3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 3/2023 đến tháng 8/2023, tại RIBE 212, Viện
nghiên cứu Công nghệ Sinh Học và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm, Tp.HCM.
3.2. Vật liệu và phương pháp 3.2.1. Vật liệu
3.2.1.1 Mẫu thí nghiệm
Các chủng xạ khuẩn hiếm: Micromonospora echinospora (C1), Nocardioides luteus (V1) va Amycolaptosis alba (A1) được lưu trữ tại phòng Vi Sinh Ứng dụng của
Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại hoc Nông Lâm
Thành phố Hồ Chí Minh (kế thừa kết quả của năm 2022).
3.2.1.2 Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: tủ cấy vi sinh vô trùng, nồi hấp khử trùng autoclave, máy ly tâm, cân điện tử, tủ lắc, tủ sấy, máy đo pH, microwave, máy cô quay, máy vortex, máy cô quay, con lắc từ.
Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, đèn côn, các loại que cấy, micropipette, các loại đầu ống tip, cốc thủy tinh, erlen, ng dong, túi nilon, bút ghi mẫu, cốc thủy tinh, falcon và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm.
3.2.1.3 Môi trường
Trace element mix 1 (dung dịch stock khoáng để bổ sung vào môi trường lên
men): 4 g CaCl2.2H20, 2 g ZnSO4.7H20, 0,1 g NazBaO;.10H2O, 5 g FeSO4.7H20, 0,5 g KI, 0,5 g CoCl.6H20, 0,2 g CuSO4.5H20, 2 g MnCh.4H20, 0,05 g Na;MoOx.2H›O,
1 ml H2SO,4 95-97%, 1000 mL H20.
PM4: 20 g D-manitol, 20 g bột đậu nành, 0,25 mL Trace element mix 1, 1000 mL H20, pH = 6,2.
PM43: 20 g Glucose, 2 g cao malt, 2 g cao nắm men, 0,2 g KH:O¿, 0,4 g
K2HPOs,, 0,2 g MgSO¿, 0,05 g NaCl, 0,05 g CaCl2.6H20, 1 mL Trace element mix 1, 1000 mL HO, pH = 6,3.
13
PM39: 10 g Tinh bột tan, 10 g glucose, 7,5 g cao malt, 3 g pepton, 1 g NaCl, 1 g MgSO4.7H20, 7 mg CuSO4.5H20, 1 mg FeSO4.7H20, 8 mg MnCl.4H2O, 2 mg ZnSOx.7HaO, 1000 mL H20, pH = 7.
Gause I: 20 g soluble Starch, 1 g KNOs, 0,5 g NaCl, 0,5 g K;HPOa, 0,5 g MgSO¿, 0,01 g FeSO¿, 1000 mL H20, pH = 7,2.
ISP2: 4 g cao nam men, 10 g cao malt, 4 g glucose, 1000 mL H20, 25 g agar,
pH=7,2.
LB: 10 g pepton, 5 g cao nam men, 5 g NaCl, 1000 mL H20, pH = 7,2.
PDA: 200 g khoai tay, 20 g dextrose, 20 g agar, 1000 mL H20
3.2.1.4. Vi sinh vật sử dung dé kiểm định hoạt tính kháng sinh
Bay chủng vi sinh vật kiểm định Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, Vibrio
parahaemolyticus, Neoscytalidium dimiatum, Candida albican, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus dùng làm đôi tượng kiêm định trong nghiên cứu dé sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn nhằm chọn ra chủng xạ khuẩn hiếm thé hiện hoạt tinh kháng tốt nhất và môi trường lên men tối ưu nhất. Các chủng vi sinh vat kiểm định này được lưu trữ tại phòng Vi Sinh Ung dụng của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phó Hồ Chí Minh.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Khảo sát hoạt tinh kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn hiếm
Bang 3.1. Môi trường dinh dưỡng và nhiệt độ thích hợp cho các vi sinh vật kiểm định VSV kiêm định Tên môi trường Nhiệt độ
Phytophthora sp. PDA 37C Fusarium oxysporum PDA 37°C Candida albicans PDA 37°C Neoscytalidium dimiatum PDA 37°C Vibrio parahaemolyticus LB 37°C Escherichia coli LB 37°C Staphylococcus aureus LB 37C
Cách tiến hành: đối với vi khuẩn, chuẩn bị dich vi khuẩn : vi khuẩn được tiến hành hoạt hóa trong môi trường LB và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ. Tiến hành tăng sinh trong môi trường LB lỏng được điều chỉnh sao cho mật độ 108 CFU/mL sau khoảng 48 giờ tăng sinh. Sau đó bơm 100 UL huyền phù vi khuẩn gây bệnh lên các đĩa thạch môi trường LB agar và dùng que cấy trang, trải đều trên bề mặt thạch.
14
Đối với nam bệnh, tiến hành hút ImL nước cất được hấp tiệt trùng vào eppendorf, dùng que cấy lay tơ nam cho vao eppendorf rồi vortex. Hút 25 HL dịch nam sau khi vortex xong trải đều trên đĩa thạch PDA.
Ching xạ khuẩn được hoạt hóa trên đĩa môi trường ISP2 ở 30°C trong 4-7 ngày.
Sau đó, xạ khuan hiếm được nuôi cấy trong môi trường Gause I ở 30 °C trong 3 ngày có lắc với tốc độ 100 rpm. Sau thời gian nuôi cấy, dịch nuôi cấy được ly tâm ở 6000
rpm trong 15 phút.
