,chiếm 9 - 45% tổng vi sinh vật trong đất (Waksman, 196])

Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường Nhìnchung nhiệt độ ôn hòa 25°C - 30°C, pH trung tính là các điều kiện tối ưu cho xạ khuẩnphát triển Về mặt sinh thái xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoản tựnhiên Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acidtrong đất Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chatliên quan đến lignin bằng cách sinh các enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose vàcác peroxidase ngoại bao.

2.2.2 Khả năng sinh các hợp chất thứ cấp

Xạ khuẩn được quan tâm bởi khả năng sinh ra các hợp chất thứ cấp có tính ứngdụng cao Trong các hợp chất tự nhiên đo vi sinh vật sinh ra như đã công bố trên toànthé giới thì có 45% từ xạ khuẩn, 38% từ nam và 17% từ vi khuan đơn bào (Arnold và

ctv, 2009) Cho đến nay, có hơn 8000 chất kháng sinh được biết đến thì có đến 80%

kháng sinh trên thé giới có nguồn gốc từ xạ khuẩn, 15% trong đó có nguồn gốc từ xạkhuẩn hiếm thuộc các chi như Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes,Streptoverticillium, Amycolatopsis và con lại được sinh ra chủ yếu bởi xa khuẩn thuộc

chi Streptomyces (Miyadoh, 1997) Các hợp chat kháng sinh của xạ khuẩn đã đượcnghiên cứu đặc điểm gồm aminoglycoside, anthracyclin, glycopeptide, B-lactam,macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide, actinomycin va

tetracycline (Goodfellow, 1988) đã được ứng dụng trong thuốc diệt cỏ, thuốc chốngung thư, các chất chống ký sinh trùng

Bên cạnh đó xạ khuẩn còn có khả năng sinh các enzyme thủy phân như cellulase,

protease, lipse, một số acid hữu cơ giúp phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơphức tạp như cellulose, chitin, lignin có tiềm năng lớn trong việc sản xuất enzyme, ứngdụng trong tay trang bột giấy, các chế phẩm sinh học và giúp bảo vệ môi trường

2.2.3 Tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn

Trong quá trình lên men, kháng sinh được xạ khuẩn tông hợp và tiết ra ngoài môitrường hoặc giữ trong sinh khối Tùy vào vị trí cũng như tính chất của kháng sinh để

có phương pháp tách chiết phù hợp Bước đầu tiên dé tách chiết là phải ly tâm hoặc lọc

dé tách riêng hai phan sinh khối và dịch nuôi

Tach chiết kháng sinh từ sinh khối: nguyên tac cơ bản là phải phá vỡ tế bào dégiải phóng các chất kháng sinh Có thể dùng phương pháp cơ học hoặc siêu âm để làm

vỡ tế bào hoặc dùng các chất hóa học dé tạo áp suất thẩm thấu mạnh gây vỡ tế bao.Sau đó sử dụng dung môi thích hợp để chiết rút kháng sinh

Tach chiết kháng sinh từ dịch nuôi: dé tách hiệu qua cần lựa chọn dung môi cótính hòa tan tốt chất kháng sinh dé kéo kháng sinh ra khỏi pha dịch nuôi Sau đó đem

cô quay ở điều kiện chân không, nhiệt độ dưới 60°C dé dung môi bay hơi và thu đượckháng sinh thô Các hợp chất thu ở dịch nuôi được gọi là ngoại bảo

2.2.4 Xa khuẩn hiếm

Xa khuẩn điền hình được chia thành 2 nhóm: Streptomyces và xạ khuẩn hiểm,Streptomyces chiém uu thé trong đất, xạ khuẩn hiếm gồm các chi còn lại, một số đượccông bó, thường sinh trưởng chậm (3 tuần), hình thành khuẩn lạc nhỏ, khó bảo quản va

nuôi cấy Trong nghiên cứu của Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), 128 chủng xa

khuẩn hiếm trong số 424 chủng xạ khuẩn được phân lập ở đảo Cát Bà; 29 chủng xạkhuẩn hiếm được phân lập từ vườn quốc gia Cúc Phương và Ba Bề (Nguyễn Thị Vân

và ctv, 2019); chủng Nonomuraea jabiensis được phân lập từ đất khô can (Camas vàctv, 2013); 23 chủng xa khuẩn thuộc chi Nocardia phân lập từ các mẫu trầm tích ởNhật Ban (Yamamura và ctv, 2003).