Các giếng nhỏ được đục trên các đĩa thạch rắn trước đó vừa được cấy vi sinh vật kiểm định. Nhỏ khoảng 50 UL dich nuôi cay đã được ly tâm vào các giếng va nuôi trong 2 ngày trong các điều kiện thích hợp với vi sinh vật kiểm định. Hoạt tính kháng sinh được đánh giá thông qua các vòng kìm hãm được tạo thành quanh giếng. Các thí nghiệm được lặp đi lặp lại 3 lần (Alex và Hai, 2006).
Vòng kìm hãm VSV được tinh bằng mm theo công thức:
Kích thước vòng kìm hãm = D - d
Trong đó: D (mm) là đường kính vòng kìm hãm; d (mm) là đường kính của giếng Đánh giá vòng kháng khuẩn được chia làm 4 mức độ :
Không kháng: đường kính vòng kháng = 0
Kháng yếu: đường kính vòng kháng khuẩn D <5 mm
Kháng trung bình : đường kính vòng kháng khuẩn 5 mm <= D <= 10 mm Kháng mạnh: đường kính vòng kháng khuẩn D > 10 mm.
3.2.2.2. Khảo sát tốc độ lắc và môi trường lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo hợp chất thứ cấp của chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng
Mục đích: chọn lọc được môi trường lên men và điều kiện lắc tối ưu nhất cho việc tạo hợp chất thứ cấp.
Quá trình lên men xạ khuẩn chịu tác động của các yếu tố về môi trường, nhiệt
độ, độ thoáng khí. Trong nghiên cứu này sẽ tập trung khảo sát ảnh hưởng của môi
trường và tốc độ lắc đến khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn và kháng nắm từ chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng.
Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí nên cần độ thoáng khí thích hợp để quá trình sinh trưởng và tạo hợp chất thứ cấp tốt nhất. Khi tốc độ lắc thay đổi dẫn đến sự khuếch tán oxi vào môi trường nuôi thay đổi. Do đó tiến hành khảo sát tốc độ lắc dé chọn ra điều kiện thoáng khí phù hợp cho lên men chủng xạ khuẩn.
15
Thí nghiệm được bố trí để khảo sát đồng thời 2 yếu tốc môi trường và tốc độ lắc.
Với 3 môi trường (Pm4, Pm43, Pm39) và 2 tốc độ lắc (120 rpm, 150 rpm), sẽ có 6 nghiệm thức (Bảng 3.2). Thời gian thu mẫu là 10 ngày.
Tiêu chí để chọn điều kiện thích hợp là dựa vào hoạt tính sinh học.
Bang 3.2. Kí hiệu nghiệm thức khảo sát điều kiện lên men chủng xạ khuẩn hiếm Môi trường Tốc độ lắc (rpm) Tên thí nghiệm
Pm4 120 Pm4 120 150 Pm4 150 Pm43 120 Pm43 120
150 Pm43 150
Pm39 120 Pm39 120 150 Pm39 150
Tăng sinh chủng: ding que cấy vòng lay khuẩn lac đặc trưng cho vào 50 mL môi trường Gause I. Lắc ở 120 rpm và ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày.
Lên men: sau khi tăng sinh, tiến hành khảo sát các điều kiện lên men hợp chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng. Hút 2,5 mL dich tăng sinh vao erlen chứa 50 mL môi trường và được lên men trong điều kiện như Bảng 3.2 ở nhiệt độ phòng. Sau 10 ngày tiến hành thu mẫu.
Khao sát hoạt tính sinh học như mục 3.2.2.1.
3.2.2.3. Thu nhận sản phẩm lên men
Sau khi thu dịch lên men, tiến hành tách chiết theo quy trình (Hình 3.1) của trung tâm Nghiên cứu Hợp chất Tự nhiên có hoạt tính sinh học. Dịch lên men sẽ được ly tâm dé tách phan sinh khối (Mycalium-MC) và dịch lên men (Culture filtrare-CF).
Thêm dung môi methanol vào phần sinh khối, phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm trong 5 phút, rồi cho khuấy từ qua đêm. Tiếp đến ly tâm loại cặn, thu dịch. Dịch thu
được là pha MC-Methanol được loại bỏ cặn bằng cách lắc với hệ dung môi petrolium
ether (PE) và nước. Sau tách thu được 2 pha là pha tan trong petrolium ether (PE) va
pha tan trong methanol. Dem cô quay đuôi hết dung môi ta được 2 cao chiết là MC-PE
và MC-Methanol.
16
Phan dịch lên men được lắc với dung môi ethyle acetate (EA). Khi đó sẽ thu được 2 pha là pha tan trong nước và pha tan trong etyle acetate. Tiến hành cô quay ta được 2 cao chiết CF - EA và CF - Nước.
Khao sát lại hoạt tính sinh học như mục 3.2.2.1 với các cao thu được
Dịch lên men a
Sinh khối Dịch lỏng
Bỏ cặn Pha MC-Methanol Pha CF-W Pha CF-EA
Cao chiết CF-EA Pha MC-PE Pha MC-Methanol
| |
Cao chiết MC-PE Cao chiết MC-Methanol Hình 3.1. Quy trình chiết xuất địch lên men.
3.3. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ. tính các giá trị trung bình va vẽ biéu đồ bằng phần mềm Excel 2016, phân tích ANOVA một yếu tố các chỉ tiêu theo dõi bằng phần mềm Minitab 16.
17