Một số chi xạ khuẩn hiếm thường gặp (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Kim NữThảo, 2006):

Chi Rhodococcus: khuân ty cơ chất phân nhánh, các tế bào hình cầu tạo thànhhình que rồi dang sợi, sợi phân nhánh rồi hệ sợi Không có khả năng di động, khônghình thành bào tử và nội bảo tử Catalase dương tính, nhạy cảm với lysozyme, khôngphân hủy casein, cellulose, chitin, elastin hay xylan Khuan lạc có thé san sùi hay trơnnhẫn, có bao tử mau vàng sam, kem, vàng, da cam, đỏ và không mau Có nhiều trongđất và phân gia súc Tỷ lệ mol GC trong DNA là 63% - 72%

Chi Pseudonocardia: khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất sinh bao tử dangchuỗi, sợi phân đoạn, có dạng zich zac Kéo đài sợi bằng cách nảy chồi Các đoạn sợi

có chức năng bào tử, thành có 2 lớp Không có kha năng di động, sinh trưởng nhiềutrong môi trường hữu cơ và tổng hợp

Chi Saccharopolyspora: khuan ty cơ chat phát triển, phân nhánh, đứt đoạn thành

các đoạn dạng que Khuẩn ty khí sinh phân đoạn tạo các chuỗi bào tử Không nhuộmkháng acid Khuẩn lạc mỏng thô, hơi nhăn, sợi khí sinh ít tạo thành chùm Có khảnăng phân giải adenine, kháng nhiều loại kháng sinh, nhạy cảm với lysozym Tỷ lệmol GC 77% trong DNA.

Chi Micromonospora: hệ sợi phát triển mạnh, phân nhánh đường kính trung bình0,5 um Bao tử không có khả năng di động, không có khuẩn ty khí sinh, không nhuộn

kháng acid, nhạy cảm với pH dưới 6 Tỷ lệ mol GC là 71% - 73% trong DNA Đại

diện: Micromonospora echinospora

Chi Microbispora: khuan ty phan nhanh, bao tt hinh thanh timg cap gan chat voinhau, bao tử mọc trực tiếp hoặc trên cuống sinh bao tử, hình oval, đường kính trungbình 1,2 -1,6 ym, bào tử không có khả năng di động Hầu hết chúng đều cần vitamin B

để sống và trong tự nhiên thì tồn tại trong dầu Tỷ lệ mol GC là 71% - 73% trong

DNA.

Chi Actinopolyspora: hệ sợi phân nhánh, sợi khí sinh phát triển nhiều, có đường

kính khoảng 1 ym, không đứt đoạn Cuéng sinh bao tử chứa các bao tử dang que ngắn

hay cầu, có khoảng 20 bào tử hoặc đơn Sợi cơ chất không sinh bào tử Tỷ lệ mol GCtrong DNA là 64,2%.

Chi Streptosporangium: khuân ty khí sinh có túi bào tử hình cầu khoảng 10 um,các bao tử hình thành vách ngăn trong túi Bào tử hình cầu, oval hay hình que, không

có kha năng di động Tỷ lệ mol GC trong DNA là 69% - 71%.

Chi Nocardioides: hình thành sợi nam phát triển tốt Soi nam sơ cấp cho thay sợinam phân nhánh nhiều phát triển trên bề mặt và thâm nhập vào môi trường thạch Soikhí sinh ít, phân nhánh hoặc không, sau đó đứt đoạn tạo thành những mẫu ngắn hoặcque, những mẫu này tạo nên những sợi mới Bào tử không di động khuẩn lạc ướt,nhão Catalase dương tính hiếu khí bắt buộc Có nhiều trong đất Tỷ lệ mol GC trong

DNA là 66,1% - 72,7% (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Kim Nữ Thao, 2006) Đại diện

Nocardioides luteus.

2.3 Tinh hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.3.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam xạ khuẩn hiém cũng được quan tâm khá nhiều, thường tập trung vảokhả năng sinh kháng sinh chống lại các vi sinh vật gây bệnh, một số nghiên cứu như:khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi Micromonospora (Biền Văn Minh, 2003).Nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng sinh kháng sinh và kháng dòng ung thư từ xạkhuẩn, kết quả thu được có 7 chủng xạ khuẩn hiếm Nonomuraea có khả năng khang

mạnh (Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, 2011).

Nghiên cứu đặc điểm kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces sp chốngStaphylococcus aureus nhờn kháng sinh , kết quả cho thay kháng sinh nghiên cứukháng cả vi khuẩn gram âm và gram dương, nhưng không biểu hiện hoạt tính khángđối với các loại nắm (Dương Minh Lam và ctv, 2013) Trong khảo sát khả năng đối

kháng với 4 loại nam gây bệnh trên thực vat của các dòng xa khuẩn phân lập được từ

vườn quốc gia Cúc Phương và Ba Bề thu được 29/70 chủng xạ khuẩn hiếm (41,4%),sau khi khảo sát kháng khuẩn cho thấy 80,5% chủng thuộc chi Streptomyces va 31%

số chủng hiếm có hoạt tính kháng ít nhất 1 trong 4 chủng nam gây bệnh cho thấy tiềmnăng ứng dụng của các chủng xạ khuẩn của Việt Nam trong lĩnh vực bảo vệ thực vật

VSV kiểm định và được thử độ tương đồng trên 99% với trình tự rRNA 16S trên cơ sở

dữ liệu GeneBank, 2/3 chủng đó thuộc chi Salinispora (Thanh Hoa va ctv, 2020).

Trong khuôn khổ hợp tác giữa viện Hóa Sinh biển và Trường Đại học Illinois ở

Chicago (UIC) về tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn xạ khuẩnthuộc các vùng ven biển ở Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra 2 hợp chấtmới từ một chủng xạ khuẩn Micronomospora sp có nguồn gốc từ vùng biển Cát Bà,Việt Nam Cả hai hợp chất đều có khả năng ức chế tế bào ung thư vú Cũng trongnghiên cứu này, từ dịch nuôi cấy nhóm nghiên cứu đã phân lập và xác định được 10hợp chất, trong đó có 2 hợp chất thê hiện hoạt tính kháng với 7 vi sinh vật kiểm định,trong đó có 3 chủng vi khuẩn gram âm, 3 vi khuẩn gram đương và 1 chủng nam

2.3.2 Nghiên cứu nước ngoài

Năm 1985, Omura đã phân lập chủng xạ khuẩn hiếm Micromonospora

echinospora, phát hiện chủng này sản xuất ít nhất 5 loại kháng sinh có liên quan,

clostomicin, hoạt động chống lại vi khuẩn gram đương bao gồm cả vi khuẩn ky khí

Từ tính chất lý hóa, một trong các thành phần này được xác định là lipiarmycin và một

số khác được xác định là kháng sinh mới

Một loại kháng sinh chống ung thư mới, sandramycin, đã được phân lập từ môitrường nuôi cấy Nocardioides sp (ATCC 39419) và được tinh chế bằng phân vùngdung môi và sắc kí cột Sandramycin, một depsipeptide mới, có hoạt tính vừa phải invitro chống lại các vi khuẩn Gram dương và in vivo chống lại bệnh bạch cầu P388 ởchuột (Matson và Bush, 1989).

Lên men và phân lập C 70-Deacetylase dé sản xuất 70-Deacet ylbaccatin Ill từ

Baccatin 11 Ching Nocardia được sử dung dé nghiên cứu về 0-Deacetylbaccatin III

(10 DAB), một tiền chất quan trọng dé bán tổng hợp paclitaxel (thuốc chống ung thư),được tăng cường trong chiết xuất thủy tùng sử dụng men C10-deacetylase và C13-

deacylase C10-deacetylase là một enzyme nội bào được sản xuất bởi quá trình lên

men của vi sinh vật đất, Nocardioides luteus (SC 13912) (Nanduri va ctv, 1995)

Echinosporamicin, một kháng sinh mới có chứa hệ thống đa vòng thơm và

piperrazinone, được phan lập từ dịch lên men của một chủng mới của phân loại

Micromonospora echinospora Một trong các hợp chất thu nhận được thé hiện hoạttính kháng mạnh chống lại các chủng Staphylococci kháng methicillin va Enterococci

11

khang vancomycin Các este metyl, etyl và benzyl cho thấy cải thiện hoạt động khángkhuẩn chống lại Steptococel (Haiyin va ctv, 2004)

Nam 2003, Yamamura đã phân lập được 25 chủng xạ khuẩn từ 6 mau trầm tíchlây từ hồ Suwa, tỉnh Nagano và từ hào bao quanh đền Takeda, tỉnh Yamanashi, NhậtBản 23/25 chủng được xác định thuộc chi Nocardia là N.asteroides, N.carnea,

N flavorosea, N.nova, N.uniformis Các vector con thoi Nocardia - E.coli thực té cũng

duoc phat trién gan đây, tao thuận lợi cho các nghiên cứu về sinh học phân tử của

Nocardia (Chiba và ctv, 2007).

Nghiên cứu sản xuất Actinomycin của Nocardioides luteus, khám pha được hoạtđộng kháng khuẩn của của chủng xạ khuẩn phân lập được tại một địa phương ở AiCập 127 xạ khuẩn làm thuần được phân lập từ những viên đá của ngôi mộ của TellBasta Chung xạ khuan này được cho là có tiềm năng trong việc kháng vi khuẩn nam

và VSV, được khang định là Nocardioides luteus Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn ởrộng kế hoạch dé kiểm tra hoạt động chống khối u của chiết xuất được sản xuất bởiNocardioides luteus Cho thay hoạt động chống ung thu đáng kể chống lại các dòng tế

bào ung thư của con người đã được thử nghiệm vượt qua hoạt động của doxorubicin

trong hau hết các trường hop

Từ xạ khuẩn hiểm Amycolaptopsis sp một hợp chất mới có tên là dipyrimicin B,tuy nhiên thì việc thé hiện hoạt tính kháng lại khá yêu đối vi khuẩn và gây độc tế bảo

Li và cvt đã phân lập được hai sesquiterpene loại acid abscisic mới và một ansamycinmới, cùng với 4 ansamycin đã biết từ Amycolatopsis alba DSM 44262 Tuy nhiên, tat

cả các hợp chất này đều không cho thấy sự ức chế vi khuẩn rõ rệt

Năm 2017, trong một công bố mới của William và ctv về các macrolides mớiđược phân lập từ cặn EtOAc của dịch nuôi cấy chủng Micromonospora sp từ mộttram tích biển vùng Đông Bắc Thái Bình Duong bao gồm rifamycins và sporalactam

A và B Đối với sporalactam B có kháng mạnh với Mycobacterium tuberculosis

Năm 2018, từ cặn chiết aceton của chủng xạ khuan Micromonospora sp đượcphân lập từ trầm tích biển ở Canada, Bonilla và ctv phân lập được 2 chất mớiphocoenamicin B và C Các chất này có hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureuskháng lại methicilin, Mycobacterium tuberculosis và Mycobacterium bovis.

12

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2023 đến tháng 8/2023, tại RIBE 212, Viện

nghiên cứu Công nghệ Sinh Học và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm, Tp.HCM.

3.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.1 Vật liệu

3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm

Các chủng xạ khuẩn hiếm: Micromonospora echinospora (C1), Nocardioides

luteus (V1) va Amycolaptosis alba (A1) được lưu trữ tại phòng Vi Sinh Ứng dụng của

Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại hoc Nông LâmThành phố Hồ Chí Minh (kế thừa kết quả của năm 2022)

3.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ cấy vi sinh vô trùng, nồi hấp khử trùng autoclave, máy ly tâm, cânđiện tử, tủ lắc, tủ sấy, máy đo pH, microwave, máy cô quay, máy vortex, máy cô quay,con lắc từ

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, đèn côn, các loại que cấy, micropipette, các loại

đầu ống tip, cốc thủy tinh, erlen, ng dong, túi nilon, bút ghi mẫu, cốc thủy tinh, falcon

và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm

3.2.1.3 Môi trường

Trace element mix 1 (dung dịch stock khoáng để bổ sung vào môi trường lên

men): 4 g CaCl2.2H20, 2 g ZnSO4.7H20, 0,1 g NazBaO;.10H2O, 5 g FeSO4.7H20, 0,5

g KI, 0,5 g CoCl.6H20, 0,2 g CuSO4.5H20, 2 g MnCh.4H20, 0,05 g Na;MoOx.2H›O,

PM39: 10 g Tinh bột tan, 10 g glucose, 7,5 g cao malt, 3 g pepton, 1 g NaCl, 1 g MgSO4.7H20, 7 mg CuSO4.5H20, 1 mg FeSO4.7H20, 8 mg MnCl.4H2O, 2 mg ZnSOx.7HaO, 1000 mL H20, pH = 7.

Gause I: 20 g soluble Starch, 1 g KNOs, 0,5 g NaCl, 0,5 g K;HPOa, 0,5 g MgSO¿, 0,01 g FeSO¿, 1000 mL H20, pH = 7,2.

ISP2: 4 g cao nam men, 10 g cao malt, 4 g glucose, 1000 mL H20, 25 g agar,pH=7,2.

LB: 10 g pepton, 5 g cao nam men, 5 g NaCl, 1000 mL H20, pH = 7,2

PDA: 200 g khoai tay, 20 g dextrose, 20 g agar, 1000 mL H20

3.2.1.4 Vi sinh vật sử dung dé kiểm định hoạt tính kháng sinh

Bay chủng vi sinh vật kiểm định Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Vibrioparahaemolyticus, Neoscytalidium dimiatum, Candida albican, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus dùng làm đôi tượng kiêm định trong nghiên cứu dé sàng lọc

hoạt tính kháng khuẩn nhằm chọn ra chủng xạ khuẩn hiếm thé hiện hoạt tinh kháng tốtnhất và môi trường lên men tối ưu nhất Các chủng vi sinh vat kiểm định này được lưutrữ tại phòng Vi Sinh Ung dụng của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môitrường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Khảo sát hoạt tinh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn hiếm

Bang 3.1 Môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ thích hợp cho các vi sinh vật kiểm định

VSV kiêm định Tên môi trường Nhiệt độ

Phytophthora sp PDA 37C

Fusarium oxysporum PDA 37°C

Candida albicans PDA 37°C

Neoscytalidium dimiatum PDA 37°C

14

Đối với nam bệnh, tiến hành hút ImL nước cất được hấp tiệt trùng vàoeppendorf, dùng que cấy lay tơ nam cho vao eppendorf rồi vortex Hút 25 HL dịch nam

sau khi vortex xong trải đều trên đĩa thạch PDA

Ching xạ khuẩn được hoạt hóa trên đĩa môi trường ISP2 ở 30°C trong 4-7 ngày.Sau đó, xạ khuan hiếm được nuôi cấy trong môi trường Gause I ở 30 °C trong 3 ngày

có lắc với tốc độ 100 rpm Sau thời gian nuôi cấy, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 6000rpm trong 15 phút.

Các giếng nhỏ được đục trên các đĩa thạch rắn trước đó vừa được cấy vi sinh vậtkiểm định Nhỏ khoảng 50 UL dich nuôi cay đã được ly tâm vào các giếng va nuôitrong 2 ngày trong các điều kiện thích hợp với vi sinh vật kiểm định Hoạt tính khángsinh được đánh giá thông qua các vòng kìm hãm được tạo thành quanh giếng Các thínghiệm được lặp đi lặp lại 3 lần (Alex và Hai, 2006)

Vòng kìm hãm VSV được tinh bằng mm theo công thức:

Kích thước vòng kìm hãm = D - d

Trong đó: D (mm) là đường kính vòng kìm hãm; d (mm) là đường kính của giếngĐánh giá vòng kháng khuẩn được chia làm 4 mức độ :

Không kháng: đường kính vòng kháng = 0

Kháng yếu: đường kính vòng kháng khuẩn D <5 mm

Kháng trung bình : đường kính vòng kháng khuẩn 5 mm <= D <= 10 mmKháng mạnh: đường kính vòng kháng khuẩn D > 10 mm

3.2.2.2 Khảo sát tốc độ lắc và môi trường lên men ảnh hưởng đến quá trình lênmen tạo hợp chất thứ cấp của chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng

Mục đích: chọn lọc được môi trường lên men và điều kiện lắc tối ưu nhất choviệc tạo hợp chất thứ cấp

Quá trình lên men xạ khuẩn chịu tác động của các yếu tố về môi trường, nhiệt

độ, độ thoáng khí Trong nghiên cứu này sẽ tập trung khảo sát ảnh hưởng của môi

trường và tốc độ lắc đến khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn và kháng nắm từchủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí nên cần độ thoáng khí thích hợp để quátrình sinh trưởng và tạo hợp chất thứ cấp tốt nhất Khi tốc độ lắc thay đổi dẫn đến sựkhuếch tán oxi vào môi trường nuôi thay đổi Do đó tiến hành khảo sát tốc độ lắc déchọn ra điều kiện thoáng khí phù hợp cho lên men chủng xạ khuẩn

15

Thí nghiệm được bố trí để khảo sát đồng thời 2 yếu tốc môi trường và tốc độ lắc.Với 3 môi trường (Pm4, Pm43, Pm39) và 2 tốc độ lắc (120 rpm, 150 rpm), sẽ có 6

nghiệm thức (Bảng 3.2) Thời gian thu mẫu là 10 ngày.

Tiêu chí để chọn điều kiện thích hợp là dựa vào hoạt tính sinh học

Bang 3.2 Kí hiệu nghiệm thức khảo sát điều kiện lên men chủng xạ khuẩn hiếm

Môi trường Tốc độ lắc (rpm) Tên thí nghiệm

Pm4 120 Pm4 120

150 Pm4 150 Pm43 120 Pm43 120

Khao sát hoạt tính sinh học như mục 3.2.2.1.

3.2.2.3 Thu nhận sản phẩm lên men

Sau khi thu dịch lên men, tiến hành tách chiết theo quy trình (Hình 3.1) của trungtâm Nghiên cứu Hợp chất Tự nhiên có hoạt tính sinh học Dịch lên men sẽ được ly tâm

dé tách phan sinh khối (Mycalium-MC) và dịch lên men (Culture filtrare-CF)

Thêm dung môi methanol vào phần sinh khối, phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âmtrong 5 phút, rồi cho khuấy từ qua đêm Tiếp đến ly tâm loại cặn, thu dịch Dịch thu

được là pha MC-Methanol được loại bỏ cặn bằng cách lắc với hệ dung môi petroliumether (PE) và nước Sau tách thu được 2 pha là pha tan trong petrolium ether (PE) va

pha tan trong methanol Dem cô quay đuôi hết dung môi ta được 2 cao chiết là MC-PE

và MC-Methanol.

16

Phan dịch lên men được lắc với dung môi ethyle acetate (EA) Khi đó sẽ thuđược 2 pha là pha tan trong nước và pha tan trong etyle acetate Tiến hành cô quay tađược 2 cao chiết CF - EA và CF - Nước.

Khao sát lại hoạt tính sinh học như mục 3.2.2.1 với các cao thu được

Dịch lên men a

Sinh khối Dịch lỏng

Bỏ cặn Pha MC-Methanol Pha CF-W Pha CF-EA

Cao chiết CF-EAPha MC-PE Pha MC-Methanol

| |

Cao chiết MC-PE Cao chiết MC-Methanol

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất địch lên men

3.3 Xử lý số liệu

Các số liệu thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ tính các giá trị trung bình va

vẽ biéu đồ bằng phần mềm Excel 2016, phân tích ANOVA một yếu tố các chỉ tiêutheo dõi bằng phần mềm Minitab 16

17

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Khao sát hoạt tính sinh hoc của các chủng xa khuẩn hiếm

4.1.1 Hoạt hóa

Các chủng xạ khuẩn hiếm được hoạt hóa trên môi trường ISP2 Sau 7 ngay tạo

ra các khuẩn lạc đơn đặc trưng Đĩa hoạt hóa thuần không bị tạp nhiễm

Hình 4.1 Các chủng xạ khuẩn hiểm được hoạt hóa trên môi trường ISP2

1 Chung xạ khuan hiếm VI; 2 Chung xạ khuẩn C1; 3 Chung xạ khuân AI.

4.1.2 Tăng sinh

Sau khi hoạt hóa các chủng, lấy khuẩn lạc đặc trưng cho vào bình chứa Gause I,lắc ở tốc độ 120 rpm Sau 3 ngày, nhận thấy dịch tăng sinh lần lượt có màu cam nhẹ,sinh khối mịn (C1), màu vàng, sinh khối mịn (VI) và trắng đục, sinh khối mịn (A1).Mục đích của việc tăng sinh là giúp xạ khuẩn tăng sinh tốt Vì thé khi chuyển sang môitrường lên men thì sẽ phát triển nhanh Nhờ đó tạo điều kiện cho việc sinh ra các hợpchất thứ cấp

18